Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid và đánh giá tác dụng sinh học của chế phẩm chiết xuất

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH PHƯƠNG LIÊN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT CITROFLAVONOID VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT LUẬN VĂN THẠC SỸ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC LIỆU - DƯỢC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60 73 10 Người hướng dẫn : Ts Trịnh Thị Điệp Ts Nguyễn Quỳnh Chi HÀ NỘI 2012 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn trân trọng sâu sắc tới TS Trịnh Thị Điệp - Khoa Hóa thực vật – Viện Dược liệu, TS Nguyễn Quỳnh Chi Bộ môn Dược liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phương Thiện Thương – Khoa Hóa phân tích, tập thể cán khoa Hóa Thực Vật - Viện Dược liệu tập thể cán Bộ môn Dược lý – trường Đại học Y Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện giúp tơi hồn thành đề tài Trong q trình học tập, triển khai nghiên cứu đề tài đạt hơm nay, tơi xin cảm ơn cơng lao giảng dạy hướng dẫn thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội Tôi xin bày tỏ niềm xúc động lớn lao trước động viên kịp thời lãnh đạo trường Đại học Y Dược Thái Ngun, Phòng, Khoa, thầy giáo trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Và xin cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp em sinh viên tham gia thực đề tài – Những người bên tôi, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Dù có nhiều cố gắng, song luận văn có thiếu sót Kính mong nhận chia xẻ nhận ý kiến đóng góp q báu thầy giáo, bạn đồng nghiệp Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2012 Học viên Đinh Phương Liên MỤC LỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Thực vật học chi Citrus 1.1.1 Vị trí chi Citrus 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Citrus 1.1.2 Đặc điểm thực vật chi Citrus 1.1.3 Tình hình trồng số loài thuộc chi Citrus Việt Nam 1.2 Nghiên cứu hóa học lồi thuộc chi Citrus 1.2.1 Carotenoid 1.2.2 Tinh dầu 1.2.3 Limonoid 1.2.4 Coumarin 1.2.5 Alcaloid 1.2.6 Flavonoid 1.3 Tác dụng sinh học flavonoid chi Citrus 12 1.3.1 Tác dụng chống oxy hóa 12 1.3.2 Tác dụng giảm mỡ máu 13 1.3.3 Tác dụng chống viêm 13 1.3.4 Tác dụng phòng chống bệnh tim mạch 13 1.3.5 Tác dụng chống ung thư .13 1.4 Các nghiên cứu nước chi Citrus 14 1.5 Các quy trình chiết xuất flavonoid từ vỏ loài thuộc chi Citrus15 1.6 Một số dược phẩm thị trường có hoạt chất citroflavonoid 19 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương tiện nghiên cứu 23 2.2.1 Hóa chất, thuốc thử 23 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu 23 2.2.3 Động vật nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm dược liệu 24 2.3.2 Phương pháp định tính citroflavonoid dược liệu sản phẩm chiết xuất sắc ký lớp mỏng 25 2.3.3 Phương pháp định lượng citroflavonoid quang phổ tử ngoại 25 2.3.4 Phương pháp định lượng citroflavonoid dược liệu sản phẩm chiết xuất sắc ký lỏng hiệu cao 28 2.3.5 Phương pháp khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất citroflavonoid .30 2.3.6 Phương pháp xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 31 2.3.7 Phương pháp thử độc tính cấp .32 2.3.8 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng chế phẩm chiết xuất citroflavonoid lên số lipid máu 33 2.4 Thời gian địa điểm thực nghiên cứu 34 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 35 3.1 Xây dựng quy trình chiết xuất Citroflavonoid 35 3.1.1 Khảo sát hàm lượng citroflavonoid vỏ số loài thuộc chi Citrus .35 3.1.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất citroflavonoid 36 3.1.3 Xây dựng quy trình chiết citroflavonoid khảo sát độ ổn định quy trình 46 3.1.4 Xây dựng tiêu chuẩn cho nguyên liệu sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 48 3.2 Đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm chiết xuất ciroflavonoid 578 3.2.1 Thử độc tính cấp 578 3.2.2 Đánh giá ảnh hưởng chế phẩm chiết xuất citroflavonoid số lipid máu mô bệnh học 589 CHƯƠNG BÀN LUẬN 65 4.1 Về nguồn nguyên liệu dùng chiết xuất citroflavonoid 65 4.2 Về xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ Citrus 66 4.3 Về xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu sản phẩm chiết xuất citroflavonoid 67 4.4 Về thử độc tính cấp chế phẩm citroflavonoid 68 4.5 Về ảnh hưởng chế phẩm chiết xuất citroflavonoid số lipid máu mô bệnh học 69 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 71 Kết luận 71 Đề xuất 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT BuOH : Buthanol C : Citrus CHCl3 : Chloroform CF : Citroflavonoid DL : Dược liệu ĐMC : Động mạch chủ EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol HDL : High density lipoprotein HES : Hesperidin HPLC : Sắc ký lỏng hiệu cao LDL : Low density lipoprotein MeOH : Methanol NAR : Naringin SP : Sản phẩm TB : Trung bình TLC : Sắc ký lớp mỏng TT : Thứ tự TTC : Thể trọng chuột T0P : Nhiệt độ phòng tt/kl : Thể tích/ khối lượng tt/tt : Thể tích/ thể tích DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các mẫu vỏ Citrus dùng khảo sát nguyên liệu để chiết xuất citroflavonoid 21 Bảng 3.1 Kết xác định hàm lượng citroflavonoid mẫu vỏ Citrus 35 Bảng 3.2 Kết khảo sát dung môi chiết xuất 378 Bảng 3.3 Kết khảo sát nhiệt độ chiết xuất 40 Bảng 3.4 Kết khảo sát thời gian chiết xuất 41 Bảng 3.5 Kết khảo sát tỉ lệ dung môi/dược liệu 43 Bảng 3.6 Kết khảo sát kích thước dược liệu 45 Bảng 3.7 Hiệu suất chiết xuất hàm lượng citroflavonoid toàn phần sản phẩm (quy mô 1000g/mẻ) 48 Bảng 3.8 Kết xác định độ ẩm mẫu vỏ quýt 49 Bảng 3.9 Kết xác định tro toàn phần mẫu vỏ quýt 50 Bảng 3.10 Kết xác định độ tro không tan acid clohydric 50 mẫu vỏ quýt 50 Bảng 3.11 Kết xác định tạp chất mẫu vỏ quýt 51 Bảng 3.12 Hàm lượng hesperidin mẫu vỏ quýt 53 Bảng 3.13 Kết xác định độ ẩm mẫu 54 chế phẩm bột citroflavonoid 54 Bảng 3.14 Kết tro toàn phần mẫu chế phẩm bột citroflavonoid 55 Bảng 3.15 Hàm lượng % hesperidin mẫu chế phẩm bột citroflavonoid 567 Bảng 3.16 Kết thử độc tính cấp chế phẩm bột citroflavonoid 58 Bảng 3.17 Kết ảnh hưởng chế phẩm CF lên nồng độ triglycerid 59 Bảng 3.18 Kết ảnh hưởng chế phẩm citroflavonoid lên nồng độ cholesterol toàn phần 60 Bảng 3.19 Kết ảnh hưởng chế phẩm citroflavonoid61 lên nồng độ HDL-cholesterol 61 Bảng 3.20 Kết ảnh hưởng chế phẩm bột CF lên nồng độ LDLcholesterol 62 Bảng 3.21 Kết quan sát đại thể vi thể động mạch chủ 63 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1.Vị trí chi Citrus hệ thống phân loại Takhtajan 1987 .3 Hình 1.2 Cấu trúc flavonoid vỏ loài thuộc chi Citrus Hình 1.3 Flavonoid nhóm flavan loài Citrus glycosid chúng 10 Hình 1.4 Flavonoid nhóm flavon flavonon có vỏ lồi Citrus 11 Hình 1.5 Các nhóm chức đem lại tác dụng chống oxy hóa mạnh cho flavonoid 12 Hình 1.6 Quy trình (I) chiết xuất flavonoid từ dược liệu 16 Hình 1.7 Quy trình (II) chiết xuất flavonoid từ dược liệu 17 Hình 1.8 Quy trình (III) chiết xuất flavonoid từ vỏ bưởi 18 Hình 1.9 Quy trình (VI) chiết xuất flavonoid từ vỏ bưởi 19 Hình 2.1 Vỏ Citrus reticulate Blanco 22 Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC vỏ quýt (Citrus reticulata Blanco.) 52 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC mẫu chứa hesperidin (A) dược liệu vỏ quýt (B) 52 Hình 3.4 Sắc ký đồ TLC sản phẩm bột citroflavonoid 56 ĐẶT VẤN ĐỀ Các thuộc chi Citrus trồng rộng rãi nước ta với mục đích lấy làm cảnh Hiện Việt Nam sử dụng vỏ số loài để làm thuốc theo Y học cổ truyền, y học dân gian [12],[14] nhiên số lượng sử dụng không nhiều nhu cầu thấp Qua công trình nghiên cứu tác giả giới Việt Nam thấy flavonoid chiết xuất từ vỏ lồi thuộc chi Citrus có nhiều tác dụng sinh học tốt [6],[13], [37] Các tác dụng đáng ý tăng trương lực tĩnh mạch, bảo vệ thành mạch, chống vữa xơ động mạch, chống ung thư [7] Các cơng ty dược phẩm có uy tín giới nghiên cứu bào chế thành công sản phẩm thuốc dùng để chữa bệnh rối loạn mạch máu từ nguồn dược liệu Có thể dễ dàng nhận thấy gia đình, hàng quán, khách sạn, công ty chế biến thực phẩm điều sau sử dụng lồi thuộc chi Citrus, vỏ (còn gọi cùi) không giữ lại để sử dụng làm thuốc Rõ ràng lãng phí nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc dồi dào, sẵn có quanh năm, phế phẩm ngành khác (thực phẩm) Tuy có số nghiên cứu Việt Nam việc ứng dụng flavonoid để làm thuốc chữa bệnh, chưa có nghiên cứu cho quy mơ cơng nghiệp chưa thể triển khai cơng nghiệp Trong đó, ngành cơng nghiệp dược phẩm nước Pháp tận dụng vỏ (sau sử dụng cho công nghiệp thực phẩm) để chiết xuất citroflavonoid, sản xuất thuốc điều trị bệnh rối loạn thành mạch hiệu quả, đem nhiều lợi nhuận kinh tế Cơng nghệ hóa dược sản xuất dược phẩm nước ta có phát triển vượt bậc năm qua Chúng ta triển khai quy CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Về nguồn nguyên liệu dùng chiết xuất citroflavonoid Trong phạm vi thực đề tài, tiến hành khảo sát 10 mẫu vỏ Citrus có nguồn gốc nhiều địa phương nước Kết khảo sát hàm lượng citroflavonoid từ 10 mẫu vỏ phần khảo sát nhỏ nằm cơng trình “ Nghiên cứu xây dựng quy trình cơng nghệ chiết xuất citroflavonoid từ vỏ số loài thuộc chi Citrus, họ Rutaceae” Viện Dược liệu (phụ lục7) Trong khuôn khổ đề tài cơng nghệ này, nhóm tác giả tiến hành xác định hàm lượng hesperidin naringin 60 mẫu vỏ loài Citrus thu thập từ địa phương khác nước phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Kết cho thấy naringin thành phần có vỏ bưởi, hesperidin thành phần vỏ loài Citrus khác (cam, quýt, chanh, phật thủ, quất) Hàm lượng hesperidin mẫu cam quýt cao vượt trội so với mẫu vỏ chanh, phật thủ quất Kết khảo sát gợi ý vỏ bưởi, vỏ cam vỏ quýt nguồn nguyên liệu sử dụng cho chiết xuất citroflavonoid để làm thuốc chữa bệnh Đề tài thực xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ qt (Citrus reticulata Blanco.) có thành phần hesperidin Cần có nghiên cứu để xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid với thành phần naringin (có nhiều vỏ bưởi) Mặc dù thực tế lồi thuộc chi Citrus có bán nhiều thị trường sản lượng vỏ dư thừa để sản xuất quy mơ cơng nghiệp, việc thu gom đủ số lượng vỏ làm nguyên liệu sản xuất citroflavonoid thực gặp khó khăn Theo thói quen người tiêu dùng sau ăn khơng giữ vỏ lại mục đích làm thuốc Các nhà máy sản xuất thực phẩm từ Citrus Việt nam chưa có nhiều để thu mua nguyên 65 liệu phế phẩm vỏ Các mẫu non sau hái, loại bỏ bớt q trình trồng khơng giữ lại sơ chế, có giá thành kinh tế cao Vì vậy, cần có định hướng hợp lí để tận thu nguồn nguyên liệu vỏ Citrus nhân dân, hàng quán, nhà máy sản xuất người trồng Citrus 4.2 Về xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ Citrus Với mục tiêu xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid cho hiệu cao, tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có Việt Nam phải phù hợp với điều kiện sản xuất công ty Dược phẩm nước Sau xây dựng quy trình chiết xuất quy mơ phòng thí nghiệm, ứng dụng vào khảo sát quy trình quy mơ pilot quy mơ cơng nghiệp Vì khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến chiết xuất lựa chọn điều kiện phù hợp để hướng tới nghiên cứu sản xuất cho quy mô lớn dựa vào tiêu chí: hiệu suất chiết xuất hàm lượng citroflavonoid sản phẩm thơ Trong quy trình chiết xuất citroflavonoid xây dựng, lựa chọn dung môi chiết xuất ethanol 70% nhiệt độ sơi hợp lý để hòa tan hesperidin hạn chế bớt hòa tan pectin tạp màu nên thu sản phẩm có hiệu xuất hàm lượng hesperidin cao Trong môi trường ethanol 70% vi khuẩn nấm mốc khó phát triển Mặt khác, dung mơi an tồn, giá rẻ, dễ mua, dễ thu hồi Quy trình xây dựng không sử dụng dung môi hữu nhexan, methanol, điểm khác so với quy trình TS Võ Văn Lẹo xây dựng [13] chúng tơi coi khác biệt có tính chất cải tiến TS Nguyễn Thị Chung đưa quy trình chiết xuất hesperidin phương pháp đun nóng hồi lưu (ethanol 70%, 2.5h/lần x 5lần; hiệu xuất 2,64%, hàm lượng CF 80%) [6] Nhận thấy quy trình đề tài xây dựng đơn giản hơn, 66 tốn thời gian công sức tiến hành lại cho hiệu suất cao (7.89%), sản phẩm thu có chứa hàm lượng citroflavonoid cao (82,50%) So với kết khảo sát hàm lượng citroflavonoid vỏ ban đầu (9,15%), quy trình xây dựng chiết khoảng 77,46% citroflavonoid tồn phần có dược liệu Kết cao kết công bố trước [6,][13] Với hiệu suất trên, quy trình tiếp tục tiến hành khảo sát quy mô lớn hơn, từ tiến tới hồn thiện quy trình để đưa vào sản xuất sở Quy trình Viện Dược liệu áp dụng triển khai quy mô pilot (100 kg/mẻ) cho kết ổn định 4.3 Về xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu sản phẩm chiết xuất citroflavonoid Để đảm bảo hiệu suất quy trình chiết xuất điều kiện bắt buộc phải kiểm tra chất lượng nguyên liệu đầu vào sản phẩm đầu Do đó, cần thiết phải xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu vỏ Citrus chế phẩm citroflavonoid dựa tiêu chung quy định Dược điển Việt Nam IV Tiêu chí quan trọng hàm lượng citroflavonoid có nguyên liệu sản phẩm điều định đến hiệu kinh tế quy trình cơng nghệ tác dụng chữa bệnh sản phẩm chiết xuất Do phép định lượng citroflavonoid cần phải xác Trong trình thực đề tài, nhận thấy định lượng hàm lượng citroflavonoid phương pháp đo quang (UV-VIS) sai số thừa lớn có nhiều chất khác cho phản ứng màu tương tự flavonoid Kết định lượng sản phẩm quy trình chiết xuất thể rõ điều Vì vậy, việc xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu sản phẩm chiết 67 xuất đặc biệt định lượng citroflavonoid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao giúp cho nghiên cứu xác định xác đó, giúp cho việc kiểm sốt chất lượng sản phẩm xác Trong Dược điển Trung Quốc 2010 quy định hàm lượng hesperidin vỏ quýt (hay vỏ số loài thuộc chi Citrus khác) 1,7% Tuy nhiên, quy định tiêu chuẩn cho dược liệu dùng y học cổ truyền, cho nguyên liệu chiết xuất citroflavonoid Qua khảo sát hàm lượng citroflavonoid vỏ số loài thuộc chi Citrus [11], nhận thấy hàm lượng hesperidin vỏ quýt, vỏ cam thu hái Việt Nam cao; số lượng mẫu có hàm lượng hesperidin > 4% nhiều Đây điều kiện thuận lợi cho chiết xuất quy mô nhỏ quy mô lớn, rõ ràng hàm lượng hesperidin cao dễ chiết xuất, hiệu xuất chiết xuất cao Vì vậy, xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu vỏ quýt đưa quy định hàm lượng hesperidin nguyên liệu phải từ 4% Đây tiêu chí quan trọng nguyên liệu đầu vào, giúp quy trình chiết xuất ổn định, hiệu suất chiết xuất hiệu kinh tế cao Trong tiêu chuẩn sở cho sản phẩm bột citroflavonoid quy định hàm lượng hesperidin >50%, định lượng HPLC Tiêu chuẩn Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương thẩm định (phụ lục 6) 4.4 Về thử độc tính cấp chế phẩm citroflavonoid Chuột nhắt trắng uống chế phẩm citroflavonoid với mức liều tăng dần từ thấp đến cao (liều tối đa uống 28g/kg TTC/24h) Sau uống mẫu thử, chuột ăn uống, hoạt động tiết bình thường Khơng thấy có biểu ngộ độc chuột khơng có chuột chết vòng 72 sau uống thuốc Vì vậy, khơng xác định liều tối đa để có chuột 68 chết (LD0) liều tối thiểu để 100% chuột lơ thí nghiệm chết (LD100), khơng xác định liều LD50 Mức liều tối đa cho chuột uống 28g/kg thể trọng, cao gấp 400 lần liều dự kiến sử dụng người (70mg/kg) Điều cho thấy chế phẩm citroflavonoid có độ an tồn cao Để đưa kết luận xác độc tính chế phẩm citroflavonoid cần phải có thêm nghiên cứu độc tính bán trường diễn để định hướng sử dụng chế phẩm citroflavonoid cho hiệu tốt 4.5 Về tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu chế phẩm chiết xuất citroflavonoid số lipid máu mô bệnh học Chế phẩm citroflavonoid với liều 200mg/kg thể rõ rệt tác dụng làm hạ triglycerid LDL-cholesterol; hạn chế mức độ xơ vữa động mạch chủ Biệt dược Daflon, dạng bào chế viên bao phim, công ty Dược phẩm Servier, Pháp có thành phần phân đoạn flavonoid chiết xuất từ vỏ loài Citrus, hàm lượng 500 mg (bao gồm diosmin 450 mg flavonoid tương đương với 50 mg hesperidin) Thuốc có tác dụng làm tăng trương lực tĩnh mạch, giảm ứ trệ tĩnh mạch, tăng sức bền mao mạch, dùng điều trị bệnh suy tĩnh mạch bạch huyết (nặng chân, đau chân, bứt rứt, đau chân, phù chân) điều trị triệu chứng bệnh trĩ Thuốc Daflon lưu hành Việt Nam từ lâu bán chạy thị trường Nếu xem liều uống viên Daflon 500mg, uống 4-6 viên/ngày, tức tối đa 3g hoạt chất/ngày cho người bình thường 50kg, liều sử dụng 150mg/kg/ngày cho hiệu điều trị rõ rệt nhỏ liều 200mg/kg/ngày chế phẩm bột citroflavonoid 69 Lí tác dụng bột citroflavonoid chưa cao hàm lượng hesperidin sản phẩm thấp, đạt khoảng 67%, chế phẩm citroflavonoid dạng bột thơ, cần phải qua giai đoạn tinh chế để loại bỏ bớt tạp chất Thành phần hoạt chất citroflavonoid hesperidin chất tan Vì cần có nghiên cứu dạng bào chế thích hợp để tăng độ tan hoạt chất chính, tăng tác dụng sinh học 70 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Sau thời gian thực đề tài: “Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid đánh giá tác dụng sinh học chế phẩm chiết xuất”, thu số kết sau: Xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid: - Đã khảo sát hàm lượng citroflavonoid 10 mẫu vỏ số loài thuộc chi Citrus Kết khảo sát thu được, lựa chọn vỏ quýt (Citrus reticulata Blanco.) làm nguyên liệu cho nghiên cứu khảo sát xây dựng quy trình chiết xuất - Xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ quýt (Citrus reticulata Blanco.) quy mơ phòng thí nghiệm với điều kiện sau: - Dung môi chiết xuất : ethanol 70% - Nhiệt độ chiết xuất : nhiệt độ sôi hồi lưu dung môi (80-850C) - Thời gian chiết : lần, lần - Tỷ lệ dung mơi/dược liệu: 10/1 - Kích thước dược liệu : thái lát dày 2mm - Thu hồi dung môi đến cao đặc (tỉ lệ 1:1), để 24 cho kết tủa - Lọc rửa tủa ethanol 70% - Sấy tủa 600, thu sản phẩm thơ Quy trình có tính ổn định cao, thu sản phẩm có hàm lượng citroflavonoid 82,50% với hiệu suất trung bình 7,89% so với khối lượng dược liệu Hiệu suất chiết citroflavonoid 77,46% so với lượng citroflavonoid có dược liệu - Xây dựng tiêu chuẩn sở để đánh giá nguyên liệu vỏ quýt chế phẩm chiết xuất citroflavonoid tiêu định tính, định lượng Đặc biệt tiêu hàm lượng hesperidin dược liệu (khơng thấp 71 4,0% tính theo dược liệu khô kiệt) hàm lượng hesperidin chế phẩm (khơng thấp 55,0% tính theo chế phẩm khơ kiệt) Thử độc tính cấp đánh giá tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu chế phẩm chiết xuất citroflavonoid - Đã nghiên cứu độc tính cấp chế phẩm bột citroflavonoid, xác định liều LD0 < 28g/kg thể trọng chuột, không xác định liều LD50 - Nghiên cứu tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu chế phẩm citroflavonoid qua số số lipid máu mơ bệnh học mơ hình gây tăng lipid máu ngoại sinh thỏ Kết cho thấy thỏ uống chế phẩm CF liều 200mg/kg thể rõ rệt tác dụng làm hạ triglycerid LDL-cholesterol hạn chế mức độ xơ vữa động mạch chủ Đề xuất Do thời gian thực đề tài có hạn, kết nghiên cứu thu bước đầu để định hướng cho nghiên cứu Chúng tơi xin có vài đề xuất hướng nghiên cứu sau đây: - Tiếp tục tiến hành khảo sát điều chỉnh thông số, xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid quy mơ pilot quy mô công nghiệp - Tiếp tục nghiên cứu độc tính bán trường diễn tác dụng phòng vữa xơ thành mạch chế phẩm citroflavonoid - Nghiên cứu theo dõi độ ổn định chế phẩm citroflavonoid - Nghiên cứu bào chế sản xuất chế phẩm chứa citroflavonoid thu từ quy trình chiết xuất citroflavonoid vỏ Citrus nước để phát triển thị trường 72 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập (1), NXB Khoa học kỹ thuật, tr 274-277, tr 321-323, tr 404-407,tr 432-434 Đỗ Huy Bích cộng (2006), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập (2), NXB Khoa học kỹ thuật, tr.518-520, tr.542-544, tr.555-558, tr.836-837 Lê Đình Bích,Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, NXB Y học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr 116, tr 224-284, tr 387 Bộ Y tế (2005), “Các phương pháp thử độc tính cấp-OECB”, Dự thảo hướng dẫn thử độc tính thuốc, phụ lục Nguyễn Văn Chính (2010), “Sản xuất Hesperidin từ vỏ cam phế thải Việt Nam”, Tạp chí Cơng nghiệp Hóa chất, (01) Nguyễn Thị Chung (1990), Nghiên cứu chiết xuất dạng bào chế flavonoid từ vỏ số loài thuộc chi Citrus Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Dược liệu Bài giảng Dược liệu, NXB Y học, Hà Nội, 2004, tập 1,2 Viện Dược Liệu (2008), Kỹ thuật chiết xuất dược liệu,NXB Khoa học kỹ thuật, tr 17-29 Đỗ Trung Đàn (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, NXB Y học 10 Trịnh Thị Điệp, Trần Minh Ngọc, Nguyễn Tuấn Anh, Đoàn Cao Sơn, Đinh Phương Liên, Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi, Phương Thiện Thương (2011), Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời naringin hesperidin vỏ loài thuộc chi Citrus sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí Dược liệu, tập 16, số 1+2/2011 (trang 82-87) 11 Trịnh Thị Điệp, Đinh Phương Liên, Trần Minh Ngọc, Nguyễn Tuấn Anh, Phương Thiện Thương (2012), Khảo sát hàm lượng citroflavonoid vỏ loài thuộc chi Citrus thu hái địa phương nước, Tạp chí Dược Liệu, tập 17, số 1/2012 (trang 48-52) 12 Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, (2), NXB Trẻ, tr 429-436 13 Võ Văn Lẹo (2007), Nghiên cứu khai thác số dược liệu thuộc chi Citrus Việt Nam, Luận án tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh 14 Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 384-385, tr 363-365, tr 691-692, tr.748-749, tr.766-767 15 Đoàn Thị Nhu (2006), Phương pháp nghiên cứu dược lý thuốc chống tăng lipid máu thuốc tác dụng vữa xơ động mạch Trong : Phuwng pháp nghiên cứu tác dụng dược lý thuốc từ dược thảo, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr.131-138 16 Nguyễn Văn Tựu (2009), Nghiên cứu phát triển liệu chuẩn số dược liệu thường dùng phục vụ công tác kiểm tra giám sát chất lượng dược liệu thuốc đông dược, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp bộ, Bộ Y tế Tiếng Anh 17 Bakkali F., Averbeck S., Averbeck D., Idaomar M (2008), “Biological effects of essential oils” Food Chem Toxicol.46, 446−475 18 Benavente-Garcia O., Castillo J., Marin F R., Ortuno A., Del Rio J A (2008), “Uses and properties of Citrus flavonoids” J Agric Food Chem 45, 4505−4515 19 Benavente-Garcisa O, Castillo J.v(2008), “Update on uses and properties of Citrus flavonoids: new finding in anticancer, cardiovascular and anti-inflammatory activity” J Agric Food Chem 56, 6185-6205 20 Bruneton J.(1999), “Pharmacognosy, phytochemistry and medicinal plants” Lavoisier Publishing Inc., Paris, 2nd edition 21 Choi S Y., Ko H C., Ko S Y., Hwang J H., Park J G., Kang S H., Han S H., Yun S H., Kim S J (2007), “Correlation between flavonoid content and the NO production inhibitory activity of peel extracts from various Citrus fruits” Biol Pharm Bull 30, 772−778 22 Da Silva E L., Oliveira A S., Lapa A J (1994), “Pharmacological evaluation of the anti-inflamatory activity of a citrus bioflavonoid, hespiridin, and the isoflavonoids, duartin and claussequinone, in rats and mice” J Pharm Pharmacol 46, 118−122 23 Diaz M N., Frei B., Vita J A., Keaney J F.(1997), “Antioxidants and atherosclerotic heart diseases” New Engl J Med 337, 408−416 24 Erlund I (2004), “Review of the flavonoids quercetin, hesperetin, and naringenin Dietary sources, bioactivities, epidemiology” Nutr Res 24, 851−874 bioavailability, and 25 Girennavar B., Poulose S M., Jayaprakasha G K., Bhat N G., Patil B S.(2006), “Furanocoumarins from grapefruit juice and their effect on human CYP 3A4 and CYP 1B1 isoenzymes” Bioorg Med Chem 14, 2606−2612 26 Gross J (1977), “Carotenoid pigments in Citrus” In Citrus Science and Technology Avi Publisher, Westport 1st edition, pp 302−348 27 Halliwell B., Gutteridge J M C (2000), Free radicals in biology and medicine Oxford University Press, 3rd edition 28 Hirata T., Fujii M., Akita K., Yanaka N., Ogawa K., Kuroyanagi M., Hongo D (2009), “Identification and physiological evaluation of the components from Citrus fruits as potential drugs for anti-corpulence and anticancer” Bioorg Med Chem 17, 25−28 29 Kawaii S., Tomono Y., Katase E., Ogawa K., Yano M (1999), “Quantitation of flavonoid constituents in Citrus fruits” J Agric Food Chem 47, 3565−3571 30 Nguyen T T., Kashiwaghi T., Sawamura M.(2007), “Citrus species and hybrids based on the isotope ratio of monoterpene hydrocarbons” Biosci Biotechnol Biochem 71, 2155−2161 31 Nogata Y., Sakamoto K., Shiratsuchi H., Ishii T., Yano M., Ohta H (2006), “Flavonoids composition of fruit tissues of Citrus species” Biosci Biotechnol Biochem 70, 178−192 32 Malterud K E., Rydland K M.(2000), “Inhibotors of 15-lipoxygenase from orange peel” J Agric Food Chem 48, 5576−5580 33 Manners G D (2007), “Citrus limonoids: analysis, bioactivity, and biomedical prospects” J Agric Food Chem 55, 8285−8294 34 Peter G Waterman (1975), “Alcaloids of the Rutaceae: their distribution and systematic significance” Biochem System Ecol 3, 149−180 35 Peterson J J., Beecher G R., Bhagwat S A., Dwyer J T., Gebhardt S E., Haytowitz D B., Holden J M (2006), “Flavanones in grapefruit, lemon, and limes: a compilation and review of the data from the analytical literature” J Food Comp Anal 19, S74−S80 36 Peterson J J., Dwyer J T., Beecher G R., Bhagwat S A., Gebhardt S E., Haytowitz D B., Holden J M (2006), “Flavanones in oranges, tangerines (mandarins), tangors, and tangelos: a compilation and review of the data from the analytical literature” J Food Comp Anal 19, S66−S73 37 Pietta P G (2000), “Flavonoids as antioxidants” J Nat Prod 63, 1035−1042 38 Rapisarda P., Calabretta M L., Romano G., Intrigliolo F (2005), “Nitrogen metabolism components as a tool to discriminate between organic and conventional Citrus fruits” J Agric Food Chem 53, 2664−2669 39 Rice-Evans C A., Miller N J., Paganga G (1996), “Structureantioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acids” Free Radic Biol Med 20, 933−956 40 Roy A., Saraf S (2006), “Limonoids: Overvew of significant bioactive triterpenes distributed in plant kingdom” Biol Pharm Bull 29, 191−201 41 Shaw P E (1979), ”Review of quantitative analysis of Citrus essential oil” J Agric Food Chem 27, 246−257 42 Swingle W T (2007), “The botany of Citrus and its wild relatives” In Citrus Industry, Vol 1, edited by Reuther et al., pp 190−430 Berkley University press, California, USA 43 Tatum J H., Berry F R (1977), “6,7-Dihydrocoumarin in the peels of Citrus” Phytochemistry 16, 1091−1092 44 Tatum J H., Berry F R (1979), “Coumarin and psoralens in grapefruit peel oil” Phytochemistry 18, 500−502 45 Tripoli E., Guardia M L., Giammanco S., Majo D D., Giammanco M.(2007), “Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties” Food Chem 104, 466−479 46 Wu T S., Huang S C., Jong T T., Lai J S., Kuoh C S (1988), “Coumarins, acridone alkaloids and a flavone from Citrus grandis” Phytochemistry 27, 585−587 DANH MỤC PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: Kết giám định tiêu loài thuộc chi Citrus PHỤ LỤC 2: Ảnh chế phẩm bột citroflavonoid PHỤ LỤC 3: Hình ảnh vi thể động mạch chủ thỏ PHỤ LỤC 4: Tiêu chuẩn sở dược liệu (Trần bì) PHỤ LỤC 5: Tiêu chuẩn sở bột citroflavonoid PHỤ LỤC 6: Phiếu thẩm định Tiêu chuẩn sở sản phẩm bột citroflavonoid Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương PHỤ LỤC 7: Bài báo “Khảo sát hàm lượng citroflavonoid vỏ loài thuộc chi Citrus thu hái địa phương nước”- Tạp chí Dược liệu, tập 17, số 1/2012 (Trang 48 – 52) PHỤ LỤC 8: Bài báo “Xây dựng phương pháp định tính, định lượng đồng thời naringin hesperidin vỏ loài thuộc chi Citrus sắc ký lỏng hiệu cao”- Tạp chí Dược liệu, tập 16, số 1+2/2011 (Trang 82 – 87) ... cho dược liệu sản phẩm chiết xuất citroflavonoid - Thử độc tính cấp chế phẩm chiết xuất citroflavonoid - Đánh giá tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu chế phẩm chiết xuất citroflavonoid mơ... sản xuất thành phẩm có ích có đóng góp lớn cho lợi ích kinh tế, môi trường khoa học công nghệ Với lý đó, chúng tơi thực đề tài "Nghiên cứu chiết xuất citroflavonoid đánh giá tác dụng sinh học chế. .. chế phẩm chiết xuất" Mục tiêu đề tài: Xây dựng quy trình chiết xuất citroflavonoid từ vỏ số loài thuộc chi Citrus Đánh giá độc tính cấp tác dụng điều chỉnh rối loạn lipid máu chế phẩm chiết xuất