Đang tải... (xem toàn văn)
Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệuXác định tỷ lệ nhiễm Escherichia Coli O157H7 trong thịt bò bán ở một số địa điểm tại Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM XÁC ĐỊNH TỶ LỆ NHIỄM ESCHERICHIA COLI O157:H7 TRONG THỊT BÒ BÁN Ở MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM TẠI HÀ NỘI, NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG ĐẶC HIỆU PHẠM THỊ TÂM CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC THÚ Y MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm Việt Nam Chính phủ hầu hết Ngành, cấp người tiêu dùng quan tâm Gần báo chí thường xuyên lên tiếng phản đối việc sử dụng hormone, kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật không mục đích khơng phù hợp với qui định, gây ảnh hưởng nguy hiểm đến sức khoẻ người Việc phát thấy chất sudan lòng đỏ trứng gà, melamin sữa, kim loại nặng gấp nhiều lần so với ngưỡng quy định hồi chuông cảnh báo cho an toàn thực phẩm lưu hành Việt Nam Theo số liệu thống kê Cục Vệ sinh An toàn Thực phẩm – Bộ Y Tế, năm 2010 nước xảy 132 vụ ngộ độc thực phẩm với 4.676 người mắc bệnh, 3.281 người nhập viện có 41 trường hợp tử vong Nguyên nhân vi khuẩn (Salmonella, Streptoccocus, E coli Staphylococcus); độc tố tự nhiên hóa chất) [2] E.coli O15:H7 chủng vi khuẩn nguy hiểm gây ngộ độc thực phẩm nhiều quốc gia giới với hội chứng: tiêu chảy, viêm ruột xuất huyết, urê huyết (Haemolytic ureamic syndrome-HUS) Thịt bò sản phẩm chế biến từ bị loại thực phẩm có nguy cao nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7 Theo báo cáo Griffin P.M, (1995) [47], 3,7% mẫu thịt bò vùng Nam Mỹ nhiễm vi khuẩn E.coli O15:H7 Ở Châu Á, E.coli O157:H7 phát Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia (Yamada, 1993) [144], (Son Radu, 1998) [133] Ở Việt Nam, vi khuẩn phát thấy phân bò với tỷ lệ 2% (Norobu cộng sự, 2005) [90] Bên cạnh đó, nghiên cứu tác giả nước phát thấy gen độc tố điển hình vi khuẩn E.coli O157:H7 thịt bò, thịt lợn, phân bò, phân lợn với tỷ lệ mẫu nhiễm cao (Phạm Công Hoạt cộng sự, 2003) [3], (Trần Thanh Phong cộng sự, 2007) [5] Như vậy, với điều kiện chăn nuôi vệ sinh đặc biệt điều kiện giết mổ vệ sinh, thiếu kiểm soát Việt Nam nguy nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 vào loại thực phẩm gây ngộ độc thực phẩm cho người tiêu dùng dễ xảy Với mục đích xác định có mặt vi khuẩn thịt bò để chủ động cơng tác phịng, điều trị bệnh ngộ độc thực phẩm sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit xác định nhanh vi khuẩn, tiến hành thực đề tài: “ Xác định tỷ lệ nhiễm Escherichia coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu” Mục tiêu đề tài - Xác định tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội; - Sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Việc xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 đặc tính sinh hóa độc lực vi khuẩn sở để xác định dịch tễ học hội chứng ngộ độc thực phẩm vi khuẩn gây ra, từ tạo sở để xây dựng biện pháp phịng ngừa q trình nhiễm thực phẩm điều trị bệnh vi khuẩn gây nên - Đề tài đưa quy trình chế tạo kháng thể đơn dịng đặc hiệu với vi khuẩn E.coli O157:H7 ứng dụng để sản xuất kit chẩn đoán huyết học xác định vi khuẩn 3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề tài xác định có mặt vi khuẩn E.coli O157:H7 thịt bò bán Hà Nội số vùng phụ cận, đồng thời chứng minh khả gây bệnh chủng - Đề tài chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu 100% với vi khuẩn E.coli O157:H7 Hai kháng thể sử dụng nghiên cứu tạo phức hợp kháng thể hạt nano silica để phát số lượng vi khuẩn E.coli O157:H7 Viện Cơng nghệ sinh học chủ trì thực - Việc xác định vi khuẩn E.coli O157:H7 sản xuất kháng thể đơn dòng phục vụ chế tạo kit phát vi khuẩn góp phần tích cực cơng tác đảm bảo vệ sinh an tồn thực phẩm Những đóng góp đề tài Kết đề tài hoàn toàn Việt Nam, với lý do: - Đề tài thực với đối tượng vi khuẩn E.coli O157:H7 nhiễm thịt bị đặc tính gây điển hình Kết đề tài minh chứng cho có mặt vi khuẩn thịt bị Hà Nội vùng phụ cận - Lần Việt Nam chế tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu vi khuẩn E.coli O157:H7 để ứng dụng vào quy trình xác định vi khuẩn thực phẩm chẩn đoán cho bệnh nhân ngộ độc thc phm Chơng I Tổng quan tài liệu 1.1 Vi khn E.coli g©y bƯnh Escherichia coli (E.coli) vi khuẩn thường trú đường ruột người động vật máu nóng Hầu hết chủng E.coli vô hại Tuy nhiên, suy giảm miễn dịch có tổn thương niêm mạc đường tiêu hố mà chủng E.coli thơng thường gây bệnh Với chủng gây bệnh, vi khuẩn xâm nhập vào thể thơng qua bề mặt màng nhày niêm mạc da gây nên hội chứng lâm sàng chủ yếu, bao gồm: i) nhiễm khuẩn đường tiết niệu, ii) nhiễm trùng huyết viêm màng não, iii) viêm ruột, tiêu chảy Theo thống kê James Nataro cộng sự, (1998) [53], chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh chia thành nhóm ( phụ lục bảng 1) + Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm chủng E.coli gây viêm ruột, tiêu chảy trẻ em tuổi (Polotsky cộng sự, 1977) [106] + Nhóm ETEC (Enterotoxigenic E.coli): gồm chủng E.coli tiết độc tố ruột bền nhiệt (heat stable toxin- ST) độc tố ruột không bền nhiệt (heat-labile enterotoxin- LT) Trong ®ã, độc tố LT hoạt hóa men adenyl cyclase tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’ monophosphat) Yếu tố kích thích ion Cl- bicarbonat tách khỏi tế bào đồng thời ức chế Na+ bên tế bào, gây tượng kéo nước từ tế bào, mơ vào lịng ống tiêu hóa hậu gây tiêu chảy nước Còn độc tố ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMC (cyclic guanosin 5’ monophosphat) bên tế bào dẫn đến kích thích tiết muối nước gây tiêu chảy Những chđng E.coli có loại nội độc tố LT ST gây tiêu chảy trầm trọng kéo dài (Levine cộng sự, 1987) [70] + Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): chđng E.coli bám lên niêm mạc làm bong tróc gây loét niêm mạc gây tiêu chảy lẫn máu (giống triệu chứng bệnh lỵ vi khuẩn Shigella) (DuPont cộng sự, 1971) [35] + Nhóm EAEC (Enteroaggregative E.coli): nhóm E.coli gây tiêu chảy khơng sản sinh độc tố (Cravioto cộng sự, 1979) [29] + Nhóm EHEC: nhóm E.coli gây tiêu chảy xuất huyết, đại diện vi khuẩn E.coli O157: H7 Vi khuẩn gây bệnh người với triệu chứng cấp tính như: tiêu chảy cấp, xuất huyết đường tiêu hoá, phân có lẫn máu, gây hội chứng ure huyết (HUS-Haemolytic Uraemic Syndrome), trường hợp nghiêm trọng gây tử vong 85-95% ca bệnh nhiễm E.coli O157:H7 có biểu hội chứng urê huyết (Riley cộng sự, 1983) [119] E.coli O157:H7 vi khuẩn thuộc loài E.coli gây ngộ độc thực phẩm người Theo ước tính CDC, (1999) [26], hàng năm số ca nhiễm vi khuẩn E.coli O157:H7 nước chiếm khoảng 20.000 người, đó, khoảng 250 trường hợp tử vong Nguyên nhân tình trạng ngộ độc E.coli O157:H7 nhiễm nước uống, rau xanh, thịt bị sản phẩm thực phẩm có nguồn gốc từ bò Theo tác giả Faith cộng sự, (1996) [39], Hancock cộng sự, (1994) [48], tỷ lệ E coli O157:H7 gia súc non lớn gia súc trưởng thành Còn theo nghiên cứu Doyle cộng sự, (1997) [34] cho biết: E coli O157:H7 có mặt 3,7% mẫu thịt bị bán lẻ, 1,5% mẫu thịt lợn, 1,5% mẫu thịt gà, 2% mẫu thịt cừu Bên cạnh đó, nghiên cứu khác Le Saux cộng sự, (1993) [68], chứng minh vi khuẩn E coli O157:H7 nhiễm thịt bò tái, sữa tươi bánh humburger nguyên nhân gây nhiều vụ ngộ độc thực phẩm Mỹ Canada Ngoài ra, người ta xác định có mặt vi khuẩn sốt mayonaire (Griffin, 1995) [47], nước hoa chưa trùng (Besser cộng sự, 1993) [14], (Mc Carthy, 1996) [78] rau sống (Morgan, 1988) [83] Ở Việt Nam, chưa có báo cáo số trường hợp ngộ độc thực phẩm E.coli O157:H7, nhiên, theo báo cáo Noboru cộng sự, (2005) [90], 2/100 mẫu phân bò ni Việt Nam có mặt vi khuẩn Theo số nghiên cứu nước tác giả như: Phạm Công Hoạt cộng sự, (2003) [3] xác định 8/33 mẫu phân lợn tiêu chảy nhiễm độc tố Stx vi khuẩn E.coli O157:H7 Còn nghiên cứu tác giả Trần Thanh Phong cộng sự, (2007) [5], gen độc tố đặc trưng vi khuẩn E.coli O157:H7 Stx1, Stx2, eae, hly, stb phát thấy thịt bò, thịt lợn, phân bị, phân lợn bình thường tiêu chảy với tỷ lệ tương đối cao, cụ thể: có tới 50% mẫu phân bê tiêu chảy, 57,1% mẫu phân bị bình thường, 55,9% mẫu thịt bò mang đến gen độc lực đặc trưng nhóm EHEC; cịn lợn có đến 33,3% mẫu phân lợn tiêu chảy, 62,5% mẫu phân lợn cai sữa tiêu chảy, 20% mẫu phân lợn bình thường, 24,5% mẫu thịt lợn mang đến gen độc lực đặc trưng nhóm EHEC 1.2 Các đặc tính vi khuẩn E.coli O157:H7 1.2.1 Đặc tính sinh học 1.2.1.1 Đặc điểm hình thái E.coli O157: H7 trực khuẩn hình que ngắn, bắt màu gram âm, kích thước tế bào khoảng 2x0,5µm, khơng hình thành nha bào, có lơng roi, có khả di động Khuẩn lạc vi khuẩn dạng S, tròn trơn, bóng, có lớp màng bao bọc, gắn chặt bề mặt mơi trường thạch, khuẩn lạc có màu nâu nhạt mơi trường thạch Sorbitol MacConkey(SMAC) 1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy Khác với hầu hết chủng E.coli khác, E.coli O157:H7 khơng lên men đường D-sorbitol, đó, môi trường thạch Sorbitol MacKonkey sử dụng làm môi trường đặc hiệu để phân biệt vi khuẩn (March cộng sự, 1986) [77] Trên môi trường SMAC, vi khuẩn E.coli O157:H7 có màu vàng nâu nhạt chủng vi khuẩn E.coli khác có màu hồng cánh sen Theo Thompson, (1990) [139], E.coli O157:H7 không sinh enzyme βglucuronidase, mơi trường có bổ sung chất 4methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG), vi khuẩn không phát quang, vi khuẩn E.coli khác lại có khả Vì vậy, người ta phân biệt khuẩn lạc E.coli O157:H7 môi trường thạch MUG ánh sáng tử ngoại Ngoài ra, khuẩn lạc E.coli O157:H7 phân biệt mơi trường Rainbow Agar O157 (Biolog Inc., Mỹ) Fluorocult E.coli O157 (Merck, Đức) Trên mơi trường thạch Fluorocult® khuẩn lạc vi khuẩn có màu xanh nhạt E.coli khác có màu vàng Cịn mơi trường thạch Rainbow, khuẩn lạc vi khuẩn E.coli O157 có phổ màu đen, xám, đỏ, xanh, tím 1.2.1.3 Sức đề kháng + Nhiệt độ: khả thích ứng với nhiệt độ vi khuẩn E.coli nhóm EHEC, bao gồm chủng E.coli O157:H7 tương tự với nhóm khác Theo Doyle cộng sự, (1984) [32], chủng vi khuẩn bị ức chế điều kiện 440C Tuy nhiên, Palumbo cộng sự, (1995) [99] lại cho biết, khả thích ứng với nhiệt độ E.coli O157:H7 phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy: môi trường BHI (Brain Heart Infusion), vi khuẩn phát triển tốt nhiệt độ 450C, cịn với mơi trường EC (E.coli) chúng lại bị ức chế nhiệt độ 440C Theo Buchanan cộng sự, (1994) [21], Rajkowski cộng sự, (1995) [108], nhiệt độ tối thiểu cho sinh trưởng vi khuẩn E.coli O157:H7 khoảng 8-100C + Độ pH: theo Buchanan cộng sự, (1992) [20], pH thích hợp cho vi khuẩn E.coli O157:H7 5,5-7,5 Vi khuẩn bị ức chế mạnh mức pH 4,0-4,5, nhiên ảnh hưởng pH tới phát triển vi khuẩn cịn phụ thuộc vào yếu tố có liên quan khác như: thời gian, nhiệt độ nuôi cấy, loại axit, nồng độ axit sử dụng để chuẩn độ môi trường (Leyer cộng sự, 1995) [71] Còn theo nghiên cứu Benjamin cộng sự, (1995) [13], Buchanan cộng sự, (1996) [22], chủng vi khuẩn thuộc nhóm EHEC có khả chịu độ pH 2,5 2-7 370C Trong loại thực phẩm lên men nước ép trái cây, mát, E.coli O157:H7 tồn sau vài tháng Tuy nhiên, khả sống sót vi khuẩn cịn phụ thuộc nhiều vào thời gian bảo quản, ví dụ: nước ép hoa vi khuẩn tồn từ 2-3 ngày 250C, 80C, vi khuẩn tồn từ 10-30 ngày (Zhao cộng sự, 1993) [148] + Khả chịu mặn: theo Buchanan cộng sự, (1994) [22], vi khuẩn E.coli O157:H7 chịu nồng độ muối từ 0,5-5% 1.2.2 Đặc tính sinh hố Kiểm tra đặc tính sinh hóa vi khuẩn E.coli O157:H7 thực sau bước nuôi cấy vi khuẩn mơi trường đặc hiệu SMAC Các khuẩn lạc có màu vàng nâu nhạt cấy chuyển lên môi trường thạch LB (Luria Agar), sau 18 nuôi cấy 420C, thu nhận khuẩn lạc đứng riêng rẽ để làm phản ứng sinh hóa bảng 1.1 Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá vi khuẩn E.coli O157:H7 ( Samuel cộng sự, 1998) [122] Phản ứng β-Glucuronidase Sorbitol Salicin Esculin Arginine dihydrolase Adonitol Inositol Cellobiose Urease Citrate KCN Sucrose Glucose (acid) Glucose (gas) Indol Arabinose Trehalose Mannitol Lactose Maltose Rhamnose Xylose Lysine decarboxylase Ornithine decarboxylase Raffinose Dulcitol Kết phản ứng + + + + + + + + + + + + + + + Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính 143 Sbjct 787 728 AAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA Query 848 789 TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG Sbjct 847 788 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGG Query 908 849 CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGAGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA Sbjct 907 848 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| CGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAA Query 968 909 AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC Sbjct 967 908 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGC Query 1028 969 AACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC Sbjct 1027 968 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGC Query 1088 1029 CTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG Sbjct 1087 1028 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTG Query 1148 1089 GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAAC Sbjct 1147 1088 |||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||| GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCTTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAAC Query 1208 1149 TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCGTCATGG Sbjct 1207 1148 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| TCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGG Query 1268 1209 CCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGC Sbjct 1267 1208 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGC Query 1328 1269 GAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGGGTGGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGGCTC Sbjct 1327 1268 ||||||||||||||||||||||||| || ||||||||||||||||||||||||||| ||| GAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTC 144 Query 1388 1329 CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG Sbjct 1387 1328 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGG Query 1448 1389 CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAGGAAGTAGGTAGCTTAA Sbjct 1447 1388 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| CCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAA Query 1508 1449 CCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGGGAAGTCGTAACAAGGTA Sbjct 1507 1448 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||| CCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTA Query 1509 Sbjct 1508 GCCGTA ||||| ACCGTA 1514 1513 Hình So sánh trình tự gen 16s ARNr vi khuẩn E.coli O157:H7 M61 với trình tự GeneBank ( mã số: EU118103.1) Hình Chai ni cấy tế bào VERO kiểm tra độc tố E.coli O157:H7 Hình Kiểm tra bệnh tích tế bào VERO độc tố vi khuẩn 145 Hình Hình ảnh ni cấy tế bào lai sau tách dịng Hình Hình ảnh tế bào u tủy chuột dịng Sp 2/0-Ag14 Hình Hai khuẩn lạc tế bào lai giếng ni sau tách dịng ( giếng lai bị loại) 146 Hình 10 Khuẩn lạc tế bào lai sau tách dịng III Các loại mơi trường, hóa chất thí nghiệm Hóa chất dùng tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn Dung dịch sol I (glucose 50 mM, Tris-HCl (pH 8,0) 25 mM, EDTA (pH 8,0) 10 mM), dung dịch sol II (sodium dodecyl sulfat (SDS) 1%, NaOH 0,2 M), dung dịch III (potassium acetate M pH 5), RNase 10 mg/ml Hóa chất dùng cho phản ứng tạo dòng Dung dịch CaCl2 100 mM lạnh, NdeI, SalI (Fermentas), T4 DNA ligase (Fermentas) Hóa chất dùng cho cảm ứng biểu protein Dung dịch IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) 100 mM (giữ -20oC) (Fermentas) Hóa chất dùng cho điện di protein - Gel phân tách (separating gel), acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O, ml acrylamide 30 %, 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8), 0,1 ml SDS 10 %, 0,1 ml APS 10 %, 30 µl TEMED - Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %, 0,5 ml Tris-HCl 1M (pH 6,8), 0,04 ml SDS 10 %, 0,04 ml APS 10 %, 16 µl TEMED - Dung dịch nạp mẫu 5X (giữ 4oC): SDS 10 % (w/v), DTT 10 mM, Tris-HCl (pH 6,8) 0,2 M, glycerol 20 % (v/v), bromophenol blue 0,05 % - Dung dịch điện di 5X (giữ nhiệt độ phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; g SDS ; thêm dH2O cho đủ l - Dung dịch nhuộm gel (giữ nhiệt độ phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue, 112,5 ml ethanol tuyệt đối, 25 ml glacial acetic acid ; thêm dH2O cho đủ 250 ml - Dung dịch giải nhuộm (giữ nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid, 100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O 147 Hóa chất dùng cho Western blot - Dung dịch điện chuyển 1X (giữ 4oC): 3,03 g Tris-base, 14,41 g glycine, 200 ml methanol, thêm dH2O cho đủ l - Dung dịch TBS 1X: 0,605 g Tris-base, 4,39 g NaCl, thêm dH2O đủ 500 ml - Dung dịch TBST (dung dịch rửa): TBS + Tween 20 (1 %) - Dung dịch khóa màng (membrane blocking): TBST + sữa gầy (5 %) - Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu horseradish peroxidase (Santa Cruz biotechnology) - Dung dịch ly giải tế bào (bảo quản -20oC): Tris HCl 10 mM pH 7.4, NaCl 50 mM, Triton X100 1%, Na3VO4 (sodium orthovanadate) mM, NaF (sodium fluoride) 50 mM, Na4P2O7 (tetrasodium pyrophosphate) 25 mM, EDTA mM, Pepstatin 10 µg/ml, Protease inhibitor viên/50 ml dung dịch ly giải - Phim, dung dịch developer fixer (Kodak) Hóa chất dùng ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch động vật Dung dịch PBS 1X (KH2PO4 1,47 mM, Na2HPO4 10 mM, KCl 2,7 mM; NaCl 137mM), dung dịch PBS – BSA % (PBS 1X + BSA % (w/v), dung dịch PBS – Tween 0,05 % (v/v), kháng IgG thỏ/chuột đánh dấu HRP (horseradish peroxidase) (Dako), dung dịch TMB (3,3´,5,5´- tetramethylbenzidine) (Kem-En-Tec), dung dịch H2SO4 0,18 M Hóa chất dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma: PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M, HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma) Hóa chất dùng tinh kháng thể đơn dòng - Cột Sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, NaCl 0,15 M), dung dịch dung giải (glycine 0,1 M pH 2,8), dung dịch trung hòa 10 Môi trường - Môi trường Luria-Bertani (LB): 10 g NaCl, 10 g bacto trypton, g cao nấm men, hòa tan H2O, chỉnh pH 7, thêm nước cho đủ l Hấp khử trùng 121°C 30 phút - Môi trường LB + kanamycin : môi trường LB thêm agar 15 g/l, bổ sung kanamycin để đạt nồng độ cuối 30 µg/ml 148 - Mơi trường MEM nuôi cấy tế bào (Sigma) 8,12 g/l, phenol đỏ 0,4 %, L-glutamine mM, NaHCO3 0,1125 %, HEPES 20 mM, amphotericin-B 0,025 µg/ml, penicillin G 100 UI/ml, streptomycin 100 µg/ml, huyết (FBS – fetal bovine serum) 10 %, chỉnh pH 7,2 - Môi trường DMEM bổ sung HAT: môi trường DMEM (Gibco) bổ sung dung dịch HAT 1X (Hypoxanthine x 10-4M, Aminopterin x 10-7 M, Thymidine 1,6 x 10-5 M) 149 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nghiên cứu luận án hoàn toàn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Mọi thơng tin trích dẫn luận án rõ nguồn gốc TÁC GIẢ LUẬN ÁN Phạm Thị Tâm 150 ii LỜI CẢM ƠN Trong trình thực Đề tài hồn thành luận án, tơi nhận quan tâm giúp đỡ Khoa Sau đại học, Khoa Chăn nuôi- Thú y, Bộ môn Vi sinh vật Bệnh lý Trường ĐHNL - Đại học Thái Nguyên thầy cô giáo, đồng nghiệp Trường ĐHNL Thái Nguyên Đồng thời, nhận giúp đỡ nhiệt tình Ban lãnh đạo tập thể cán Viện Cơng nghệ sinh học, Phịng thí nghiệm Tế bào gốc, trường ĐH Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Tơi xin trân trọng cảm ơn tới quan tâm giúp đỡ quý báu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Thầy hướng dẫn khoa học: TS Phạm Công Hoạt, Bộ Khoa học Công nghệ; PGS.TS Tơ Long Thành, Giám đốc Trung tâm Chẩn đốn Quốc giaCục Thú y, Bộ Nông nghiệp Phát triển nơng thơn Hai Thầy tận tình hướng dẫn tơi thực đề tài tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành Luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn tới giúp đỡ thầy, cô: PGS.TS Nguyễn Thị Kim Lan, Khoa Sau đại học, trường ĐHNL Thái Nguyên động viên, nhắc nhở, tạo điều kiện cho tơi hồn thành Luận án này; PGS.TS.Trần Thị HạnhHội Thú y, GS.TS Nguyễn Quang Tuyên- trường ĐHNL Thái Ngun tận tình giúp đỡ tơi q trình hồn thành Luận án; Ths Phan Kim Ngọc- Giám đốc Phịng thí nghiệm Tế bào gốc trường ĐH KHTN Thành phố Hồ Chí Minh, PGS.TS Đinh Duy Kháng – Viện CNSH tạo điều kiện sở vật chất, phịng thí nghiệm cho tơi thực Đề tài; PGS.TS Tống Kim Thuần- Viện CNSH giúp kinh phí thực nhánh đề tài sản xuất kháng thể đơn dịng vi khuẩn E.coli O157:H7 Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu Viện Đại học Mở Hà Nội, ban Lãnh đạo toàn thể cán bộ, giảng viên Khoa CNSH, Viện Đại học Mở Hà Nội tạo điều kiện, giúp đỡ, động viên q trình làm việc hồn thành Luận án này; Tôi vô biết ơn thành viên gia đình ln bên tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin trân trọng cảm ơn! NGHIÊN CỨU SINH 151 v DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ Danh mục bảng báo cáo Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hoá vi khuẩn E.coli O157:H7 Bảng 1.2 Bảng 1.3 Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR- Multiplex phát vi khuẩn E.coli O157:H7 Trật tự ba axit amin gen fliC subtype kháng nguyên H7 vi khuẩn E.coli O157: H7 Tỷ lệ nhiễm E.coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội Bảng 3.2 Thành phần phản ứng cắt ADN plasmide Bảng 3.3 Bảng 3.4 Bảng 3.5 Bảng 3.6 Bảng 3.7 Bảng 3.8 Bảng 3.9 So sánh mức độ tương đồng trình tự gen 16s ARNr thu với trình tự GeneBank Các cặp mồi sử dụng để xác định gen độc tố vi khuẩn E.coli O157:H7 Kết xác định gen độc tố chủng E.coli O157:H7 phân lập Kết đánh giá khả gây đáp ứng miễn dịch thỏ kháng nguyên Kết kiểm tra khả phát đặc hiệu kháng nguyên kháng thể tạo thành thỏ Kết theo dõi thí nghiệm ảnh hưởng liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch chuột Kết theo dõi thí nghiệm ảnh hưởng chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch chuột Bảng Ảnh hưởng loại muối nồng độ đến khả 3.10 phá vỡ hồng cầu lách chuột Trang 18 26 60 67 69 71 71 78 80 82 85 88 152 Bảng Kết theo dõi ảnh hưởng yếu tố thí nghiệm 3.11 đến trình dung hợp tế bào Bảng Phân tích mơ hình thí nghiệm dung hợp tế bào 91 92 3.12 Bảng Kết thí nghiệm ảnh hưởng yếu tố đế 3.13 trình sinh trưởng sinh kháng thể tế bào lai Bảng Kết tách dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn 3.14 dòng Bảng 3.15 96 102 Kết xác định độ đặc hiệu dòng kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên H7 vi khuẩn E.coli 105 O157:H7 (OD450) Danh mục bảng phụ lục Bảng Các chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh điển hình Bảng Kháng nguyên chủng vi khuẩn E.coli Bảng Cấu trúc kháng nguyên O số chủng vi khuẩn E.coli gây bệnh điển hình Bảng Phản ứng chéo kiểu kháng nguyên O E coli Bảng Phản ứng chéo kháng nguyên O E coli với vi khuẩn khác Bảng Thành phần cấu tạo số loại kháng nguyên K thuộc nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20 Bảng Cấu trúc số loại kháng nguyên K vi khuẩn E.coli thuộc nhóm O8, O9, O101, O20 Bảng Thành phần cấu tạo số loại kháng ngun K khơng thuộc nhóm vi khuẩn E.coli O8, O9, O101, O20 Bảng Sự phát triển nghiên cứu kháng thể đơn dòng Bảng 10 Thành phần phản ứng PCR Bảng 11 Thành phần phản ứng nối ghép sản phẩm PCR vector pBT 153 Bảng 12 Thành phần phản ứng cắt đoạn DNA enzym Bam HI Bảng 13 Thành phần gel SDS-PAGE Hình ảnh báo cáo Trang Hình 1.1 Cấu trúc độc tố Stx chế gây bệnh 14 Hình 1.2 Cấu trúc LPS 20 Hình Sơ đồ gen mã hố kháng ngun O157 23 Hình 1.4 Cấu trúc bề mặt tiên mao vi khuẩn E.coli 23 Hình 1.5 Sơ đồ gen tổng hợp kháng nguyên H7 25 Hình 1.6 Sơ đồ gen chủng vi khuẩn E.coli K12 30 Hình 1.7 Các loại kháng thể đơn dòng tái tổ hợp 40 Hình 3.1 Hình 3.2 Các hình ảnh sinh hóa định typ kháng huyết vi khuẩn E.coli O157:H7 Kết tách chiết ADN tổng số chủng vi khuẩn E.coli O157:H7 phân lập 61 63 Hình 3.3 Kết phản ứng nhân đoạn gen 16s ARNr 63 Hình 3.4 Sơ đồ vector pBT 64 Hình 3.5 Hình 3.6 Hình 3.7 Hình 3.8 Hình 3.9 Hình 3.10 Hình 3.11 Khuẩn lạc vi khuẩn E.coli DH5α sau biến nạp vector tái tổ hợp Kết tách chiết DNA plasmide từ khuẩn lạc xanh, trắng Kết cắt ADN plasmide enzyme Bam HI Hình ảnh tách ADN tổng số vi khuẩn E.coli O157:H7 Kết xác định gen độc tố chủng E.coli O157:H7 phân lập Biểu bệnh tích tế bào bị gây nhiễm độc tố tách từ chủng E.coli O157:H7 M61 (pha loãng 102) Kết điện di kháng nguyên vi khuẩn E.coli 66 67 68 70 72 74 77 154 O157:H7 gel SDS-PAGE Hình 3.12 Hình 3.13 Ảnh hưởng điều kiện yếu tố dung hợp đến trình lai tế bào Đại thực bào thu nhận từ ổ bụng chuột BALB/c để làm tế bào nuôi duỡng 94 97 Ảnh hưởng thành phần bổ sung vào mơi Hình 3.14 trường ni đến khả sinh trưởng sinh kháng 99 thể tế bào lai Hình 3.15 Hình 3.16 Tế bào lai giếng phiến nhựa 96 lỗ Dòng tế bào sau ngày tách dòng (trong phiến nhựa 96 lỗ) 101 103 Hình ảnh điện di kháng nguyên vi khuẩn E.coli Hình 3.17 O157:H7 gel SDS-PAGE Western blot với 104 Mab C3.26.IV Biểu đồ, đồ thị báo cáo Đồ thị 3.1 Đồ thị 3.2 Đồ thị 3.3 Đồ thị 3.4 Biến thiên kháng thể tạo thành thỏ gây miễn dịch Biến thiên kháng thể chuột tiêm kháng nguyên H7 với hàm lượng khác Biến thiên hàm lượng kháng thể chuột tiêm chất bổ trợ khác Kết theo dõi trình sinh trưởng sinh kháng thể dịng tế bào lai 79 83 86 100 Hình ảnh phụ lục Hình Thời gian biểu bệnh người E coli O157:H7 Hình Các gen có liên quan đến độc tố vi khuẩn nhóm EHEC Hình Sơ đồ phân lập E coli O157:H7 155 Hình Trình tự gen 16s ARNr vi khuẩn E.coli O157:H7 máy giải trình tự Perkin Elmer Hình Chai ni cấy tế bào VERO kiểm tra độc tố E.coli O157:H7 Hình Kiểm tra bệnh tích tế bào VERO độc tố vi khuẩn Hình Hình ảnh ni cấy tế bào lai sau tách dịng Hình Hình ảnh tế bào u tủy chuột dịng Sp 2/0-Ag14 Hình Hình 10 Hai khuẩn lạc tế bào lai giếng nuôi sau tách dòng (giếng lai bị loại) Khuẩn lạc tế bào lai sau tách dòng 156 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TĂT ADN : Acid deoxyribonucleic ARN : Acid ribonucleic ARNr : Acid ribonucleic ribosome BHI : Brain Heart Infusion ĐTB : Đại thực bào E.coli O157:H7 : Escherichia coli O157:H7 EPEC : Enteropathogenic E.coli ETEC : Enterotoxigenic E.coli EIEC : Enteroinvasine E.coli EAEC : Enteroaggregative E.coli EHEC : Enterohaemorhagic E.coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid CDC : Center for Disease Control and Prevetion Cl : Clorua CFU : Colony Forming Unit ELISA : Enzyme Link Immunosorbent Assay FAO : Food and Agriculture Organization FDA : Food and Drug Administration FCA : Freund's Complete Ajuvant FCS : Fetal Carf Serum FIA : Freund's incomplete Ajuvant KIA : Kligler Iron Agar LB : Luria Agar LPS : Lipopolysaccharide Kda : Kilo Dalton 157 Kb : Kilobase HAT : Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine HT : Hypoxanthine, Thymidine JICA : Japan International Cooperation Agency Kháng nguyên O: Kháng nguyên thân Kháng nguyên H: Kháng nguyên lông Kháng nguyên K: Kháng nguyên giáp mô LT : heat-labile toxin HGKT : Hiệu giá kháng thể HUS : Haemolytic Ureamic Syndrome MDCS : miễn dịch sở Na : Natri OPI : oxaloacetate, pyruvate, bovine insulin PCR : Polymerase Chain Reaction PBS : Phosphate buffer saline PEG : polyethylene glycol SMAC : Sorbitol MacConkey ST : Heat stable toxin Stx : Shiga toxin TBL : tế bào lai USDA : United States Department of Agriculture Wzx : Gen mã hóa kháng nguyên thân Wzy : Gen trùng hợp kháng nguyên thân ... Escherichia coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội, nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn đòng đặc hiệu? ?? Mục tiêu đề tài - Xác định tỷ lệ nhiễm E .coli O157:H7 thịt bò bán số địa điểm Hà Nội; - Sản xuất. .. kết kháng nguyên (Burioni, 1998) [23] Hình 1.7 Các loại kháng thể đơn dòng tái tổ hợp Kể từ bắt đầu nghiên cứu thành công, kháng thể đơn dòng tái tổ hợp thể ưu điểm so với kháng thể đơn dòng. .. khả sản sinh kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên H7 - Kiểm tra tính đặc hiệu kháng thể đơn dòng với vi khuẩn E .coli O157:H7 lựa chọn dịng có độ đặc hiệu cao, ổn định cho mục đích chẩn đốn, xác định