NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH ( LA tiến sĩ)

Đề tài Cấp Nhà nước KC07.0211 15:“Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” do PGS. TS. Vũ Ngọc Bội chủ trì và đã được Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng trong Luận án. Các số liệu,kết quả nêu trong Luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào trước đó.

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ KHÁNH HÒA - 2018 BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành : Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Trần Thị Luyến PGS TS Vũ Ngọc Bội KHÁNH HÒA - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thực từ kinh phí Đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15:“Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” PGS TS Vũ Ngọc Bội chủ trì Chủ nhiệm đề tài cho phép sử dụng Luận án Các số liệu, kết nêu Luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Tác giả luận án LỜI CẢM ƠN Để hồn thành Luận án này, Trước hết, tơi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Lãnh đạo Khoa Sau đại học Ban Chủ nhiệm khoa Cơng nghệ Thực phẩm lòng biết ơn niềm tự hào học tập Trường năm qua Lòng biết ơn sâu sắc xin gửi tới GS TS Trần Thị Luyến – nguyên Phó Hiệu trưởng Trường Đại học Nha Trang PGS TS Vũ Ngọc Bội - Trưởng khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ, tơi suốt q trình thực Luận án Xin chân thành cám ơn PGS TS Vũ Ngọc Bội - Chủ nhiệm đề tài Cấp Nhà nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩm oligosaccharid (oligochitin oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” tạo điều kiện kinh phí để Luận án hồn thành có chất lượng Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn PGS TS Đàm Sao Mai - Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Trường Đại học Cơng nghiệp TP Hồ Chí Minh thầy cô Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tận tình giúp đỡ tơi q trình thực luận án Xin chân thành cám ơn PGS TS Trang Sĩ Trung - Hiệu trưởng - Trường Đại học Nha Trang, PGS TS Nguyễn Anh Tuấn, TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo Bộ môn Công nghệ Chế biến, TS Nguyễn Thị Mỹ Hương - Trưởng Bộ môn Công nghệ Sau thu hoạch - Khoa Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang, PGS TS Ngô Đăng Nghĩa - Giám đốc - Viện Công nghệ Sinh học Môi trường thầy cô phản biện cho tơi lời khun q báu để Luận án hồn thành có chất lượng Xin chân thành cám ơn thầy giáo phòng thí nghiệm - Trung tâm Thực hành Thí nghiệm thầy giáo khoa Công nghệ Thực phẩm -Trường Đại học Nha Trang giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực Luận án Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè quan tâm, động viên, tơi chia sẻ khó khăn suốt thời gian thực Luận án DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ANOVA: Phân tích phương sai (Analysis of variance) AOAC: Hiệp hội nhà hố phân tích thống (Association of Official Analytical Chemists) BSA: Huyết bò (Bovine Serum Albumin) BHI: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật BHI (Brain Heart Infusion) COSY: Phổ tương quan proton-proton (Correlation Spectroscopy) COS: Chitooligosaccharides CTS: Chitosan DA: Độ acetyl (Degree of Acetylation) DD: Độ deacetyl (Degree of Deacetylation) DPPH: 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid GlcN: D-glucosamine GlcNAc: N-acetyl glucosamine GPC: Sắc ký gel thấm qua (Gel Permeation Chromatography) HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao (High Performance Liquid Chromatography) HQKK: Hiệu khử khoáng HQKP: Hiệu khử protein HSQC: Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết (Heteronuclear Single Quantum Correlation) LMWC: Chitosan khối lượng phân tử thấp (Low Molecular Weight Chitosan) MHS: Phương trình Mark-Houwink-Sakurada MIC: Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration) MRS: Môi trường nuôi cấy vi sinh vật (de Man, Rogosa, Sharpe) Mw: Phân tử lượng trung bình khối lượng Mv: Phân tử lượng trung bình thể tích NAG: N- acetyl glucosamine NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) OD: Mật độ quang (Optical Density) Phổ IR: Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) TCA: Trichloroacetic acid TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam X-ray: Tia X MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH xii DANH MỤC BẢNG xvii TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xix MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN 1.1.1 Giới thiệu chitin, chitosan oligochitosan 1.1.1.1 Chitin chitosan 1.1.1.2 Oligochitosan 1.1.2 Phương pháp sản xuất chitin chitosan 1.1.3 Phương pháp sản xuất oligochitosan 19 1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN 30 1.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ BIẾN ĐỔI VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TÔM SAU THU HOẠCH 32 1.3.1 Cơ sở lý thuyết biến đổi tôm sau thu hoạch 32 1.3.2 Phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch 34 1.4 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT BỨC XẠ 37 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 39 2.1.1 Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan 39 2.1.2 Tôm bạc biển 39 2.1.3 Enzyme protease 39 2.1.4 Nguyên vật liệu để xác định độc chất học 39 2.1.5 Giống vi khuẩn 40 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 40 2.2.2 Các phương pháp phân tích hóa học 46 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 48 2.2.4 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn 48 2.2.4.1 Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic 48 2.2.4.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật 49 2.2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm oligochitosan 49 2.2.5 Phương pháp xác định độc chất học 50 2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 51 2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 52 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 53 3.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM 53 3.2 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ TẠP CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRONG SẢN XUẤT CHITIN 53 3.2.1 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME PROTEASE 53 3.2.1.1 Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease 53 3.2.1.2 Nghiên cứu khử protein lại đầu vỏ tơm NaOH lỗng khử khống HCl lỗng 60 3.2.1.3 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein 63 3.2.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT 65 3.2.2.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp 65 3.2.2.2 Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 để khử protein tạp chất 70 3.2.2.3 Nghiên cứu khử protein lại bán chế phẩm chitin enzyme flavourzyme 80 3.2.2.4 Nghiên cứu khử khống lại chitin thô HCl 82 3.2.2.5 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 để khử protein tạp chất 84 3.2.2.6 Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử vi khuẩn lactic để khử proteinvà tạp chất 86 3.3 NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO 88 3.3.1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NAOH THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN 88 3.3.2 XÁC ĐỊNH THỜI GIAN DEACETYL 89 3.3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO 93 3.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT BỨC XẠ COBAN 60 97 3.4.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN TRONG DUNG DỊCH ACID 97 3.4.2 XÁC ĐỊNH LIỀU XẠ THÍCH HỢP CHO VIỆC CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO OLIGOCHITOSAN 99 3.4.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITOSAN SAU KHI CHIẾU XẠ 102 3.4.4 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA CO-60 103 3.4.5 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA OLIGOCHITOSAN SẢN XUẤT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG BỨC XẠ ĐỂ PHÂN CẮT CHITOSAN 105 3.4.5.1 Đánh giá thành phần phân đoạn chế phẩm chiếu xạ chitosan 105 3.4.5.2 Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc sản phẩm sau chiếu xạ chitosan 106 3.4.5.3 Xác định khối lượng phân tử cấu trúc oligochitosan 109 3.4.6 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA OLIGOCHITOSAN 114 3.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm oligochitosan phương pháp MIC 114 3.4.6.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm oligochitosan phương pháp nuôi cấy đĩa thạch 115 3.4.7 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH HỒN THIỆN SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA COBAN 60 116 3.4.8 THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN CHUỘT LANG THÍ NGHIỆM 117 3.5 SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU 125 3.5.1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ OLIGOCHITOSAN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN TƠM 125 3.5.2 XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU BẰNG OLIGOCHITOSAN 129 3.5.2.1 Xác định thời gian nhúng tôm nguyên liệu dung dịch oligochitosan 129 3.5.2.2 Xác định chế độ bao gói thích hợp để bảo quản tôm bạc oligochitosan 134 3.5.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN TƠM BẰNG OLIGOCHITOSAN 140 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 142 TÀI LIỆU THAM KHẢO 145 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Công thức cấu tạo chitin chitosan Hình 1.2 Cơng thức cấu tạo oligochitosan .6 Hình 1.3 Phương trình phản ứng deacetyl chitin 13 Hình 1.4 Quy trình sản xuất chitin chitosan theo phương pháp hóa học .16 Hình 1.5 Sản xuất chitin chitosan theo phương pháp sinh học .17 Hình 1.6 Một số phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan .20 Hình 1.7 Quy trình sản xuất oligochitosan theo phương pháp hóa học .22 Hình 1.8 Sơ đồ thủy phân chitin chitosan enzyme 23 Hình 1.9 Quá trình biến đổi chitosan chiếu xạ 26 Hình 1.10 Sơ đồ chế bắt hydro gốc tự hydroxyl 26 Hình 1.11 Sự suy giảm khối lượng phân tử chitosan chiếu xạ tia gamma Co60 theo liều xạ 27 Hình 1.12 Cơ chế hình thành biến đen tơm 33 Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41 Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm khử protein tạp chất đầu vỏ tôm enzyme protease 42 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm khử protein lên men vi khuẩn lactic 43 Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm so sánh khả khử protein 43 Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm deacetyl chitin để thu nhận chitosan 44 Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm sản xuất chế phẩm oligochitosan phương pháp sử dụng xạ Co -60 45 Hình 2.7 Bố trí thí nghiệm bảo quản tơm nguyên liệu 45 Hình 2.8 Quy trình hoạt hóa vi khuẩn lactic 48 Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tơm phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme 63 Hình 3.2 Bán chế phẩm chitin sau khử protein enzyme flavourzyme 65 Hình 3.3 Sản phẩm chitin sản xuất phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme 65 Hình 3.4 Sự thay đổi độ đục dịch ni cấy vi khuẩn theo thời gian 66 Hình 3.5 Dịch vi khuẩn L plantarum sau 28 h nuôi cấy .66 xii ... dẫn khoa học, thực luận án Nghiên cứu sản xuất oligochitosan ứng dụng bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch Mục tiêu chung luận án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng...BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành... ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan ứng dụng bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: ThS Vũ Thị