Nghiên cứu sản xuất Oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

MỞ ĐẦU Những năm qua, ngành thuỷ sản đã phát triển và vươn lên thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước. Chiến lược phát triển xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam phấn đấu đến năm 2020 đạt mức 10 tỷ USD, đưa Việt Nam trở thành một trong bốn cường quốc hàng đầu về xuất khẩu thuỷ sản. Theo định hướng này, chính phủ Việt Nam có chiến lược tăng cường đầu tư cho khai thác, bảo quản nguyên liệu thủy sản đánh bắt xa bờ vừa góp phần phát triển kinh tế biển vừa giữ vững chủ quyền biển đảo. Hiện nay việc bảo quản nhiều loại nguyên liệu thủy sản như cá, tôm, mực... sau thu hoạch còn nhiều hạn chế. Theo quy định HACCP, để đảm bảo chất lượng, nguyên liệu thủy sản cần được bảo quản bằng phương pháp ướp đá đủ để giữ nhiệt độ của nguyên liệu ≤ 4 1 o C. Tuy vậy, người dân thường không có đủ dụng cụ, thiết bị và các điều kiện để bảo quản nguyên liệu thủy sản đúng cách nên thường có xu thế lạm dụng các loại kháng sinh và các loại phụ gia độc hại như hàn the, urea... trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạng nguyên liệu thủy sản chứa dư lượng các chất bảo quản và không bảo đảm yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm. Một trong các hướng bảo quản nguyên liệu thủy sản đang được các nhà nghiên cứu quan tâm là sử dụng các tác nhân sinh học có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại và có khả năng ức chế sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản. Oligochitosan là tác nhân sinh học có nguồn gốc từ vỏ tôm, không độc hại và có khả năng kháng khuẩn. Oligochitosan đã được các nhà nghiên cứu nhất là các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang quan tâm nghiên cứu sử dụng trong bảo quản các loại nguyên liệu thủy sản. Theo hướng nghiên cứu này, dưới sự tài trợ của đề tài cấp nhà nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm oligosaccharide (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn khoa học, tôi thực hiện luận án “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch”. Mục tiêu của chung của luận án Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển. Mục tiêu cụ thể - Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng trong quá trình này. - Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn. - Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan sản xuất được trong bảo quản tôm biển. Nội dung của luận án 1) Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và các tạp chất có trong đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất chitin. 2) Nghiên cứu deacetyl chitin để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao. 3) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60. 4) Sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu. Ý nghĩa khoa học của luận án Luận án nghiên cứu một cách đầy đủ từ quá trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp sinh học đến sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt độ thường và sản xuất oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60. Điểm mới của luận án là lần đầu tiên luận án công bố sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt độ thường và luận án cũng lần đầu tiên sản xuất oligochitosan bằng kỹ thuật sử dụng bức xạ coban 60 để phân cắt chitosan và ứng dụng oligochitosan thu được trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu. Ngoài ra, luận án cũng lần đầu tiên nghiên cứu đánh giá độc tính của oligochitosan sau chiếu xạ trên chuột thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu của luận án đã góp phần làm phong phú thêm các hiểu biết về việc ứng dụng kỹ thuật bức xạ coban 60 trong sản xuất oligochitosan dùng làm phụ gia trong bảo quản tôm nguyên liệu. Mặt khác kết quả nghiên cứu của luận án còn là tài liệu tham khảo cho nghiên cứu sinh, học viên cao học và những ai quan tâm, nghiên cứu về lĩnh vực này. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Kết quả của luận án cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan sản xuất bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60 để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc. Kết quả nghiên cứu của luận án có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần tham gia giải quyết tình trạng lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đồng thời góp phần bảo vệ môi trường do sử dụng phương pháp sản xuất sinh học để sản xuất chitin nên thân thiện với môi trường. 2

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

VŨ THỊ HOAN

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN

LIỆU SAU THU HOẠCH

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

KHÁNH HÒA - 2018

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH xii

DANH MỤC BẢNG xvii

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN xix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN 3

1.1.1 Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan 3

1.1.1.1 Chitin và chitosan 3

1.1.1.2 Oligochitosan 5

1.1.2 Phương pháp sản xuất chitin và chitosan 6

1.1.3 Phương pháp sản xuất oligochitosan 19

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN 30

1.3 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ BIẾN ĐỔI VÀ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN TÔM SAU THU HOẠCH 32

1.3.1 Cơ sở lý thuyết về biến đổi của tôm sau thu hoạch 32

1.3.2 Phương pháp bảo quản tôm sau thu hoạch 34

1.4 GIỚI THIỆU VỀ KỸ THUẬT BỨC XẠ 37

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 39

2.1.1 Đầu vỏ tôm dùng sản xuất oligochitosan 39

2.1.2 Tôm bạc biển 39

2.1.3 Enzyme protease 39

2.1.4 Nguyên vật liệu để xác định độc chất học 39

2.1.5 Giống vi khuẩn 40

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

2.2.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm 40

2.2.2 Các phương pháp phân tích hóa học 46

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme protease 48

2.2.4 Phương pháp nghiên cứu vi khuẩn 48

2.2.4.1 Phương pháp thu sinh khối vi khuẩn lactic 48

2.2.4.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật 49

2.2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan 49

2.2.5 Phương pháp xác định độc chất học 50

2.3 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ CHỦ YẾU SỬ DỤNG TRONG LUẬN ÁN 51

2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 52

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 53

3.1 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CƠ BẢN CỦA PHẾ LIỆU ĐẦU VỎ TÔM 53

3.2 NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ TẠP CHẤT Ở ĐẦU VỎ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG TRONG SẢN XUẤT CHITIN 53

3.2.1 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ENZYME PROTEASE 53

3.2.1.1 Nghiên cứu lựa chọn enzyme protease 53

3.2.1.2 Nghiên cứu khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm bằng NaOH loãng và khử khoáng bằng HCl loãng 60

3.2.1.3 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme khử protein 63

3.2.2 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITIN TỪ ĐẦU VỎ TÔM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN LACTIC ĐỂ KHỬ PROTEIN VÀ CÁC TẠP CHẤT 65

3.2.2.1 Lựa chọn chủng vi khuẩn lactic thích hợp 65

3.2.2.2 Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất 70

3.2.2.3 Nghiên cứu khử protein còn lại ở bán chế phẩm chitin bằng enzyme flavourzyme 80

3.2.2.4 Nghiên cứu khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl 82

3.2.2.5 Đề xuất quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất 84

3.2.2.6 Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử vi khuẩn lactic để khử proteinvà các tạp chất 86

3.3 NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO 88

3.3.1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ NAOH THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH DEACETYL CHITIN 88 3.3.2 XÁC ĐỊNH THỜI GIAN DEACETYL 89

3.3.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO 93

3.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT

BỨC XẠ COBAN 60 97

3.4.1 XÁC ĐỊNH ĐỘ HÒA TAN CỦA CHITOSAN TRONG DUNG DỊCH ACID 97

3.4.2 XÁC ĐỊNH LIỀU XẠ THÍCH HỢP CHO VIỆC CẮT MẠCH CHITOSAN TẠO OLIGOCHITOSAN 99

3.4.3 TÁCH PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITOSAN SAU KHI CHIẾU XẠ 102

3.4.4 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA CO-60 103

3.4.5 NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA OLIGOCHITOSAN SẢN XUẤT BẰNG CÁCH SỬ DỤNG BỨC XẠ ĐỂ PHÂN CẮT CHITOSAN 105

3.4.5.1 Đánh giá thành phần các phân đoạn của chế phẩm chiếu xạ chitosan 105

3.4.5.2 Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc của sản phẩm sau chiếu xạ chitosan 106

3.4.5.3 Xác định khối lượng phân tử và cấu trúc của oligochitosan 109

3.4.6 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA OLIGOCHITOSAN 114 3.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp MIC 114

3.4.6.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch 115

3.4.7 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH HOÀN THIỆN SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG BỨC XẠ GAMMA COBAN 60 116

3.4.8 THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA OLIGOCHITOSAN TRÊN CHUỘT LANG THÍ NGHIỆM 117

3.5 SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU 125

3.5.1 XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ OLIGOCHITOSAN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH BẢO QUẢN TÔM 125

3.5.2 XÁC ĐỊNH CHẾ ĐỘ BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU BẰNG OLIGOCHITOSAN 129 3.5.2.1 Xác định thời gian nhúng tôm nguyên liệu bằng dung dịch oligochitosan 129

3.5.2.2 Xác định chế độ bao gói thích hợp để bảo quản tôm bạc bằng oligochitosan 134

3.5.3 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BẢO QUẢN TÔM BẰNG OLIGOCHITOSAN 140

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 142

TÀI LIỆU THAM KHẢO 145

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin và chitosan 4

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của oligochitosan 6

Hình 1.3 Phương trình phản ứng deacetyl chitin 13

Hình 1.4 Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học 16

Hình 1.5 Sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp sinh học 17

Hình 1.6 Một số phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan 20

Hình 1.7 Quy trình sản xuất oligochitosan theo phương pháp hóa học 22

Hình 1.8 Sơ đồ thủy phân chitin và chitosan bằng enzyme 23

Hình 1.9 Quá trình biến đổi của chitosan khi chiếu xạ 26

Hình 1.10 Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl 26

Hình 1.11 Sự suy giảm khối lượng phân tử của chitosan được chiếu xạ tia gamma Co-60 theo liều xạ 27

Hình 1.12 Cơ chế hình thành biến đen của tôm 33

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 41

Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm khử protein và tạp chất ở đầu vỏ tôm bằng enzyme protease 42 Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm khử protein bằng lên men vi khuẩn lactic 43

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm so sánh khả năng khử protein 43

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm deacetyl chitin để thu nhận chitosan 44

Hình 2.6 Bố trí thí nghiệm sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng phương pháp sử dụng bức xạ Co -60 45

Hình 2.7 Bố trí thí nghiệm bảo quản tôm nguyên liệu 45

Hình 2.8 Quy trình hoạt hóa vi khuẩn lactic 48

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme 63

Hình 3.2 Bán chế phẩm chitin sau khi khử protein bằng enzyme flavourzyme 65

Hình 3.3 Sản phẩm chitin sản xuất bằng phương pháp sử dụng enzyme flavourzyme 65

Hình 3.4 Sự thay đổi độ đục của dịch nuôi cấy vi khuẩn theo thời gian 66

Hình 3.5 Dịch vi khuẩn L plantarum sau 28 h nuôi cấy 66

Hình 3.6 Khuẩn lạc vi khuẩn L plantarum mọc trên đĩa thạch 66

Hình 3.7 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm 67Hình 3.8 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm 68Hình 3.9 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm 69

Hình 3.10 Ảnh hưởng của tỷ lệ dịch vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung đến

hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ tôm 71Hình 3.11 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu

vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 72

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH môi trường tới hiệu quả khử khoáng và protein đầu vỏ

tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 73

Hình 3.13 Ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường bổ sung đến hiệu quả khử khoáng và protein đầu

vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 75

Hình 3.14 Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi

khuẩn đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L plantarum 78

Hình 3.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và tỷ lệ dịch vi khuẩn đến hiệu quả khử protein

bằng vi khuẩn L plantarum 78

Hình 3.16 Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên

men đến hiệu quả khử protein bằng vi khuẩn L plantarum 79

Hình 3.17 Ảnh hưởng của tỷ lệ rỉ đường và thời gian lên men đến hiệu quả khử protein

bằng vi khuẩn L plantarum 79

Hình 3.18 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme flavourzyme bổ sung đến hàm lượng protein còn lại ở chitin thô 81Hình 3.19 Ảnh hưởng của thời gian khử protein bằng enzyme flavourzyme đến hàm lượng protein còn lại ở chitin thô 82Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hàm lượng khoáng còn lại ở chế phẩm chitin 83Hình 3.21 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu quả khử khoáng còn lại ở chitin thô bằng HCl 84Hình 3.22 Quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm bằng phương pháp sử dụng vi khuẩn

lactic L plantarum VTCC-B 431 để khử protein và các tạp chất 85

Hình 3.23 Chitin sản xuất theo quy trình khử protein chỉ bằng enzyme flavourzyme 87

Hình 3.24 Chitin sản xuất theo quy trình khử protein và tạp chất bằng vi khuẩn lactic 87Hình 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ deacetyl của chitosan 88Hình 3.26 Ảnh hưởng của thời gian xử lý NaOH đến độ deacetyl của chitosan 89Hình 3.27 Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 50% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường 90Hình 3.28 Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 45% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường 90Hình 3.29 Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 40% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường 91Hình 3.30 Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 35% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường 91Hình 3.31 Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin bằng NaOH 30% trong 120 giờ ở nhiệt độ thường 92Hình 3.32 Phổ FTIR của chitosan thu được khi thực hiện deacetyl chitin trong 120 giờ bằng NaOH ở các nồng độ: a: NaOH 50%; b: NaOH 45%; c: NaOH 40%; d: NaOH 35%; e: NaOH 30% 92

50% trong 120 giờ 93

Hình 3.34 Quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl trên 90% từ đầu vỏ tôm 94

Hình 3.35 Ảnh hưởng của các acid và nồng độ acid đến khả năng hòa tan của chitosan 97Hình 3.36 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng hòa tan của chitosan trong dung dịch CH3COOH 1% 98Hình 3.37 Ảnh hưởng của liều xạ đến độ nhớt của dung dịch chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng vẩy) 99Hình 3.38 Ảnh hưởng của liều xạ đến độ nhớt dung dịch chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng dung dịch) 99Hình 3.39 Ảnh hưởng của liều xạ đến khối lượng phân tử chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng vẩy) 100Hình 3.40 Ảnh hưởng của liều xạ đến khối lượng phân tử chế phẩm sau chiếu xạ (chitosan dạng dung dịch) 100

Hình 3.41 Hình ảnh về các phân đoạn oligochitosan với liều chiếu 50 kGy 103

Hình 3.42 Quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60 104

Hình 3.43 Phổ FTIR của chitosan 106

Hình 3.44 Phổ FTIR của oligochitosan phân đoạn 1 107

Hình 3.45 Phổ FTIR của oligochitosan phân đoạn 3 107

Hình 3.46 Phổ 1H-NMR chế phẩm oligochitosan phân đoạn 2 111

Hình 3.47 Phổ 13C-NMR 112

Hình 3.48 Phổ HSQC 112

Hình 3.49 Phổ COSY 113

Hình 3.50 Cấu trúc hóa học của oligochitosan 113

Hình 3.51 Một số hình ảnh về khả năng ức chế vi khuẩn của oligochitosan 116

Hình 3.52 Quy trình sản xuất oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60 117

Hình 3.53 Trọng lượng tươi trung bình của gan, lách, thận (chuột lang nhóm I) 123

Hình 3.54 Trọng lượng tươi trung bình của gan, lách, thận (chuột lang nhóm II) 123

Hình 3.55 Hình ảnh vi thể của gan, lách, thận chuột lang uống oligochitosan 124

Hình 3.56 Hình ảnh dạ dày chuột đối chứng (Bên ngoài bình thường, bên trong bình thường) 124

Hình 3.57 Hình ảnh dạ dày chuột uống oligochitosan (Bên ngoài bình thường, bên trong bình thường) 124

Hình 3.58 Ảnh hưởng của nồng độ oligochitosan đến chất lượng cảm quan của tôm 126

Hình 3.59 Ảnh hưởng của nồng độ dung dịch oligochitosan đến hàm lượng NH3 trong tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh 127

Hình 3.60 Sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa tổng của tôm nguyên liệu được xử lý bằng oligochitosan ở các nồng độ, sau 6 ngày bảo quản 128

Hình 3.61 Sự biến đổi pH của tôm được xử lý bằng oligochitosan ở các nồng độ, sau 6 ngày bảo quản 129

Hình 3.62 Ảnh hưởng của thời gian nhúng đến chất lượng cảm quan tôm bảo quản bằng oligochitosan 1% 130

Hình 3.63 Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi hàm lượng NH3 của tômnguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0-4oC 131

Hình 3.64 Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC 133

Hình 3.65 Ảnh hưởng của thời gian nhúng oligochitosan đến sự biến đổi pH của tôm

nguyên liệu theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC 134Hình 3.66 Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến các tổng điểm cảm quan chung của tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh 135

nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh 136Hình 3.68 Ảnh hưởng của chế độ bao gói đến sự biến đổi hoạt tính chống oxy hóa của

tôm nguyên liệu theo thời gian bảo quản lạnh 137

Hình 3.69 Ảnh hưởng chế độ bao gói đến sự biến đổi pH của tôm theo thời gian bảo quản ở 0 – 4oC 138Hình 3.70 Sự thay đổi tổng số vi sinh vật hiếu khí trên tôm sau 6 ngày bảo quản nếu bảo quản có và không có oligochitosan bề mặt 140Hình 3.71 Sơ đồ quy trình bảo quản tôm nguyên liệu bằng oligochitosan 141

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Hàm lượng chitin và canxi carbonat trong một số loại tôm 3

Bảng 1.2 Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguồn phế liệu tôm 7

Bảng 1.3 Các điều kiện để khử khoáng trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm 10

Bảng 1.4 Điều kiện tẩy màu chitin từ phế liệu tôm thẻ 12

Bảng 1.5 Điều kiện deacetyl thường dùng đối với chitin từ phế liệu tôm 14

Bảng 2.1 Thiết kế nghiên cứu độc tính của oligochitosan 50

Bảng 2.2 Các tiêu chí đánh giá kết quả trong nghiên cứu độc tính 51

Bảng 3.1 Thành phần hoá học cơ bản của phế liệu tôm thẻ 53

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của enzyme và tỷ lệ enzyme đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm 54

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của enzyme và pH đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm thẻ chân trắng 56 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của enzyme và nhiệt độ đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm 57 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của enzyme và thời gian đến hiệu suất khử protein đầu vỏ tôm 59 Bảng 3.6 Chất lượng của chitinsản xuất theo quy trình sử dụng enzyme protease để khử protein 60

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ NaOH và thời gian xử lý đến hàm lượng protein còn lại ở đầu vỏ tôm 61

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nồng độ acid HCl và thời gian xử lý đến hàm lượng khoáng còn lại ở đầu vỏ tôm 62

Bảng 3.9 Chất lượng cơ bản của chitin thu được theo quy trình kết hợp sử dụng enzyme flavourzyme 64

Bảng 3.10 Quy hoạch thực nghiệm 3 yếu tố theo mô hình Box - Behnken 75

Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của quá trình lên men khử protein bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B431 76

Bảng 3.12 Quy hoạch thực nghiệm với biến thật của quá trình lên men khử protein đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum 77

Bảng 3.13 Tiên đoán một số thí nghiệm tối ưu cho quá trình lên men 79

Bảng 3.14 Kết quả tối ưu theo tiên đoán và kết quả thực nghiệm kiểm chứng số liệu tối ưu hóa 80 Bảng 3.15 So sánh chất lượng chitin sản xuất theo các quy trình đã nghiên cứu và quy

trình tham khảo 86

Bảng 3.16 So sánh đánh giá chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình đã đề xuất và quy trình tham khảo 96

Bảng 3.17 Kết quả tách phân đoạn chế phẩm oligochitosan sau chiếu xạ 102

Bảng 3.18 Kết quả tách phân đoạn chế phẩm chitosan sau chiếu xạ 105

Bảng 3.19 Đặc trưng nhóm chức của các mẫu chitin, chitosan và phân đoạn oligochitosan 108

Bảng 3.20 Kết quả xác định phổ sắc ký gel thấm qua (GPC) chế phẩm chitosan chiếu xạ với liều xạ khác nhau 109

Bảng 3.21 Kết quả xác định nồng độ pha loãng thấp nhất ức chế vi khuẩn phát triển 114

Bảng 3.22 Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn trên đĩa thạch 115

Bảng 3.23 Trọng lượng trung bình của chuột lang nhóm I (đánh giá độc tính cấp) 118

Bảng 3.24 Trọng lượng trung bình của chuột lang nhóm II (giai đoạn hồi phục) 118

Bảng 3.25 Kết quả sinh hóa nước tiểu của chuột lang nhóm I 119

Bảng 3.26 Kết quả sinh hóa nước tiểu của chuột lang nhóm II 120

Bảng 3.27 Kết quả sinh hóa huyết học của chuột lang nhóm I 121

Bảng 3.28 Kết quả sinh hóa huyết học của chuột lang nhóm II 122

TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo

quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch

Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản

là 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w), tỷ lệ dịch vi khuẩn L plantarum VTCC-B

431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men ở nhiệt độ phòng, trong thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu là 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein còn lại ở đầu vỏ tôm thẻ chân trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50 o C ở pH 7,5, trong thời gian 8h Sử dụng acid HCl 3% khử khoáng còn lại ở chitin thô với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thô: 2/1 Quá trình khử khoáng còn lại thực hiện ở nhiệt độ phòng trong thời gian 10h Chitin sản xuất có chi phí nguyên vật liệu là 111.000 đồng/kg

Quy trình sản xuất này giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng nên giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường Mặt khác sản phẩm phụ: protein, astaxanthin, tách ra từ quá trình lên men đầu vỏ tôm bằng vi khuẩn L plantarum VTCC-B431 hoàn toàn có thể sử dụng làm thức ăn chăn nuôi Do vậy, quy trình sản xuất này vừa có ý nghĩa khoa học và vừa có

ý nghĩa thực tiễn lớn trong bảo vệ môi trường đồng thời tạo ra sản phẩm chitin theo sản xuất theo phương pháp sinh học “xanh” và “sạch” hơn

2) Luận án đã xác định được các thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan

có độ deacetyl trên 90%: deacetyl chitin bằng NaOH 50% ở nhiệt độ phòng trong thời gian 120h và tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1 Chitosan sản xuất theo quy trình

có độ deacetyl trên 93% và có chi phí nguyên vật liệu là 361.365 đ/kg

Đóng góp mới của kỹ thuật này ở chỗ quá trình deacetyl chitin thành chitosan được tiến hành ở nhiệt độ phòng mà không sử dụng nhiệt độ cao như các phương pháp khác Vì thế về mặt công nghệ, quy trình sản xuất sẽ đơn giản và dễ thực hiện hơn Do vậy, công nghệ này có thể dễ dàng triển khai trong thực tế sản xuất ở quy mô lớn - đây chính là điều các doanh nghiệp chế biến chitosan từ đầu vỏ tôm đang mong muốn 3) Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có khả năng kháng

5 loại vi khuẩn: E coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S aureus, B subtilis và Listeria monocytogenes

Việc sản xuất oligochitosan theo kỹ thuật sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy có ưu điểm là sản phẩm sau phân cắt không cần phải kết tủa bằng cồn, tinh sạch và sấy khô như các phương pháp phân cắt chitosan thành oligochitosan bằng enzyme và hóa học Mặt khác, sản phẩm oligochitosan lại có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn và dễ bảo quản, vận chuyển Do vậy về mặt công nghệ, phương pháp này

có tính khả thi cao và dễ dàng triển khai sản xuất đại trà chế phẩm oligochitosan 4) Luận án đã xác định được cấu trúc phân tử của oligochitosan có 13 monomer 5) Luận án đã tiến hành thử nghiệm độc tính của oligochitosan trên chuột thí nghiệm và phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách của chuột sử dụng oligochotosan cho thấy oligochitosan hoàn toàn an toàn và không gây độc cho chuột qua con đường tiêu hóa cũng như không có bất cứ một ảnh hưởng nào tới các nội quan của chuột

Đây là nghiên cứu đầu tiên tiến hành thử nghiệm oligochitosan trên chuột thí nghiệm Việc thử nghiệm đã chứng minh rằng chế phẩm oligochitosan sản xuất theo kỹ thuật phân cắt chitosan bằng bức xạ gamma coban 60 hoàn toàn an toàn với chuột thí

nghiệm tức là an toàn với con người - đây chính là một hướng mới trong sản xuất và sử dụng oligochitosan cho lĩnh vực thực phẩm và dược học

6) Luận án đã nghiên cứu và xây dựng quy trình bảo quản tôm bạc biển bằng cách nhúng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% trong thời gian 1 phút Tôm bạc nguyên liệu sau xử lý oligochitosan 1% có thể bảo quản 6 ngày trong điều kiện mát mà vẫn đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến

Nghiên cứu này cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan trong bảo quản thủy sản - nghiên cứu này nếu được triển khai trong thực tế sẽ góp hạn chế việc lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH

GS TS Trần Thị Luyến PGS TS Vũ Ngọc Bội Vũ Thị Hoan

MỞ ĐẦU

Những năm qua, ngành thuỷ sản đã phát triển và vươn lên thành một trong những ngành kinh tế mũi nhọn của cả nước Chiến lược phát triển xuất khẩu thuỷ sản Việt Nam phấn đấu đến năm 2020 đạt mức 10 tỷ USD, đưa Việt Nam trở thành một trong bốn cường quốc hàng đầu về xuất khẩu thuỷ sản Theo định hướng này, chính phủ Việt Nam

có chiến lược tăng cường đầu tư cho khai thác, bảo quản nguyên liệu thủy sản đánh bắt

xa bờ vừa góp phần phát triển kinh tế biển vừa giữ vững chủ quyền biển đảo Hiện nay việc bảo quản nhiều loại nguyên liệu thủy sản như cá, tôm, mực sau thu hoạch còn nhiều hạn chế Theo quy định HACCP, để đảm bảo chất lượng, nguyên liệu thủy sản

Tuy vậy, người dân thường không có đủ dụng cụ, thiết bị và các điều kiện để bảo quản nguyên liệu thủy sản đúng cách nên thường có xu thế lạm dụng các loại kháng sinh và các loại phụ gia độc hại như hàn the, urea trong bảo quản nguyên liệu thủy sản gây nên tình trạng nguyên liệu thủy sản chứa dư lượng các chất bảo quản và không bảo đảm yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm Một trong các hướng bảo quản nguyên liệu thủy sản đang được các nhà nghiên cứu quan tâm là sử dụng các tác nhân sinh học có nguồn gốc

tự nhiên, không độc hại và có khả năng ức chế sự sinh trưởng phát triển của các vi sinh vật gây hư hỏng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản

Oligochitosan là tác nhân sinh học có nguồn gốc từ vỏ tôm, không độc hại và có khả năng kháng khuẩn Oligochitosan đã được các nhà nghiên cứu nhất là các nhà nghiên cứu tại Trường Đại học Nha Trang quan tâm nghiên cứu sử dụng trong bảo quản các loại nguyên liệu thủy sản Theo hướng nghiên cứu này, dưới sự tài trợ của đề tài cấp nhà

nước KC07.02/11-15: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất và ứng dụng chế phẩm

oligosaccharide (oligochitin và oligochitosan) để bảo quản sau thu hoạch nguyên liệu thuỷ sản đánh bắt xa bờ” và được sự đồng ý của cán bộ hướng dẫn khoa học, tôi thực

hiện luận án “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan và ứng dụng trong bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch”

Mục tiêu của chung của luận án

Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và ứng dụng để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc biển

Mục tiêu cụ thể

- Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp giữa vi khuẩn lactic và enzyme protease

để khử protein và khoáng chất ở đầu vỏ tôm thẻ trong quá trình sản xuất chitin nhằm

giảm thiểu hóa chất sử dụng trong quá trình này

- Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao bằng NaOH nồng độ cao trong điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất ở quy mô lớn

- Sản xuất được oligochitosan bằng công nghệ bức xạ Coban 60 và sử dụng oligochitosan sản xuất được trong bảo quản tôm biển

Nội dung của luận án

1) Nghiên cứu sử dụng phương pháp sinh học để khử protein và các tạp chất có trong đầu và vỏ tôm thẻ chân trắng trong sản xuất chitin

2) Nghiên cứu deacetyl chitin để sản xuất chitosan có độ deacetyl cao

3) Nghiên cứu sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60 4) Sử dụng oligochitosan trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu

Ý nghĩa khoa học của luận án

Luận án nghiên cứu một cách đầy đủ từ quá trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm thẻ chân trắng bằng phương pháp sinh học đến sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt

độ thường và sản xuất oligochitosan có hoạt tính kháng khuẩn bằng kỹ thuật bức xạ Coban 60 Điểm mới của luận án là lần đầu tiên luận án công bố sản xuất chitosan có độ deacetyl cao ở nhiệt độ thường và luận án cũng lần đầu tiên sản xuất oligochitosan bằng

kỹ thuật sử dụng bức xạ coban 60 để phân cắt chitosan và ứng dụng oligochitosan thu được trong bảo quản tôm bạc nguyên liệu Ngoài ra, luận án cũng lần đầu tiên nghiên cứu đánh giá độc tính của oligochitosan sau chiếu xạ trên chuột thí nghiệm Kết quả nghiên cứu của luận án đã góp phần làm phong phú thêm các hiểu biết về việc ứng dụng

kỹ thuật bức xạ coban 60 trong sản xuất oligochitosan dùng làm phụ gia trong bảo quản tôm nguyên liệu Mặt khác kết quả nghiên cứu của luận án còn là tài liệu tham khảo cho nghiên cứu sinh, học viên cao học và những ai quan tâm, nghiên cứu về lĩnh vực này

Ý nghĩa thực tiễn của luận án

Kết quả của luận án cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng oligochitosan sản xuất bằng

kỹ thuật bức xạ Coban 60 để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu tôm bạc Kết quả nghiên cứu của luận án có ý nghĩa thực tiễn cao, góp phần tham gia giải quyết tình trạng lạm dụng hóa chất trong bảo quản nguyên liệu thủy sản, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm đồng thời góp phần bảo vệ môi trường do sử dụng phương pháp sản xuất sinh học

để sản xuất chitin nên thân thiện với môi trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT VỀ SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN 1.1.1 Giới thiệu về chitin, chitosan và oligochitosan

1.1.1.1 Chitin và chitosan

Chitin là loại polysaccharide đầu tiên được con người sản xuất từ nấm vào năm

1811, trước khi phát hiện ra cellulose khoảng 30 năm [37, 76] Năm 1859, Giáo sư C Rouget lần đầu tiến hành xử lý chitin bằng kiềm đặc và thu được một chất mới không giống như chitin, có khả năng hòa tan được trong acid, sau này được người ta gọi là

“chitosan” Thuật ngữ “chitosan” lần đầu tiên được Hoppe Seiler công bố vào năm 1894 khi ông tiến hành deacetyl chitin thành “chitosan” [83] Trong một thời gian dài sau đó, mặc dù chitin vẫn là một polysaccharid tự nhiên, ít được sử dụng thì chitosan lại là một polymer được nhiều nhà khoa học quan tâm do đặc tính sinh học, khả năng dễ dàng thủy phân thành các đơn chất của nó [35, 74, 75, 125]

Chitin có thể được sản xuất từ các nguồn nguyên liệu khác nhau nhưng hiện nay phế liệu vỏ tôm, cua, tôm hùm, nhuyễn thể, mực trong công nghiệp chế biến thủy sản vẫn là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin [118] Do quá trình chế biến tôm, cua, tôm hùm, thường tạo ra một lượng lớn phế liệu, chiếm tới 45% trọng lượng của giáp xác [71, 115, 134] Hàng năm có khoảng hơn hai mươi triệu tấn phế thải từ thủy sản thải ra môi trường, tương đương với khoảng 25% tổng sản lượng thủy sản được chế biến [52]

Tỷ lệ chitin từ nguồn phế liệu thủy sản có thể khác nhau, tùy theo mùa và loài nhưng nhìn chung, xương, vỏ thủy sản chứa khoảng 15% - 40% chitin, 20% - 40% protein, 20% - 50% canxi carbonat và thành phần rất ít các chất khác như sắc tố, chất béo và muối kim loại khác [70]

Bảng 1.1 Hàm lượng chitin và canxi carbonat trong một số loại tôm [70]

Chitin có chứa hàm lượng nitơ hơn 7% khối lượng hoặc khi độ deacetyl của chitin trên 60% thì được gọi là chitosan [56, 98] Chitosan là một dẫn xuất của chitin, được hình thành khi thực hiện quá trình deacetyl hoá chitin (tách nhóm acetyl) khỏi chitin Chitosan là một polyme sinh học gồm các nhóm D-glucosamine (80%) và N-acetyl-D-glucosamine (20%) liên kết với nhau nhờ liên kết β(1 →4) và được mô tả là “vật liệu sinh học đa năng nhất của tạo hóa” là một dẫn xuất chứa rất nhiều nhóm amin Công thức cấu tạo của chitosan gần giống như chitin và cellulose, chỉ khác là chitosan chứa nhóm amin ở cacbon thứ 2 [107] Ở mức độ phân tử, chitin và chitosan có cấu trúc gần giống nhau, cả hai đều có phản ứng hydroxyl và có nhóm amino nhưng chitosan dễ tham gia các phản ứng hơn có thể là do cấu trúc tinh thể của nó ít hơn Trong khi chitin chỉ hòa tan trong một vài dung môi đặc biệt còn chitosan có khả năng hòa tan trong nhiều loại dung dịch acid, chẳng hạn acid formic, acid acetic, [85, 106, 121]

Chitin

Chitosan

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của chitin và chitosan [81]

Độ deacetyl của chitin và chitosan là một thông số quan trọng ảnh hưởng đến tính chất của chúng Chitin có độ deacetyl thấp, chitosan có độ deacetyl cao, có nghĩa là chitosan chứa nhiều nhóm amin hơn chitin [26]

Phân tử lượng của chitosan là một thông số cấu trúc quan trọng, quyết định tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu, đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật Phân tử lượng của chitosan nằm trong khoảng

Nhóm N-acetyl

Nhóm amin

từ 100.000 ÷1.200.000 dalton Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì có độ nhớt càng cao và phân tử lượng của chitosan phụ thuộc vào nguồn chitin cũng như điều kiện deacetyl chitin Chitosan có phân tử lượng thấp, có chứa nhiều nhóm amin tự do sẽ có hoạt tính sinh học cao hơn, khả năng kháng khuẩn tốt hơn và có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học, công nghệ sinh học Độ nhớt của chitosan phụ thuộc vào phân tử lượng của nó, chẳng hạn chitosan có phân tử lượng thấp có độ nhớt từ 30-200 cPs và chitosan có phân tử lượng lớn hơn 1 triệu dalton có độ nhớt lên đến 3.000-4.000 cPs Ngoài ra, độ nhớt của chitosan còn phụ thuộc vào độ deacetyl, lực ion, pH, nhiệt độ [26] Chitosan tan tốt trong các acid hữu cơ như acid formic, acid acetic, acid propionic, acid citric, acid lactic và không tan trong nước, kiềm, cồn Khi hoà tan chitosan trong môi trường acid loãng tạo thành keo dương - đây là một đặc điểm rất đặc biệt của chiotsan do đa số các keo polysaccharide tự nhiên tích điện âm Chitosan tích điện dương

sẽ có khả năng kết dính bề mặt với các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các ion kim loại, tương tác tốt với các polyme tích điện âm [26]

Chitosan có một số tính chất như khả năng hút nước, khả năng hấp phụ chất màu, kim loại, kết dính với chất béo, kháng khuẩn, kháng nấm, mang ADN … khả năng này phụ thuộc vào độ deacetyl hóa Chitosan có độ deacetyl cao thì có khả năng hấp phụ chất màu, tạo phức với kim loại, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm cao hơn Cụ thể, chitosan có độ deacetyl trên 85% có khả năng kháng khuẩn tốt hơn các loại chitosan có

độ deacetyl thấp hơn 80% [26]

1.1.1.2 Oligochitosan

Oligosaccharide là nhóm glucide có từ hai đến vài chục gốc monosaccharide, thường có vị ngọt, kết tinh được và có khả năng tan trong nước Trong tự nhiên, phổ biến nhất là các disaccharide, còn các oligo chứa vài gốc đến hàng chục gốc monosaccharide thường là sản phẩm thuỷ phân chưa hoàn toàn của các polysaccharide [4] Oligochitosan thu được nhờ thủy phân chitosan, là một loại oligosaccharide có chứa một số lượng có hạn các phân tử D-glucosamine

Chitosan có khối lượng phân tử trung bình (Mw) từ khoảng 10.000 đến 100.000 dalton được xem là chitosan khối lượng phân tử thấp, trong khi đó khối lượng phân tử trung bình của oligochitosan thường nhỏ hơn 10.000 dalton [4] Chitosan khối lượng phân tử thấp và oligochitosan có một số hoạt tính sinh học khác biệt với chitosan khối

lượng phân tử cao như tính chống oxi hóa, tính kháng khuẩn, hoạt tính chống ung thư, kích thích hệ miễn dịch chống nhiễm bệnh đối với vật nuôi, cây trồng… [72, 132] Chitosan chỉ tan trong acid, oligochitosan có thể tan trong nước Do đó người ta

có thể sử dụng oligochitosan làm phụ gia bổ sung vào các sản phẩm thực phẩm nhằm kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm

NH2

H OH

CH2OH

H

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của oligochitosan

Chitooligosaccharide là tên gọi chung cho loại oligosaccharide sản xuất từ chitin/chitosan Đây là oligosaccharide của liên kết β-1,4 với các đơn vị N-acetyl-D-glucosamine (đối với chitin) và với D-glucosamine (đối với chitosan)

Chitooligosaccharide với ưu điểm vượt trội hơn so với chitin, chitosan, là có trọng lượng phân tử thấp và khả năng hòa tan cao Chính vì thế, các chitooligosaccharide mở

ra tiềm năng ứng dụng rộng lớn trong nhiều lĩnh vực khác nhau [4]

1.1.2 Phương pháp sản xuất chitin và chitosan

Quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản phụ thuộc nhiều vào hàm lượng chitin của phế liệu và khác nhau tùy theo loài, giai đoạn trưởng thành, điều kiện nuôi dưỡng

và thu hoạch Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng chitin trong thủy sản cấu tạo từ thể vi sợi có liên kết cộng hóa trị với α- amino acid như là tyrosine cũng giống như peptide và protein biểu bì được muối khoáng làm cho rắn chắc lại [35, 73] Hơn nữa, chitin liên kết với protein tạo thành các glycoprotein bền vững thông qua liên kết cộng hóa trị giữa chitin với acid aspartic và histidine nằm trong cấu trúc của phần protein [106]

Khi nghiên cứu về cấu trúc của vỏ giáp xác (tôm, cua ), nhiều dẫn liệu cho thấy

vỏ tôm, cua có cấu trúc bao gồm bộ khung cơ bản là chitin, ngoài bộ khung này còn có

N-acetyl-D-glucosamine Chitin oligosaccharide

(Oligochitin) Chitin

(Oligochitosan)

D-glucosamine

các thành phần protein, lipid, muối khoáng, sắc tố tạo nên lớp vỏ bền vững không thấm nước để bảo vệ các lớp cơ thịt bên trong Do vậy, muốn tách được chitin từ các loại vỏ này phải bao gồm các bước: khử protein, khử khoáng và các chất phi chitin khác Thông thường, quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản bao gồm ba bước: khử protein, khử khoáng và tẩy màu [108]

1.1.2.1 Quá trình khử protein

Hiện có nhiều phương pháp khác nhau để khử protein từ đầu vỏ tôm đã được nghiên cứu Nhìn chung, đầu tiên protein được tách ra từ vỏ ngoài của đầu vỏ tôm bằng cách xử lý với dung dịch NaOH loãng hoặc KOH loãng ở nhiệt độ cao Nồng độ kiềm

nguyên liệu với thời gian xử lý rất khác nhau [87] Một số nghiên cứu trước đây cho

mạch và deacetyl [134] Phương pháp tối ưu để khử protein của phế liệu vỏ cua và vỏ

dịch kiềm là 1:20 (w/v), thời gian tối thiểu 1 giờ để khử 90% protein và tối thiểu 2 giờ

để khử hoàn toàn protein từ vỏ [108]

Bảng 1.2 Điều kiện khử protein trong quá trình sản xuất chitin từ các nguồn phế

liệu tôm [92, 113]

Nguồn phế

liệu

Chế độ khử protein Nồng độ NaOH (%) Nhiệt độ ( o C) Thời gian (h) Tỷ lệ (w/v)

Quá trình khử protein thường kèm theo quá trình khử lipid do lipid có thể phản ứng với kiềm tạo thành xà phòng theo phương trình phản ứng sau:

Đối với quá trình khử protein, nhiệt độ đóng vai trò quan trọng Ở nhiệt độ phòng, quá trình tách protein diễn ra chậm, thời gian khử protein từ một ngày đến vài ngày Khi

khử protein chỉ cần vài giờ để đạt hàm lượng protein còn lại <1% Tuy nhiên, cần phải lưu ý là sử dụng kiềm để tủa protein ở đầu vỏ tôm ở nhiệt độ cao trong thời gian dài sẽ dẫn đến quá trình cắt mạch của sản phẩm chitin Mặt khác, sử dụng kiềm để tủa protein

ở đầu vỏ tôm ở nhiệt độ cao còn dẫn tới lão hóa và hư hỏng các thiết bị chứa đựng bằng nhựa hoặc inox,…

Nồng độ kiềm được sử dụng cũng ảnh hưởng đến chất lượng chitin và chitosan thu được Nồng độ kiềm cao thì khả năng khử protein cao, thời gian xử lý ngắn, hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm chitin thấp Tuy nhiên, sử dụng nồng độ kiềm cao lại gây

ra hiện tượng cắt mạch chitin và chitosan Tỷ lệ giữa dung dịch kiềm và phế liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả tách protein, tỷ lệ 5/1 đối với nguyên liệu tươi và 15/1 đối với nguyên liệu khô thường được sử dụng Để tăng cường hiệu quả của quá trình tách protein cần thực hiện khuấy đảo trong quá trình xử lý Ngoài ra, kích thước của nguyên liệu cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách protein khỏi đầu vỏ tôm, do đó trong nhiều quy trình sản xuất chitin, phế liệu tôm được nghiền nhỏ đến kích thước từ 2 ÷ 5 mm Để đáp ứng yêu cầu chất lượng của chitosan công nghiệp, hàm lượng protein còn lại trong sản phẩm chitin phải nhỏ hơn 1% Để tăng hiệu quả tách protein, quá trình tách protein được lặp lại nhiều lần [26]

Chiếu xạ tia gamma được nghiên cứu kết hợp với NaOH để tăng quá trình loại protein ra khỏi vỏ tôm Kết quả khảo sát cho thấy chiếu xạ Coban-60 với liều chiếu 3 ÷

nhân là do tia năng lượng cao gamma của Coban-60 đã cắt các liên kết của protein với các thành phần trong cấu trúc vỏ như chitin, canxi, phosphate Vì vậy dễ dàng loại bỏ protein ra khỏi nguyên liệu [5]

Một phương pháp có nhiều ưu điểm hơn phương pháp hóa học là dùng enzyme để tách chiết chitin, chitosan và chitooligosaccharide, tuy nhiên protein còn lại thường cao

và thời gian phản ứng dài hơn đáng kể so với các phương pháp hóa học Hơn nữa, giá thành enzyme cao, làm hạn chế ứng dụng của phương pháp enzyme trong công nghiệp [97] Enzyme khử protein thương mại có sẵn như alcalase, chymotrypsin và papain đã được sử dụng để tách protein ra khỏi phế liệu vỏ trong sản xuất chitin [58, 126] Một số nghiên cứu còn cho rằng có thể sử dụng bromelain từ thân cây dứa và papain từ đu đủ trong thủy phân chitin từ mai mực để sản xuất chitooligosaccharide và thủy phân bằng bromelain tốt hơn nhiều so papain với nồng độ tối ưu 0,1% [127] Một nghiên cứu còn

cho rằng sử dụng alcalase khử protein từ phế liệu tôm (Crangon crangon) cho phép thu

hồi chitin với hàm lượng protein còn lại khoảng 4,4% - 7,9% [117] Sử dụng alcalase hoặc enzyme của tụy tạng với tỷ lệ enzyme/cơ chất là 3% và nhiệt độ 60°C để thu hồi

chitin, protein và astaxanthin từ vỏ của tôm Xiphopenaeus kroyeri Dùng alcalase để

khử protein hiệu quả hơn enzyme của tụy tạng mặc dù hàm lượng protein còn lại cao gấp đôi so với xử lý bằng NaOH [48]

Sử dụng enzyme alcalase để khử protein phế liệu tôm Crangon có thể giúp thu hồi

được 64,3% protein của đầu vỏ tôm để sử dụng trong thức ăn chăn nuôi Sử dụng protease để thay thế cho NaOH khắc phục được các hạn chế của việc sử dụng hóa chất Tại Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã thực hiện sử dụng enzyme protease (papain, alcalase, protamex, flavourzyme) hoặc vi sinh vật để khử protein trong công nghệ sản xuất chitin từ phế liệu tôm [11, 24, 25]

Các enzyme trypsin, pepsin và papain cũng được nghiên cứu để xử lý vỏ tôm

Metapenaeus monoceros nhằm có thể thu nhận carotenoprotein từ vỏ tôm này trong sản

xuất thức ăn nuôi động vật thủy sản và kết quả cho thấy sử dụng trypsin có hiệu suất thu

thu được 50% [39]

Như vậy, hiện đã có một số nghiên cứu sử dụng protease để khử protein của đầu

vỏ tôm trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cho thấy sử dụng enzyme không thể khử triệt để protein từ phế liệu thủy sản Vì vậy, muốn triển khai ở quy mô sản xuất công nghiệp cần nghiên cứu thêm các giải pháp khử protein bằng tác nhân sinh học khác như vi sinh vật để làm giảm giá thành và nâng cao hiệu quả khử protein từ phế liệu đầu, vỏ tôm

1.1.2.2 Quá trình khử khoáng

Phế liệu thủy sản (tôm, cua) thường chứa một lượng khoáng khá cao (chủ yếu là muối canxi cacbonat và một lượng nhỏ canxi phosphate) Vì vậy, một trong những công đoạn quan trọng trong quy trình sản xuất chitin là khử khoáng Việc loại bỏ canxi cacbonat, canxi phosphat và các loại muối khoáng khác trong phế liệu vỏ tôm cua thường được thực hiện bằng acid loãng Tỷ lệ acid phải đủ lớn để khử tất cả các muối khoáng có trong vỏ tôm, cua để bảo đảm tách khoáng hoàn toàn [108] Để sự thay đổi của chitin tự nhiên là nhỏ nhất, sử dụng EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetate) để khử khoáng hoặc khử khoáng và khử protein đồng thời [33, 55]

Quá trình khử khoáng có thể thực hiện bằng cách xử lý vỏ tôm, cua bằng các acid

acid cũng rất đa dạng, nồng độ HCl từ 0,5N đến 2N, ở nhiệt độ rất thấp đến nhiệt độ phòng Thời gian khử khoáng từ 1/2h đến 48h [91, 26]

Phương trình phản ứng của quá trình khử khoáng bằng HCl:

ra, khi thực hiện công đoạn khử khoáng, cần lưu ý đến tỷ lệ giữa nguyên liệu/acid vì nó ảnh hưởng quyết định đến hiệu quả khử khoáng Tỷ lệ nguyên liệu/dung dịch acid tương

ứng 1:15 là tốt nhất khi nồng độ acid sử dụng là 4% Trong quá trình ngâm acid ở nhiệt

độ phòng, kết hợp với khuấy đảo, quá trình khử khoáng chưa đạt nếu vỏ còn cứng và không thấy bọt khí nổi lên, cần bổ sung thêm acid [26]

Tùy theo từng loại nguyên liệu và yêu cầu chất lượng của chitin mà chế độ khử khoáng áp dụng khác nhau (bảng 1.3) Thông thường đối với vỏ tôm thì nồng độ HCl

sử dụng khoảng 4-5%, xử lý phế liệu cua, ghẹ nồng độ HCl khoảng 10%, có thể phải khử khoáng nhiều lần [26]

Trong quá trình khử khoáng thường xảy ra quá trình cắt mạch chitin nên quá trình tách khoáng chỉ thực hiện ở nhiệt độ phòng hoặc nhiệt độ thấp hơn để hạn chế quá trình cắt mạch [103] Gần đây, một số nghiên cứu đã ứng dụng các acid hữu cơ để tách khoáng như acid formic, acid acetic và acid lactic [42] Ở các nghiên cứu này, nồng độ acid được sử dụng nhỏ hơn 1M đối với acid formic và acid lactic Người ta cũng có thể sử dụng các acid này riêng rẽ hoặc kết hợp các acid này với nhau để khử protein vỏ tôm, cua Khi sử dụng acid hữu cơ để tách khoáng, chitin và chitosan thu được có độ tinh sạch cao, có thể đáp ứng được yêu cầu độ tinh sạch của chitin trong y dược, thực phẩm Ngoài ra, chitin và chitosan thu được có phân tử lượng lớn và độ nhớt cao, đây là phương pháp khử khoáng thân thiện hơn với môi trường

Phương trình phản ứng của quá trình khử khoáng bằng acid acetic:

Phương trình phản ứng của quá trình khử khoáng bằng acid lactic:

Trong sản xuất chitin, thực hiện công đoạn khử khoáng sau khi tách protein thì sản phẩm chitin cuối cùng sẽ có hàm lượng khoáng còn lại thấp hơn so với sản phẩm chitin trong quy trình mà công đoạn tách khoáng được thực hiện trước tiên [26] Kết quả này

có thể giải thích là khi tách protein trước, HCl sẽ tiếp xúc tốt hơn với các chất khoáng

có trong phế liệu và dễ dàng tách khoáng ra dưới dạng hòa tan vào trong dung dịch Ngoài ra, để nâng cao chất lượng chitin, người ta có thể tiến hành khử khoáng nhiều lần với nồng độ acid xử lý thấp [26]

1.1.2.3 Quá trình tẩy màu

Trong phế liệu tôm và cua có chứa một lượng lớn các chất màu, chủ yếu thuộc nhóm carotenoid: astacene, astaxanthin, canthaxanthin, lutein và β-carotene Việc liên

kết của các chất màu này với các thành phần khác trong phế liệu như protein, khoáng, chitin vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ [26] Ngoài ra, quá trình khử khoáng và khử protein của phế liệu động vật có vỏ tạo ra một sản phẩm màu nâu hoặc trắng hơi nâu do các chất màu vần còn lại một ít trong sản phẩm hoặc do các phản ứng sẫm màu xảy ra

do quá trình khử khoáng và protein sử dụng các chất khác nhau hoặc do quá trình khử khoáng, protein thực hiện ở nhiệt độ cao [91]

Chính vì thế, sau công đoạn khử khoáng và protein, sản phẩm chitin thường có màu sẫm, để chitin có màu trắng đẹp thì cần có công đoạn tẩy màu Việc tẩy màu có thể thực hiện bằng cách phơi dưới ánh sáng mặt trời hoặc xử lý bằng các chất tẩy màu thông

nhiều nhất [26] Chẳng hạn, để thu được chitin và chitosan có màu trắng từ vỏ tôm

Hariana theo quy trình sử dụng HCl 30% để khử khoáng và NaOH 1,5N để khử protein,

người ta cần phải tẩy màu bằng NaOCl [87]

Tuy nhiên, quá trình tẩy màu thường đi kèm với quá trình cắt mạch chitin nên dẫn đến chitosan có phân tử lượng thấp, độ nhớt thấp Vì vậy, chế độ tẩy màu cần phải được nghiên cứu lựa chọn phù hợp để hạn chế quá trình cắt mạch chitin Thông thường quá trình tẩy màu chỉ sử dụng đối với phế liệu tôm vì hàm lượng sắc tố cao, còn đối với mai mực thì không cần thiết phải có bước tẩy màu [26]

Bảng 1.4 Điều kiện tẩy màu chitin từ phế liệu tôm thẻ [92]

1.1.2.4 Quá trình deacetyl

Để thu được chitosan cần tiến hành deacetyl trên bán thành phẩm chitin Mức độ deacetyl hóa được tính theo phần trăm (%) số nhóm acetyl bị khử trong phân tử chitin

phân tử do đó ảnh hưởng đến tính chất điện phân và độ tan của chitin, chitosan Chitin

có mức độ deacetyl hóa trung bình nằm trong khoảng 10 ÷ 15% Sản phẩm chitin thường

có mức độ deacetyl hóa từ 30 – 40% và chitosan phải có mức độ deacetyl hóa > 60%, với mức độ deacetyl hóa này chitosan dễ tan trong một số acid hữu cơ loãng như acid acetic, acid lactic [4]

Quá trình sản xuất chitosan từ chitin được thực hiện bởi công đoạn deacetyl (deacetylation), đây là quá trình tách nhóm acetyl khỏi phân tử chitin Thông thường quá trình deacetyl được thực hiện bằng cách ngâm chitin trong dung dịch NaOH hoặc

hơn Công đoạn deacetyl được thực hiện ở các chế độ rất đa dạng, phong phú, tùy thuộc vào nguồn chitin và yêu cầu về tính chất của chitosan [26]

Ngoài ra, người ta có thể sử dụng acid đặc để thực hiện quá trình deacetyl Tuy nhiên, việc xử lý bằng acid đặc thường kèm theo quá trình cắt mạch của polyme, do đó thực hiện deacetyl trong môi trường kiềm đặc vẫn là phương pháp thường được sử dụng [26]

Quá trình deacetyl được thực hiện theo phản ứng sau:

Hình 1.3 Phương trình phản ứng deacetyl chitin [26]

Chitosan được sản xuất từ chitin thực hiện quá trình deacetyl bằng dung dịch

thu được chitosan có độ deacetyl cao [65, 96] Nhiệt độ cao làm giảm trọng lượng phân

tử của chitosan [79] Sử dụng nhiều phương pháp deacetyl cho thấy giảm nồng độ kiềm

sử dụng nhưng tăng thời gian vẫn đáp ứng được mục tiêu tạo ra chitosan có độ deacetyl cao và sản phẩm thu được có thể là chitosan có độ deacetyl gần 100% [84] Một số nhà nghiên cứu còn đề xuất phương pháp thêm thiophenol như là một bẫy oxy và chất xúc

OH

HH

n

NaOH deacetyl

O H

H H

NH2

H OH

CH2OH

n + nCH3COONa + nH2O

tác để rút ngắn thời gian deacetyl để tạo ra chitosan có độ deacetyl cao [47] Hiệu quả của quá trình deacetyl phụ thuộc vào nhiều yếu tố [26]: Nhiệt độ thực hiện quá trình deacetyl, thời gian và nồng độ kiềm sử dụng, tỷ lệ giữa chitin và dung dịch kiềm, ảnh hưởng của chất lượng chitin ban đầu và điều kiện môi trường xử lý

Bảng 1.5 Điều kiện deacetyl thường dùng đối với chitin từ phế liệu tôm [23]

Độ deacetyl của sản phẩm chitosan thu được phụ thuộc nhiều vào các yếu tố nồng

độ NaOH sử dụng, nhiệt độ và thời gian xử lý Nồng độ NaOH và nhiệt độ xử lý càng cao thì độ deacetyl đạt được càng cao Tuy nhiên, phân tử lượng của sản phẩm chitosan thu được sẽ thấp [26]

Để đạt được độ deacetyl cao trên 90% thì cần thực hiện quá trình deacetyl nhiều lần Chẳng hạn, để chitosan thành phẩm đạt được độ deacetyl 96% khi sử dụng chitin từ

[26] Thực hiện quá trình deacetyl một lần khó đạt được độ deacetyl cao trên 90% vì giai đoạn cuối của quá trình deacetyl tốc độ tách nhóm acetyl diễn ra rất chậm Tuy nhiên, sau khi rửa sạch mẫu và tiếp tục deacetyl thì quá trình deacetyl diễn ra nhanh hơn

và đạt được độ deacetyl cao [26]

+ Deacetyl chitin bằng phương pháp sinh học: Quá trình deacetyl chitin tạo

chitosan bằng phương pháp sinh học ở quy mô phòng thí nghiệm đã được một số tác giả nghiên cứu đề cập [115] Theo phương pháp này, enzyme chitin deacetylase thu nhận từ

nấm Absidia coerulia đã được thử nghiệm sử dụng để deacetyl chitin Một số nhà nghiên

cứu cho rằng sử dụng enzyme deacetyl chitin có một số lợi thế như chất lượng sản phẩm chitosan (đặc biệt là độ nhớt và phân tử lượng) tạo thành cao hơn, lượng hóa chất sử dụng (NaOH đặc) ít hơn và hạn chế ô nhiễm môi trường Các kết quả nghiên cứu deacetyl bằng phương pháp sinh học cho thấy quá trình deacetyl chitin bằng enzyme chitin deacetylase chủ yếu chỉ thực hiện được đối với chitin đã được deacetyl một phần, còn đối với chitin tự nhiên thì quá trình deacetyl bằng chitin deacetylase không hiệu quả

Hiệu quả deacetyl chitin của enzyme chitin deacetylase sẽ được tăng lên nếu chitin được

xử lý làm giảm độ rắn trước khi deacetyl bằng chitin deacetylase [114]

Một số kết quả nghiên cứu cho thấy enzyme chitin deacetylase từ Colletotrichum

lindemuthianum, Mucor rouxii, Abisidia butleri hoặc Aspergillus nidulans có thể chuyển

đổi chitin thành chitosan [32, 68, 120] Tuy nhiên, các loại chitin khác nhau về vị trí của các nhóm acetyl, chiều dài mạch chitin, các cấu trúc hình dạng của chitin và điều kiện thưc hiện phản ứng sẽ cho kết quả deacetyl chitin khác nhau [75, 106, 116]

+ Deacetyl chitin ở nhiệt độ và áp suất cao: Để nâng cao hiệu quả của quá trình

deacetyl chitin và rút ngắn thời gian deacetyl, một số nhà nghiên cứu đã thực hiện quá trình deacetyl ở nhiệt độ và áp suất cao: 15 psi/121°C Ở điều kiện nhiệt độ và áp suất cao như trên và với nồng độ NaOH sử dụng 45%, thời gian deacetyl chitin chỉ cần 30 phút có thể thu được chitosan có độ deacetyl tới 90,4% [90]

Từ các phân tích ở trên cho thấy đa số các tác giả trên thế giới đã tiến hành deacetyl chitin thu nhận từ vỏ tôm, cua để tạo thành chitosan bằng phương pháp hóa học sử dụng kiềm ở nồng độ cao và nhiệt độ cao Một số tác giả còn tiến hành sử dụng enzyme chitin deacetylase để deacetyl chitin thành chitosan Tuy vậy, việc nghiên cứu

sử dụng enzyme chitin deacetylase để deacetyl chitin mới chỉ được đề cập và chưa có các thông số công bố về điều kiện thực hiện phản ứng, giá thành sản phẩm chitosan thu được,… Do vậy, có thể nói rằng việc sử dụng kiềm nồng độ cao để deacetyl chitin thành chitosan vẫn là kỹ thuật được chủ yếu trong quá trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm

1.1.2.5 Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học

Nhiều năm qua, các nhà nghiên cứu và sản xuất chitin, chitosan từ phế liệu thủy sản chủ yếu sử dụng phương pháp hóa học để sản xuất công nghiệp chitin và các dẫn xuất của nó [54] Kỹ thuật sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học ở quy

mô công nghiệp có nhiều công đoạn nghiêm ngặt và thường thải ra một lượng lớn các chất hóa học gây ô nhiễm môi trường Mặt khác, quá trình deacetyl chitin diễn ra ở nồng

độ kiềm lớn và nhiệt độ cao nên có thể xảy ra quá trình thủy phân mạch polyme, dẫn đến sản phẩm chitosan có các tính chất sinh học không ổn định [29, 71]

Nhìn chung tất cả các quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học đều gồm đầy đủ các bước tương tự nhau và theo đúng thứ tự thể hiện ở hình 1.4 [105] Tuy vậy, mỗi một nhà nghiên cứu sản xuất chitin và chitosan lại có một quy trình sản xuất có sự khác nhau đôi chút vì vậy chất lượng của chitin và chitosan được sản xuất

của các quy trình cũng khác nhau Chẳng hạn, đối với quy trình sản xuất chitin và chitosan có công đoạn khử khoáng trước khử protein và thời gian xử lý kiềm ngắn, sản phẩm chitosan thu được sẽ có trọng lượng phân tử và độ nhớt cao hơn, độ deacetyl thấp hơn, độ hòa tan cũng thấp hơn, khả năng liên kết với chất béo giảm khi so sánh với chitosan được sản xuất theo phương pháp hóa học truyền thống với đầy đủ công đoạn theo thứ tự như hình 1.4 [93]

Hình 1.4 Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học [69]

Fernandez Kim S O (2004) tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của trật tự các công đoạn trong qui trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp hóa học tới chất lượng chitosan thu được từ phế liệu tôm nhận thấy sự thay đổi trật tự của các công đoạn khử khoáng, khử protein, deacetyl, tẩy màu sẽ sản xuất ra chitosan có các đặc điểm khác nhau [54]

1.1.2.6 Quy trình sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp sinh học

Việc sử dụng phương pháp sinh học trong sản xuất chitin và chitosan để khắc phục nhược điểm có thể gây ô nhiễm môi trường của phương pháp hóa học trong sản xuất chitin và chitosan đã được một số nhà nghiên cứu đề cập Chẳng hạn, Shimahara K.,

Takiguchi Y (1988) đã nghiên cứu sử dụng protease từ vi khuẩn Pseudomonas

maltophilia để khử protein từ vỏ giáp xác mà không dùng kiềm Sau 24 giờ xử lý vỏ

Sấy khô

Deacetyl

NaOH/KOH nồng độ cao, toC cao

Chitin

giáp xác bằng protease từ P maltophilia, hàm lượng protein còn lại của vỏ giáp xác

khoảng 1% [110, 120] Một công trình nghiên cứu tương tự của Wang S L và các cộng

sự cho thấy sử dụng protease từ Bacillus sp với tỷ lệ enzyme so với bột mai mực là 2%,

sau ngày hai ngày xử lý hiệu suất khử protein bột mai mực là 63% và sau ba ngày xử lý hiệu suất khử protein bột mai mực là 73% [128] Các nghiên cứu ở trên cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng enzyme protease từ vi sinh vật trong khử protein ở vỏ giáp xác

Hình 1.5 Sản xuất chitin và chitosan theo phương pháp sinh học [69]

Một số nhà nghiên cứu còn sử dụng canh trường lên men vi khuẩn sản xuất enzyme protease để khử protein vỏ tôm, cua trong quá trình sản xuất chitin và đã đạt được những thành công nhất định [34, 66, 134] Chẳng hạn, Oh K T và các cộng sự sử dụng phối

hợp giữa acid hữu cơ và canh trường sản xuất protease của Pseudomonas aeruginosa

F722 để khử khoáng và khử protein từ vỏ cua, ở nhiệt độ lên men tối ưu là 30°C, trong điều kiện bổ sung glucose 10% và ủ trong 7 ngày Kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả khử khoáng vỏ cua đạt 92% và khử protein là 63% sau 7 ngày nuôi cấy [94] Kết quả nghiên cứu còn cho thấy khả năng khử khoáng ở vỏ cua tỷ lệ thuận với lượng đường glucose bổ sung Các nghiên cứu sử dụng quá trình lên men lactic để khử khoáng chất

và protein phế liệu tôm trong sản sản xuất chitin cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng phương pháo lên men lactic để khử khoáng chất và protein phế liệu tôm [95, 112], để khử khoáng chất và protein ở vỏ tôm càng [34] và phế liệu tôm thẻ [112, 134] Chẳng

Phế liệu đầu vỏ tôm, cua

Deacetyl bằng enzyme chitin deacetylase

hoặc NaOH nồng độ cao

Rửa sạch và sấy khô

hạn, các nhà nghiên cứu đã sử dụng quá trình lên men lactic của vi khuẩn Lactobacillus

paracaseior hay của hỗn hợp L acidophils, Enterococcus faecium và Pediococcus acidilactici trong khử khử khoáng chất và protein ở phế liệu tôm (Nephrops norvegicus)

thu được chitin [35, 135] và quá trình deacetyl chitin tạo được theo phương pháp sử dụng quá trình lên men lactic thu được chitosan, có tính chất hóa lý tương tự như chitosan được sản xuất theo phương pháp hóa học [35] Một nghiên cho thấy không có

sự khác biệt đáng kể nào giữa chitin từ vỏ tôm (Penaeus semisulcatus) sản xuất theo phương pháp hóa học và chitin từ vỏ tôm (Penaeus semisulcatus) sản xuất theo phương pháp lên men lactic sử dụng các chủng L plantarum, L acidophilus và L rhamnosus có

cứu sử dụng vi khuẩn lactic L plantarum trong lên men khử protein và khoáng chất vỏ

tôm cho thấy nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men lên là 30°C - 40°C [95]

Các công trình nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong khử protein và khoáng chất vỏ tôm cho thấy phương pháp lên men acid lactic là một trong những phương pháp có hiệu quả trong sản xuất chitin [101, 126] Sở dĩ phương pháp lên men acid lactic được ứng dụng trong quá trình sản xuất chitin từ phế liệu tôm là do vi khuẩn lactic vừa có khả năng tạo acid lactic lại vừa có khả năng sinh tổng hợp enzyme protease ngoại bào Acid lactic sẽ giúp chuyển calcium carbonate không tan trong vỏ giáp xác, hình thành calcium lactate - bị loại ra khi rửa trong các công đoạn khử khoáng và các protease ngoại bào của vi khuẩn lactic sẽ khử protein khỏi vỏ tôm Mặt khác, acid lactic được sinh ra từ glucose trong quá trình lên men sẽ tạo môi trường pH thấp giúp ức chế

sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng phế liệu [111] Như vậy, chính acid lactic tạo

ra từ quá trình lên men lactic giúp loại bỏ khoáng khỏi vỏ và quá trình khử protein xảy

ra chủ yếu do các enzyme protease được tạo ra từ các chủng vi sinh vật Lactobacillus

cấy vào và từ hệ enzyme tồn tại trong phế liệu tôm, cua đã giúp loại bỏ khoáng chất và protein ra khỏi vỏ tôm trong quy trình sản xuất chitin theo phương pháp lên men lactic [34, 111] Một số loại vi sinh vật thường được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất chitin

và chitosan từ phế liệu vỏ tôm cua: Lactobacillus plantarum, Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas maltophilia, Bacillus subtilis, Lactobacillus paracasei, Lecanicillium fungicola và Penicillium chrysogenum và quy trình sản xuất chitin, chitosan theo

phương pháp lên men sử dụng vi sinh vật được trình bày ở hình 1.5 [58, 101, 111, 126]

Rao M B và các cộng sự (2000) tiến hành nghiên cứu về một số yếu ảnh hưởng tới quá trình khử khoáng và protein ở vỏ tôm khi lên men lactic và nhận thấy hiệu quả của quá trình lên men lactic để khử khoáng và protein ở vỏ tôm phụ thuộc vào nhiều yếu tố: lượng vi sinh vật cho vào, nồng độ rỉ đường hoặc đường glucose bổ sung, pH ban đầu và thời gian lên men Cụ thể, bổ sung 5% glucose vào phế liệu tôm có thể thúc đẩy

sự phát triển của vi khuẩn lactic và quá trình lên men tốt hơn Trong 4 loại acid dùng để điều chỉnh pH bắt đầu lên men và trong suốt quá trình lên men, acid acetic và acid citric

có hiệu quả nhất Quá trình lên men phế liệu tôm bổ sung vi khuẩn L plantarum với tỷ

lệ 10%c, bổ sung glucose 5%, điều chỉnh pH 6,5 bằng acid acetic, thì hiệu suất khử protein vỏ tôm là 75% và hiệu suất khử khoáng là 86% Khi dùng acid citric thay acid acetic thì hiệu suất khử protein là 88% và khử khoáng là 90% Mặt khác, hiệu suất khử khoáng và chất lượng của chitin thu được rất cao nếu bổ sung protease để nâng cao hiệu suất khử protein Từ các nghiên cứu trên, Rao M B và cộng sự khẳng định xử lý kết

hợp Lactobacillus với acid acetic vẫn duy trì được hiệu quả kinh tế và mang lại lợi nhuận

cao từ quá trình lên men phế liệu tôm [101]

Oh K T và cộng sự (2007) khẳng định sử dụng chủng Pseudomonas aeruginosa

F722 trong lên men khử khoáng và protein vỏ cua để sản xuất chitin sẽ cho hiệu quả của quá trình khử khoáng đạt 92% và khử protein đạt 63% sau 7 ngày lên men trong môi

Từ các phân tích ở trên cho thấy việc sử dụng vi sinh vật nhất là vi khuẩn lactic trong lên men khử khử khoáng và protein vỏ tôm, cua để sản xuất chitin là một hướng nghiên cứu triển vọng và mang lại hiệu quả kinh tế Do vậy luận án sẽ sử dụng hướng nghiên cứu này để thử nghiệm khử khoáng chất và protein đầu vỏ tôm trong quá trình nghiên cứu sản xuất chitin và chitosan

1.1.3 Phương pháp sản xuất oligochitosan

Hiện có một số phương pháp cắt mạch chitosan tạo thành oligochitosan như: phương pháp hóa học dùng các chất oxi hóa, phương pháp sinh học dùng enzyme và phương pháp chiếu xạ có thể áp dụng để chế tạo chitosan khối lượng phân tử thấp và oligochitosan [80] Hiện nay, người ta chia phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan thành 3 loại như sau [4]:

- Phân cắt chitosan bằng tác nhân hoá học: acid vô cơ (HCl, H2SO4, H3PO4,

- Phân cắt chitosan bằng tác nhân lý học: tia X, ánh sáng, vi sóng hay chiếu xạ gamma, …

- Phân cắt chitosan bằng tác nhân sinh học (enzyme): chitosanase, chitinase, cellulase, glucanase, lysozyme,…

H + Acid hydrolysis

O HO HO

HOCH2

O

HO HO

O O

OH

*

O O O

OH

n GlcNAc Glc

Oligochitosan n = 2-8 LMWC 5 -20 Chitosanase

Chitinase Cellulase

Hình 1.6 Một số phương pháp tạo oligochitosan từ chitosan [130]

* Phương pháp hóa học

Phương pháp hóa học là phương pháp sử dụng acid vô cơ, acid hữu cơ hoặc các chất oxy hóa để phân cắt liên kết glycoside trong cấu tạo chitin hoặc chitosan tạo thành

phân chitin và chitosan Phương pháp hóa học sử dụng acid để phân cắt chitin hoặc chitosan có một số ưu điểm như: hiệu suất thủy phân cao, chu kỳ sản xuất ngắn, thành phẩm dễ bảo quản, nguyên liệu rẻ tiền [4] Nhưng phương pháp acid cũng có hạn chế là sản phẩm sau phân cắt cần phải trải qua quá trình tách và làm sạch khỏi acid nên giá thành sản phẩm hơi cao

Trong phương pháp hóa học, phương pháp phân cắt chitosan tạo thành

glycoside liền kề [4]

Chitin và chitosan đều hòa tan nhanh chóng trong HF lỏng khi trộn theo tỷ lệ 1:5

ở điều kiện nhiệt độ 20oC Sự thủy phân chitin, chitosan bằng HF khan tạo ra các oligosaccharide với độ depolyme 2 - 6 Khi chitosan được xử lý với HF, sản phẩm tạo thành là các oligochitosan có gắn flor và người ta có thể khử flor bằng acid perchloric loãng Bằng cách này sẽ thu được các oligochitosan có độ depolyme 2 - 10 Thủy phân chitin, chitosan bằng HF cho phép điều chế ra các oligosaccharide với hiệu suất cao Tuy nhiên, sau khi kết thúc quá trình thủy phân cần phải loại bỏ một lượng HF lớn và phải khử flor và cũng là một hạn chế của quy trình [4]

Chitin, chitosan có thể được thủy phân bằng HCl đậm đặc Chitin được thủy phân

có trọng lượng phân tử từ 1 ÷ 3kDa và nhỏ hơn 1 kDa Nếu thời gian kéo dài hơn 8 giờ thì sẽ tạo ra glucosamine, nếu thời gian thủy phân quá dài sẽ dẫn đến hiện tượng cháy khét và làm cho dung dịch có màu vàng đen Đối với chitosan thủy phân bằng HCl đậm

có độ depolyme lớn hơn 8 Đối với acid sulfuric thì chitin, chitosan thường bị thủy phân đến glucosamine hoặc những oligosaccharide với độ depolyme thấp [4]

Đối với acid nitric, quá trình thủy phân chitosan xảy ra trong một khoảng thời gian ngắn, dễ dàng kiểm soát tuy nhiên sản phẩm tạo ra các oligochitosan có độ depolyme 9

÷ 18, nhưng khó khăn trong việc sản xuất các oligome có độ depolyme dưới 10 và sản phẩm tạo thành cuối cùng có chứa 2,5- anhydromanose do sự deamin hóa dưới tác động của acid nitric

Đối với phương pháp thủy phân chitosan bằng acid phosphoric thì sản phẩm tạo ra

có 10% ÷ 20% depolyme 6-8 tuy nhiên sản phẩm cuối cần phải loại muối và thời gian phản ứng dài [4]

Đối với quá trình sản xuất oligochitin hoặc oligochitosan ở quy mô lớn, người ta thường sử dụng phế liệu vỏ tôm và cua [72] Khi thủy phân chitin và chitosan bằng HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao sản phẩm tạo thành có thể là các monome glucosamine [46, 75] Quá trình thủy phân hóa học chitin hoặc chitosan có thể tạo thành các oligochitin/oligochitosan có trọng lượng phân tử mong muốn và một số lượng lớn các monome nhưng năng suất thủy phân thấp [122] Ngoài ra, các hợp chất độc hại cũng có thể được hình thành trong thời gian thủy phân Mặt khác, sử dụng phương pháp hóa học

thủy phân chitin hoặc chitosan có thể làm tăng nguy cơ ô nhiễm môi trường Chính vì thế, sử dụng phương pháp hóa học để sản xuất oligochitin/oligochitosan có hoạt tính sinh học dùng cho con người là phương pháp không thực sự hấp dẫn đối với các nhà sản xuất Vì vậy, ngày nay các nhà nghiên cứu có xu thế tìm kiếm các loại enzyme có khả năng thủy phân chitin/chitosan để dùng cho mục đích này thay thế cho phương pháp hóa học vốn có nhiều tranh cãi [72]

Hình 1.7 Quy trình sản xuất oligochitosan theo phương pháp hóa học [15]

Theo Trần Thị Luyến và các cộng sự, quy trình sản xuất oligochitosan sử dụng HCl để thủy phân chitosan bao gồm các bước như sau (hình 1.7): Nguyên liệu được xay

thời gian 110 phút Tiếp tục nâng nhiệt để cắt đứt các liên kết glycoside trong môi trường

nguội, dùng NaOH 50% trung hoà dung dịch đưa về môi trường trung tính Dùng dung môi ethanol và methanol để hoà tan chất màu có trong sản phẩm, đồng thời để lắng tách

Chitosan Xay mịn

Ngâm trong HCl 10M, w/v = 1/4

Khuấy 10 phút/30 o C, sau đó khuấy và ủ 110 phút/40 o C

Nâng nhiệt (to=85oC,  = 2 phút)

Làm nguội Trung hoà

NaOH 50% lạnh w/v = 1/2,2

muối, tách oligochitosan Sản phẩm sau ly tâm được sấy lạnh ở nhiệt độ 40÷45oC để hạn chế sự biến đổi màu sắc Sản phẩm sản xuất theo quy trình trên đạt hiệu suất 70% [15]

* Phương pháp sinh học

Ngày nay các nhà nghiên cứu có xu hướng sử dụng các enzyme phân cắt chitosan trong sản xuất oligochitosan Các loại enzyme thủy phân chitosan hay được sử dụng là: chitosanase, chitinase, cellulase hay hemicellulase và -1,3-1,4-glucanase, Phương pháp này được sử dụng khá rộng rãi, bởi phương pháp này có ưu điểm như [4]:

- Hiệu suất thu hồi các phân đoạn cao

- Điều kiện diễn ra phản ứng thuỷ phân nhẹ nhàng, nhiệt độ không đòi hỏi cao, pH

ôn hoà nên chi phí thiết bị thấp, không gây ô nhiễm môi trường

Nhược điểm của phương pháp này là chi phí enzyme khá cao Mặc dù vậy, phương pháp sử dụng enzyme vẫn đang được các nhà nghiên cứu quan tâm do enzyme có thể cho phép depolyme hóa chọn lọc ở điều kiện ôn hòa Một số nhà nghiên cứu còn cho rằng sử dụng enzyme chitinase, chitosanase, glucanase, cellulase trong thủy phân chitosan có thể tạo ra oligochitosan có trọng lượng phân tử thấp, tan tốt nên khả năng ứng dụng được mở rộng Sơ đồ tóm tắt quá trình thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme được trình bày ở hình 1.8

Hình 1.8 Sơ đồ thủy phân chitin và chitosan bằng enzyme [4]

Phương pháp enzyme cho phép điều chế các oligochitosan có mức độ polyme hoá thấp mà không loại bỏ nhóm chất amin hay hình thành các hợp chất có màu

Tsai G T và các cộng sự (2002) cho rằng enzyme cellulase có khả năng phân cắt

Chitosanase

Chitinase (EC.3.2.1.14) (EC.3.2.1.14)

(EC.3.2.1.14)

Lysozyme (EC.3.2.1.17)

Chitosanase

chitosan thành các sản phẩm oligochitosan có hoạt tính sinh học kháng Bacillus cereus,

E coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica serovar Typhi, Saccharomyces cerevisiae và hoạt tính thủy phân chitosan của chitosanase chỉ

bằng 1/5 hoạt tính exo-glucanase ở bất kỳ loại cellulase nào [120] Khả năng phân cắt chitosan của cellulase tỷ lệ thuận với mức độ deacetyl hoá của chitosan Nói cách khác, chitosan có độ deacetyl 90% dễ bị phân cắt nhất Do đó, có thể điều chế oligochitosan

từ chitosan bằng cách sử dụng chitosanase hoặc cellulase Sử dụng phương pháp này có thể cắt các liên kết glycoside theo ý muốn mà không gây ra phản ứng phụ, thực hiện phản ứng ở nhiệt độ phòng và pH gần như trung tính [4]

Nguyen Anh Dzung và các cộng sự (2007) nghiên cứu thủy phân chitosan bằng enzyme chitosanase, cellulase cho thấy ở hoạt tính enzyme 0,4 U/ml và thời gian thủy phân 4 giờ quá trình thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan phân đoạn B (độ depolyme 8 – 18) cao nhất, chiếm tới 40,8% [89] Trần Thị Luyến và các cộng sự (2012) cũng nghiên cứu sử dụng enzyme hemicellulase, cellulase và papain trong thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan và nhận thấy: chitosan xay nhỏ và thuỷ phân bằng

ngày sẽ tạo thành oligochitosan với hiệu suất đạt 97% [15]; Chitosan xay mịn và phối trộn với enzyme hemicellulase, theo tỷ lệ: enzyme/ chitosan = 1/1, pH = 5,5; thời gian

enzyme, lọc sản phẩm và tiến hành sấy phun thu được oligochitosan có dạng bột màu trắng, tan tốt trong nước [15] Trần Thị Luyến còn sử dụng enzyme cellulase của xạ khuẩn ưa nhiệt đã để thủy phân chitosan với hiệu suất thu oligochitosan đạt 52,6% [12]

Từ các phân tích ở trên cho thấy có thể sử dụng enzyme để thủy phân chitosan thành oligochitosan nhưng hiệu quả thủy phân đôi khi không được cao và chi phí enzyme hơi cao

* Phương pháp vật lý

Phương pháp vật lý để phân cắt chitin, chitosan thành oligochitin, oligochitosan bằng cách sử dung tia X, vi sóng hay chiếu xạ… đây là các phương pháp mới, hiện đang được các nhà khoa học rất quan tâm [4]

+ Phương pháp sử dụng vi sóng

Vi sóng là một tác nhân mang năng lượng tác dụng lên các liên kết trong phân tử polyme với mức năng lượng cao và thời gian ngắn Phương pháp vi sóng có thể sử dụng

để phân cắt chitosan tạo thành oligochitosan vì vi sóng có khả năng phá vỡ các liên kết glycoside trong phân tử chitosan tạo thành chitosan có trọng lượng phân tử thấp và oligochitosan Để tăng hiệu quả của vi sóng, các nhà nghiên cứu thường sử dụng kết hợp

tác dụng làm tăng nhiệt độ, cả hai tác nhân này đều có thể bẻ gãy liên kết glycoside của chitosan để tạo oligochitosan Sản phẩm thu được tùy thuộc vào thời gian tác dụng của

vi sóng và mức năng lượng [4, 129]

H2O2 → H+ + HOO-

H2O2 + HOO- → OH• + O2 • + H2O

liên kết glycoside trong mạch chitosan, từ đó làm mạch chitosan giảm [4, 109]

+ Cắt mạch chitosan bằng phương pháp chiếu xạ

Chi phí sản xuất oligochitosan bằng phương pháp enzyme thường cao hơn so với phương pháp cắt mạch bằng tác nhân hóa học [80] Tuy nhiên, phương pháp hóa học cũng có nhược điểm là làm thay đổi cấu trúc của chitosan do tạo nhóm carboxyl, phân

học còn có một số hạn chế do hiệu suất tạo oligochitosan thấp và có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường [72]

Nghiên cứu cắt mạch chitosan tạo chitosan có khối lượng phân tử thấp hoặc oligochitosan bằng phương pháp chiếu xạ sử dụng tia gamma Co-60 và chùm tia điện

tử gia tốc đã và đang được tiến hành ở nhiều trung tâm công nghệ chiếu xạ trong khu vực Châu Á-Thái Bình Dương và trên thế giới [4] Tóm tắt quá trình phân cắt mạch polyme tự nhiên chitosan dưới tác động của bức xạ trong hình 1.12 Khi được chiếu xạ, các polyme sẽ được “kích thích”, hình thành các gốc tự do trong nội phân tử và trong hệ phản ứng Các gốc tự do này chính là yếu tố khơi mào cho các phản ứng của quá trình biến tính tiếp theo bao gồm 3 quá trình chính đó là ghép mạch, khâu mạch và cắt mạch Tùy theo bản chất của polyme, thành phần trong hệ phản ứng và liều chiếu xạ mà có thể

xảy ra ghép mạch, khâu mạch và cắt mạch

Hình 1.9 Quá trình biến đổi của chitosan khi chiếu xạ [17]

Cơ chế cắt mạch chitosan đã được nghiên cứu khá chi tiết [124] Các tác giả đã chỉ

ra rằng gốc hydroxyl tạo ra trong quá trình chiếu xạ dung dịch chitosan là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch chitosan (hình 1.9)

Hình 1.10 Sơ đồ cơ chế bắt hydro của gốc tự do hydroxyl [124]

Phương pháp chiếu xạ (tia ) khá hiệu quả để cắt mạch polyme, là công nghệ thân thiện với môi trường [57]

Nguyễn Quốc Hiến và các cộng sự (2000) nghiên cứu chiếu xạ chitosan nhận thấy sau khi chiếu xạ chitosan khối lượng phân tử chitosan giảm, mức độ giảm khối lượng chitosan sau chiếu xạ phụ thuộc vào liều xạ và chiếu xạ dung dịch chitosan 10% trong

O CH2OH

O OH

NH3

O CH2OH

O OH

NH3 2

O CH2OH

O OH

NH 3 4

O CH2OH

O OH

NH3 3

1

O

CH 2 OH

O OH

NH3

OH H2O

(Chitosan)