Luận án đã xây dựng được quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan bằng cách sử dụng bức xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy. Oligochitosan thu được sau khi chiếu xạ có 3 phân đoạn và có khả năng kháng 5 loại vi khuẩn: E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S. aureus, B. subtilis và Listeria monocytogenes.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VŨ THỊ HOAN NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT OLIGOCHITOSAN VÀ ỨNG DỤNG TRONG BẢO QUẢN TÔM NGUYÊN LIỆU SAU THU HOẠCH TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số: 9540105 Khánh Hòa - 2018 Cơng trình hồn thành Trường Đại học Nha Trang Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Trần Thị Luyến PGS TS Vũ Ngọc Bội Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Anh Dũng Trường Đại học Tây Nguyên Phản biện 2: PGS TS Ngô Đăng Nghĩa Trường Đại học Nha Trang Phản biện 3: GS TS Nguyễn Thị Hiền Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Luận án bảo vệ Hội đồng đánh giá luận án cấp trường họp Trường Đại học Nha Trang vào hồi ……… giờ, ngày …… tháng …… năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Trường Đại học Nha Trang TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu sản xuất oligochitosan ứng dụng bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch Ngành/Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến Thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: ThS Vũ Thị Hoan Khóa: 2011 Người hướng dẫn: GS TS Trần Thị Luyến PGS TS Vũ Ngọc Bội Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án thu số kết bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất ứng dụng oligochitosan: 1) Luận án xác định thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitin phương pháp sinh học sử dụng phối hợp vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 lên men khử protein, khoáng chất đầu vỏ tôm thẻ enzyme flavourzyme khử protein lại vỏ đầu tơm: vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 ni hoạt hóa 28 thu dịch sinh khối có mật độ tế bào 2.109 cfu/ml, tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w), tỷ lệ dịch vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men nhiệt độ phòng, thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein lại đầu vỏ tơm thẻ chân trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50oC pH 7,5, thời gian 8h Sử dụng acid HCl 3% khử khoáng lại chitin thơ với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thơ: 2/1 Q trình khử khống lại thực nhiệt độ phòng thời gian 10h Chitin sản xuất có chi phí ngun vật liệu 111.000 đồng/kg Quy trình sản xuất giảm thiểu lượng hóa chất sử dụng nên giảm nguy gây ô nhiễm môi trường Mặt khác sản phẩm phụ: protein, astaxanthin, tách từ q trình lên men đầu vỏ tơm vi khuẩn L plantarum VTCC-B431 hồn tồn sử dụng làm thức ăn chăn ni Do vậy, quy trình sản xuất vừa có ý nghĩa khoa học vừa có ý nghĩa thực tiễn lớn bảo vệ môi trường đồng thời tạo sản phẩm chitin theo sản xuất theo phương pháp sinh học “xanh” “sạch” 2) Luận án xác định thông số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl 90%: deacetyl chitin NaOH 50% nhiệt độ phòng thời gian 120h tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1 Chitosan sản xuất theo quy trình có độ deacetyl 93% có chi phí ngun vật liệu 361.365 đ/kg Đóng góp kỹ thuật chỗ trình deacetyl chitin thành chitosan tiến hành nhiệt độ phòng mà không sử dụng nhiệt độ cao phương pháp khác Vì mặt cơng nghệ, quy trình sản xuất đơn giản dễ thực Do vậy, cơng nghệ dễ dàng triển khai thực tế sản xuất quy mô lớn - điều doanh nghiệp chế biến chitosan từ đầu vỏ tôm mong muốn 3) Luận án xây dựng quy trình sản xuất chế phẩm oligochitosan cách sử dụng xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy Oligochitosan thu sau chiếu xạ có phân đoạn có khả kháng loại vi khuẩn: E coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S aureus, B subtilis Listeria monocytogenes Việc sản xuất oligochitosan theo kỹ thuật sử dụng xạ gamma coban 60 để phân cắt chitosan dạng vẩy có ưu điểm sản phẩm sau phân cắt không cần phải kết tủa cồn, tinh sấy khô phương pháp phân cắt chitosan thành oligochitosan enzyme hóa học Mặt khác, sản phẩm oligochitosan lại có khả kháng loại vi khuẩn dễ bảo quản, vận chuyển Do mặt cơng nghệ, phương pháp có tính khả thi cao dễ dàng triển khai sản xuất đại trà chế phẩm oligochitosan 4) Luận án xác định cấu trúc phân tử oligochitosan có 13 monomer 5) Luận án tiến hành thử nghiệm độc tính oligochitosan chuột thí nghiệm phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách chuột sử dụng oligochotosan cho thấy oligochitosan hồn tồn an tồn khơng gây độc cho chuột qua đường tiêu hóa khơng có ảnh hưởng tới nội quan chuột Đây nghiên cứu tiến hành thử nghiệm oligochitosan chuột thí nghiệm Việc thử nghiệm chứng minh chế phẩm oligochitosan sản xuất theo kỹ thuật phân cắt chitosan xạ gamma coban 60 hồn tồn an tồn với chuột thí nghiệm tức an tồn với người - hướng sản xuất sử dụng oligochitosan cho lĩnh vực thực phẩm dược học 6) Luận án nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản tôm bạc biển cách nhúng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% thời gian phút Tơm bạc ngun liệu sau xử lý oligochitosan 1% bảo quản ngày điều kiện mát mà đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến Nghiên cứu cho thấy hồn tồn sử dụng oligochitosan bảo quản thủy sản - nghiên cứu triển khai thực tế góp hạn chế việc lạm dụng hóa chất bảo quản nguyên liệu thủy sản CÁN BỘ HƯỚNG DẪN GS TS Trần Thị Luyến NGHIÊN CỨU SINH PGS TS Vũ Ngọc Bội Vũ Thị Hoan MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Nguyên liệu thủy sản thường dễ bị dập nát hư hỏng trình lưu giữ, bảo quản sau thu hoạch Vì thế, người dân có xu lạm dụng loại phụ gia độc hại, có khả kháng khuẩn kháng sinh, hàn the, ure để kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu thủy sản sau thu hoạch gây nên tình trạng an tồn thực phẩm Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng chất kháng khuẩn có nguồn gốc tự nhiên, không độc hại bảo quản nguyên liệu thủy sản nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Theo hướng nghiên cứu này, nhà nghiên cứu quan tâm tới việc nghiên cứu sử dụng oligochitosan - tác nhân sinh học có nguồn gốc từ đầu vỏ tơm, có khả kháng khuẩn, chống oxy hóa khơng độc hại bảo quản ngun liệu thủy sản Do việc “Nghiên cứu sản xuất oligochitosan ứng dụng bảo quản tôm nguyên liệu sau thu hoạch” hướng nghiên cứu mới, cần thiết có ý nghĩa thực tiễn Mục đích luận án - Sử dụng phương pháp sinh học phối hợp vi khuẩn lactic enzyme protease để khử protein khống chất đầu vỏ tơm thẻ q trình sản xuất chitin nhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng trình - Sản xuất chitosan có độ deacetyl cao NaOH nồng độ cao điều kiện nhiệt độ thường để dễ dàng triển khai sản xuất quy mô lớn - Sản xuất oligochitosan công nghệ xạ Coban 60 sử dụng oligochitosan sản xuất bảo quản tôm biển Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Đầu vỏ tôm: đầu vỏ tôm dùng nghiên cứu sản xuất oligochitosan phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) thu nhận bàn chế biến Công ty Cổ phần Nha Trang SeaFood (F17) 3.2 Phạm vi nghiên cứu 1) Nghiên cứu sử dụng phối hợp vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B enzyme flavourzyme để khử protein tạp chất lại đầu vỏ tơm thẻ chân trắng sản xuất chitin 2) Nghiên cứu sản xuất chitosan có độ deacetyl 90% 3) Nghiên cứu sản xuất oligochitosan phương pháp sử dụng xạ gamma coban 60 4) Nghiên cứu xác định cấu trúc oligochitosan 5) Nghiên cứu đánh giá độc tính oligochitosan 6) Thử nghiệm đánh giá hoạt tính kháng khuẩn oligochitosan 7) Thử nghiệm sử dụng oligochitosan bảo quản tôm nguyên liệu Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu chuẩn Thế giới Việt Nam nghiên cứu thu nhận oligochitosan từ phế liệu đầu vỏ tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei), có sử dụng tốn học để tối ưu hóa nhằm đảm bảo kết thí nghiệm có độ tin cậy cao Kết cấu luận án Luận án gồm 157 trang, 38 trang tổng quan, 13 trang phương pháp nghiên cứu, 87 trang kết nghiên cứu, kết luận trang, 35 bảng số liệu, 91 hình, 136 tài liệu tham khảo (tiếng Việt 28 tài liệu, tiếng Anh 108 tài liệu) phụ lục 32 trang CHƯƠNG I TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHITIN VÀ CHITOSAN Chitosan dẫn xuất chitin, hình thành thực q trình deacetyl hóa chitin (tách nhóm acetyl) khỏi chitin Chitosan polyme sinh học gồm nhóm Dglucosamine (80%) N-acetyl-D-glucosamine (20%) liên kết với nhờ liên kết β(1 →4) mô tả “vật liệu sinh học đa tạo hóa” dẫn xuất chứa nhiều nhóm amin Cơng thức cấu tạo chitosan gần giống chitin cellulose, khác chitosan chứa nhóm amin cacbon thứ Oligochitosan, thu nhờ thủy phân chitosan, loại oligosaccharide có chứa số lượng có hạn phân tử D-glucosamine Khơng giống chitosan tan acid, oligochitosan có cấu trúc mạch ngắn nên dễ tan nước Mặt khác oligochitosan lại có khả kháng khuẩn nên người ta dễ dàng sử dụng oligochitosan nhiều lĩnh vực thực phẩm chẳng hạn sử dung làm phụ gia giúp kéo dài thời gian bảo quản thực phẩm, sử dụng làm tác nhân kháng khuẩn ứng dụng sản xuất chế phẩm sinh học dùng làm phân bón lá,… Chitin Nhóm N-acetyl Chitosan Nhóm amin Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo chitin chitosan 1.2 Q TRÌNH SẢN XUẤT CHITOSAN VÀ OLIGOCHITOSAN Q trình sản xuất chitin dẫn xuất từ phế liệu thủy sản, đặc biệt từ phế liệu đầu vỏ tôm, phụ thuộc vào công nghệ sản xuất, hàm lượng chitin phế liệu Quá trình sản xuất chitin từ phế liệu thủy sản nói chung từ đầu vỏ tơm nói riêng bao gồm ba bước: khử protein, khử khoáng tẩy màu Từ chitin, người ta thường tiến hành q trình deacetyl hóa để tạo thành chitosan sản phẩm khác Để sản xuất chitin từ đầu vỏ tơm, người ta sử dụng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học kết hợp với hóa học hay sử dụng enzyme kết hợp với hóa học,… Trong phương pháp hóa học, trước tiên protein tách khỏi đầu vỏ tôm cách xử lý đầu vỏ tơm dung dịch NaOH lỗng KOH loãng nhiệt độ cao Nồng độ kiềm thường sử dụng khoảng 1% - 10% dải nhiệt độ 30oC ÷ 100oC Thời gian xử lý kiềm khác khoảng 30 phút ÷ 12 Sau đó, canxi cacbonat, canxi phosphat loại muối khoáng khác phế liệu đầu vỏ tôm tách cách xử lý đầu vỏ tôm dung dịch acid loãng Tỉ lệ acid sử dụng phải phải đủ lớn để đảm bảo tách hồn tồn muối khống đầu vỏ tôm Thường người ta sử dụng acid HCl để khử khống nhiệt độ phòng, thời thời gian từ – 3h Quá trình tẩy trắng chitin thường sử dụng chất tẩy trắng NaOCl, H2O2,… hầu hềt tiến hành nhiệt độ phòng Quá trình deacetyl chitin thành chitosan thực dung dịch NaOH KOH đặc (40% - 50%) thực nhiệt độ cao từ 80oC - 100oC Chitin chitosan thủy phân HCl đậm đặc nhiệt độ cao để tạo monome glucosamine Tuy nhiên, trình thủy phân chitin chitosan phương pháp hóa học thường tạo oligose có trọng lượng phân tử khơng định hướng số lượng lớn monome Mặt khác, trình thủy phân chitin chitosan phương pháp hóa học tạo hợp chất không mong muốn nguy ô nhiễm môi trường Ngồi phương pháp hóa học, người ta sản xuất chitin, chitosan phương pháp sinh học sử dung enzyme hay vi sinh vật Trong sản xuất chitin phương pháp sinh học sử dụng enzyme vi sinh vật để khử protein khoáng chất đầu vỏ tơm, hàm lượng protein lại chitin thường cao phương pháp hóa học Do người ta kết hợp phương pháp sinh học sử dụng enzyme phương pháp hóa học để đảm bảo hàm lượng protein lại chitin thấp Hiện thị trường có sẵn số enzyme protease thương mại có khả khử protein đầu vỏ tơm alcalase (EC 3.4.21.62), chymotrypsin (EC 3.4.21.2), papain (EC 4.3.22.2) bromelain (EC 3.4.22.32) Sau thu chitin, người ta thưởng sử dụng phương pháp hóa học để deacetyl chitin tạo thành chitosan Từ chitosan thu được, người ta sử dụng enzyme thủy phân liên kết glycosid để thủy phân chitosan thành oligochitosan Người ta cho có số enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật có khả thủy phân chitosan chitinase, chitosanase, … Theo số nhà nghiên cứu, phương pháp sử dụng enzyme thủy phân chitosan thành oligochitosan có ưu điểm hiệu suất thủy phân cao oligomer thu có chiều dài mạch lớn phương pháp hóa học Mặc dù, chitosanase vi khuẩn cho tuyệt vời cho sản xuất oligochitosan, song phương pháp coi đắt sản xuất quy mơ cơng nghiệp Hiện nay, người ta chia phương pháp sản xuất oligochitosan từ chitosan thành loại sau: - Phân cắt chitosan tác nhân hố học: acid vơ (HCl, H2SO4, H3PO4, HNO2…), acid hữu (CH3COOH, HCOOH…), chất oxi hoá (O3, H2O2…),… - Phân cắt tác nhân lý học: tia X, ánh sáng, vi sóng hay chiếu xạ gamma, … - Phân cắt tác nhân sinh học (enzyme): chitosanase, chitinase, cellulase, hemicellulase,… Trong phương pháp kể trên, phương pháp sử dụng chiếu xạ gamma để phân cắt chitosan nhiều nhà khoa học cho có triển vọng lớn giá thành sản xuất thấp quan trọng oligomer thu có kích cỡ trọng lượng phân tử điều chỉnh thơng qua điều chỉnh liều chiếu xạ 1.3 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG OLIGOCHITOSAN Oligochitosan hợp chất có nguồn gốc tự nhiên, khơng độc hại, sản phẩm trình thủy phân chitosan khả tan nước tốt có tính chất sinh học gần giống chitosan có khả kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, Vì vậy, oligochitosan theo số nhà khoa học ứng dụng nhiều lĩnh vực bảo quản chế biến thực phẩm Tuy nhiên, nhà nghiên cứu chủ yếu tập trung vào nghiên cứu ứng dụng chitin, chitosan nghiên cứu ứng dụng oligochitosan quan tâm nghiên cứu thời gian gần Theo số tài liệu nghiên cứu cơng bố gần đây, oligochitosan có số tác dụng như: kháng hạn chế phát triển vi sinh vật, chống oxy hóa, chống phát triển tế bào ung thư có số hoạt tính sinh học khác Một số nhà nghiên cứu cho thủy phân chitosan thành chitosan oligosaccharide phương pháp hóa học sử dụng acid HCl đậm đặc (oligochitosan) Sản phẩm sản xuất theo quy trình đạt hiệu suất 70% Các tác giả bước đầu nghiên cứu đề xuất quy trình sản xuất oligochitosan cách sử dụng enzyme cellulase, hemicellulase, papain để thủy phân chitosan Ngồi ra, số tác giả thử nghiệm sử dụng enzyme cellulase kỹ thuật từ xạ khuẩn ưa nhiệt để thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan với hiệu suất thu oligochitosan từ chitosan 52,6% Một số tác giả cho sử dụng enzyme hemicellulase thương phẩm để thủy phân chitosan tạo thành oligochitosan thu 88,9% oligochitosan từ chitosan Một nghiên cứu cho thấy sử dụng enzyme hemicellulase để thủy phân chitosan thành oligochitosan điều kiện thích hợp cho q trình thủy phân chitosan enzyme hemicellulase nấm mốc: nhiệt độ thích hợp 37oC, pH thích hợp 5, nồng độ enzyme 2%, thời gian thủy phân Oligochitosan thu sử dụng bảo quản sữa tươi với tỷ lệ sử dụng oligochitosan thích hợp cho bảo quản sữa 0,2% - 0,3% Nghiên cứu chế tạo oligochitosan kỹ thuật xạ cho thấy khối lượng phân tử chitosan giảm liều xạ tăng, chiếu xạ dung dịch chitosan 10% acid acetic nhận oligochitosan chiếm 50% khối lượng sản phẩm Nghiên cứu chế tạo oligochitosan phương pháp chiếu xạ dung dịch chitosan acid lactic cho thấy hàm lượng oligochitosan tan nước pH=7 đạt khoảng 75%, độ deacetyl oligochitosan thay đổi không đáng kể so với chitosan ban đầu Một số nghiên cứu sử dụng chitosan oligosaccharide bảo quản nông, thủy sản sau thu hoạch: - Trong bảo quản cá ngân: sử dụng oligochitosan nồng độ 1% có khả giữ tươi cá sau nhiệt độ phòng, kết hợp với bảo quản lạnh nhiệt độ – 10oC sau 36 giờ, da cá sáng bóng tự nhiên, chưa xuất mùi lạ Oligochitosan có tác dụng làm giảm gia tăng hàm lượng NH3 cá oligochitosan có khả ức chế sinh trưởng phát triển vi sinh vật gây thối, ngồi ra, có tác dụng đáng kể giảm lượng vi sinh vật tổng số bề mặt cá - Trong bảo quản thịt bò, thịt heo tươi: nồng độ oligochitosan tối ưu để giữ tươi thịt 2%, kết hợp giữ tươi thịt nhiệt độ thấp (8 – 10oC) hiệu giữ tươi tăng lên đáng kể, giữ tươi ngày Ở điều kiện nhiệt độ thường, oligochitosan có tác dụng làm giảm 90% vi sinh vật bề mặt thịt Nếu dùng oligochitosan 2% kết hợp với sorbitol 2% thời gian bảo quản dài hơn, làm giảm 95% lượng vi sinh vật tổng số bề mặt thịt - Khi so sánh khả bảo quản dứa chitosan oligochitosan màng bao chitosan có tác dụng hạn chế hao hụt trọng lượng tốt oligochitosan Tuy nhiên kết hợp với bảo quản lạnh khả diệt khuẩn oligochitosan lại tốt chitosan Từ nghiên cứu chitosan nước giới cho thấy chitosan có nhiều đặc tính phù hợp cho việc sử dụng bảo quản thực phẩm có nguồn gốc tự nhiên từ vỏ tơm cua nên khơng độc hại có tính kháng khuẩn Mức độ kháng khuẩn chúng phụ thuộc vào cấu trúc mức độ deacetyl Độ deacetyl lớn, cấu trúc mạch nhỏ mức độ định có tính kháng khuẩn mạnh việc ứng dụng bảo quản thực phẩm có hiệu Hiện tại, nghiên cứu ứng dụng oligochitosan bảo quản thực phẩm bắt đầu nghiên cứu chưa nghiên cứu cách đầy đủ có số nghiên cứu chứng minh oligochitosan có tính kháng khuẩn tốt 10 tơm tốt chủng khác Do chủng L plantarum VTCC-B 431 lựa chọn sử dụng để nghiên cứu trình khử protein khỏi đầu vỏ tôm thẻ 3.2.2.2 Nghiên cứu sản xuất chitin từ đầu vỏ tôm phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 để khử protein tạp chất 3.2.2.2.1 Xác định điều kiện thích hợp cho việc sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCCB 431 khử protein đầu vỏ tôm * Xác định tỷ lệ vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung Tiến hành nhân giống vi khuẩn L plantarum VTCC 431 thu sinh khối vi khuẩn có mật độ tế bào 2.109 cfu/ml để dùng cho trình nghiên cứu khử protein đầu vỏ tôm Kết nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ dịch sinh khối vi khuẩn bổ sung vào đầu vỏ tôm thẻ để thực việc khử protein khoáng chất lựa chọn 10% * Xác định thời gian lên men Kết nghiên cứu cho thấy, thời gian khử khoáng protein từ đầu vỏ tơm L plantarum VTCC-B 431 thích hợp ngày * Xác định pH lên men Khi pH mơi trường 6,5 hiệu khử khống hiệu khử protein cao đạt mức 72,53% 79,79% Kết nghiên cứu cho thấy, pH thích hợp cho q trình xử lý protein, khống đầu vỏ tôm vi khuẩn L plantarum VTCC 431 pH > 6,5 để thuận tiện cho trình nghiên cứu chọn pH =7 * Xác định tỷ lệ rỉ đường bổ sung thích hợp Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ rỉ đường bổ sung để lên men đầu vỏ tôm phù hợp 10% (w/w) 3.2.2.2.2 Nghiên cứu tối ưu hóa q trình khử protein đầu vỏ tôm vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 * Xác định mơ hình hồi quy Y = 8,83 - 0,13A + 0,37B + 0,19C + 0,091AB + 0,099AC + 0,034BC - 0,78A2 - 0,36B2 0,33C2 (1) Từ đồ thị đường đồng mức 3D biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường, nồng độ vi khuẩn thời gian lên men đến hiệu khử protein, chọn khoảng tối ưu chế độ lên men vi khuẩn L plantarum VTCC-B431 tỷ lệ rỉ đường (9,0 ÷ 18,0%), tỷ lệ vi khuẩn bổ sung (10 ÷ 12%), thời gian lên men (5,5 ÷ ngày) 20 Hình 3.4 Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường tỷ lệ vi khuẩn đến hiệu khử protein vi khuẩn L plantarum Hình 3.5 Ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường tỷ lệ vi khuẩn đến hiệu khử protein vi khuẩn L plantarum Hình 3.6 Đường đồng mức biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường thời gian lên men đến hiệu khử protein vi khuẩn L plantarum Hình 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ rỉ đường thời gian lên men đến hiệu khử protein vi khuẩn L plantarum * Xác định thơng số tối ưu cho q trình lên men Tiến hành tối ưu hóa kiểm chứng lại thí nghiệm cho kết thông số tối ưu cho trình lên men đầu vỏ tơm vi khuẩn L plantarum VTCC-B431: tỷ lệ vi khuẩn bổ sung 11,20%; tỷ lệ rỉ đường 11,15% thời gian lên men 6,19 ngày 3.2.2.3 Nghiên cứu khử protein lại đầu vỏ tôm enzyme flavourzyme Nguyên liệu đầu vỏ tôm sau lên men khử protein vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 chứa lượng protein 9,96% Do đó, đầu vỏ tơm tiếp tục xử lý enzym flavourzyme Quá trình thực nhiệt độ 50oC; pH 7,5 Sau đó, rửa chitin sấy khơ đến độ ẩm 12,3% tiến hành phân tích xác định hàm lượng protein lại Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ enzym flavourzyme bổ sung 0,06% thời gian thủy phân thích hợp cho cơng đoạn khử protein lại sau lên men đầu vỏ tơm vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 21 3.2.2.4 Nghiên cứu khử khống lại chitin thơ HCl Kết nghiên cứu cho thấy, sử dụng HCl với nồng độ 3% thời gian 10 nhiệt độ thường hàm lượng khống lại đầu vỏ tôm đạt thấp 1% 3.2.2.5 Đánh giá chất lượng chitin sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme protease quy trình sử dụng vi khuẩn lactic để khử protein Bảng 3.4 So sánh chất lượng chitin sản xuất theo quy trình nghiên cứu quy trình tham khảo STT Chỉ tiêu chất lượng Chitin Chitin Chitin Trắng sẫm màu Trắng sáng Trắng sáng Màu sắc Độ ẩm (%) 13,5 ± 0,5 12,4 ± 0,5 12,2 ± 0,5 Hàm lượng tro (%) 2,60 ± 0,5 0,99 ± 0,02 0,89 ± 0,02 Hàm lượng protein (%) 3,04 ± 0,7 0,98 ± 0,01 0,79 ± 0,01 Ghi chú: Chitin 1: chitin từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo phương pháp hóa học Chitin 2: chitin từ đầu vỏ tơm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme flavourzyme để khử protein khoáng chất Chitin 3: chitin từ đầu vỏ tơm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 để khử protein khống chất Kết phân tích cho thấy, chitin sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 để khử protein khống chất có hàm lượng protein khống chất thấp quy trình sử dụng enzyme flavourzyme để khử protein khoáng chất Quy trình sản xuất chitin từ đầu vỏ tơm chân trắng phương pháp sử dụng vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 ưu điểm chỗ sau lên men khử protein lại enzyme cần dùng HCl lỗng để khử khống mà khơng phải sử dụng NaOH lỗng để khử protein lại 3.3 NGHIÊN CỨU DEACETYL CHITIN ĐỂ SẢN XUẤT CHITOSAN CÓ ĐỘ DEACETYL CAO Hình 3.8 Hình ảnh phổ FTIR chitosan thu thực deacetyl chitin 120 xút nồng độ: a: NaOH 50%; b: NaOH 45%; c: NaOH 40%; d: NaOH 35%; e: NaOH 30% 22 Luận án tiến hành xác định nồng độ xút thời gian deacetyl thích hợp Kết thúc thời gian deacetyl, lấy mẫu đánh giá độ deacetyl theo kỹ thuật FTIR Kết nghiên cứu cho thấy, độ deacetyl chitosan xử lý NaOH 50% 120 đạt cao Từ nghiên cứu, luận án đề xuất quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl cao 90% hình 3.9 Vi khuẩn L plantarum VTCC-B431 Đầu vỏ tôm Rửa sơ Nhân giống 2.109 cfu/ml Lên men Rỉ đường 11,15% (w/w) Nước/nguyên liệu: 1/1 Tỷ lệ vi khuẩn: 11,20% (v/w) Thời gian: 6,19 ngày pH ban đầu: 7,0 Ép Dịch protein Chitin thơ Thu hồi protein Khử protein lại HCl 3% Tỷ lệ acid/chitin: 2/1 Nhiệt độ phòng Thời gian: 10h Enzyme flavourzyme Tỷ lệ enzyme: 0,06% Nhiệt độ: 50oC pH: 7,5 Thời gian: 8h Rửa Khử khống lại Rửa Nhiệt độ: 50oC Tốc độ gió: 2m/s Sấy NaOH 50% Tỷ lệ xút/chitin: 4/1 Nhiệt độ phòng Thời gian: 120h Chitin Độ ẩm: 12,3% Deacetyl Chitosan Hình 3.9 Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl 90% từ đầu vỏ tôm * Thuyết minh quy trình: + Ngun liệu đầu vỏ tơm: đầu vỏ tơm thẻ chân trắng (P vannamei) thu mua Công ty Cổ phần Nha Trang Seafood (F17), Khánh Hòa Đầu vỏ tôm tươi sau thu mua, vận chuyển 23 phòng thí nghiệm + Rửa sơ bộ: Tại phòng thí nghiệm, đầu vỏ tơm loại bỏ tạp chất, rửa sơ bộ, đóng túi 5kg/túi, cấp đơng bảo quản – 20oC để dùng trình nghiên cứu + Lên men: Trước lên men khử protein khống chất vi khuẩn lactic, tiến hành ni hoạt hóa vi khuẩn 28 thu dịch sinh khối vi khuẩn có mật độ vi khuẩn 2.109 cfu/ml để dùng làm giống khởi động cho trình lên men khử protein khoáng chất đầu vỏ tôm Đầu vỏ tôm sau rã đông, bổ sung: nước với tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1, rỉ đường với tỷ lệ 11,15% (w/w), vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 với tỷ lệ 11,20% (v/w) tiến hành lên men nhiệt độ phòng, thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu 7,0 + Ép: Hỗn hợp đầu vỏ tôm sau lên men ép thu dịch thủy phân để tận thu protein phục vụ cho chăn nuôi Bã đầu vỏ tôm (gọi chitin thô) rửa sơ sử dụng cho công đoạn tái khử protein khống chất + Khử protein lại: Sử dụng enzyme flavourzyme để khử phần protein lại chitin thô với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06% nhiệt độ 50oC, pH 7,5, thời gian + Rửa: Chitin thô sau khử protein lại, rửa sơ để làm dịch thủy phân sử dụng cho trình khử khống Nếu lượng chitin thơ q nhiều sấy khơ để dùng dần q trình nghiên cứu + Khử khống chất lại: tiến hành khử khống lại chitin thơ acid HCl 3% với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thô: 2/1 (v/w) thực khử khống nhiệt độ phòng, thời gian 10 + Rửa: Sau khử khoáng, chitin rửa pH trung tính + Làm khơ: sấy khơ chitin nhiệt độ 50oC, tốc độ gió 2m/s đến độ ẩm 12,3% phơi nắng bảo quản bao bì PE để dùng cho trình sản xuất chitosan + Deacetyl: tiến hành deacetyl chitin NaOH 50% nhiệt độ thường thời gian 120 tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1 Kết thúc trình deacetyl, thu chitosan, rửa sấy khô phương pháp sấy lạnh 50oC, tốc độ gió 2m/s * Sản xuất chitosan đánh giá chất lượng Luận án tiến hành sản xuất chitosan theo quy trình đánh giá chất lượng chitosan sản xuất Kết đánh giá trình bày bảng 3.5 Kết phân tích tính chất chitosan cho thấy chitosan sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn lactic kết hợp enzyme protease để khử protein đầu vỏ tơm có độ deacetyl cao chitosan sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme flavourzyme quy trình hóa học Kết phù hợp q trình sản xuất chitin phương pháp sử dụng vi khuẩn lactic kết hợp enzyme protease làm cắt mạch chitin trình khử protein 24 Bảng 3.5 So sánh đánh giá chất lượng chitosan sản xuất theo quy trình đề xuất quy trình tham khảo Tính chất STT Chitosan Chitosan Chitosan Màu sắc Trắng đục Trắng sáng Trắng sáng Độ ẩm (%) 12,7±0,40 12,46±0,40 12,32±0,35 Khoáng (%)* 0,98 ± 0,04 0,48 ± 0,04 0,18 ± 0,04 Protein (%)* 1,11 ± 0,07 0,46 ± 0,02 0,21 ± 0,02 Độ nhớt (cps) 1052 ± 32 1214 ± 23 1117± 23 Độ deacetyl (%) 84,16 ± 1,15 91,69 ± 1,12 93,56 ± 1,12 Độ tan (%) 96,28 ± 0,62 98,12 ± 0,26 99,29 ± 0,22 (*): tính theo hàm lượng chất khô Ghi chú: Chitosan 1: chitosan từ đầu vỏ tơm thẻ sản xuất theo quy trình hóa học Chitosan 2: chitosan từ đầu vỏ tôm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng enzyme flavourzyme Chitosan 3: chitosan từ đầu vỏ tơm thẻ sản xuất theo quy trình sử dụng vi khuẩn lactic 3.4 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM OLIGOCHITOSAN BẰNG KỸ THUẬT BỨC XẠ COBAN 60 3.4.1 Xác định độ hòa tan chitosan dung dịch acid Kết nghiên cứu cho thấy dung dịch acid acetic ln cho hiệu suất hòa tan chitosan cao acid citric Do vậy, luận án chọn dung dịch acid acetic làm dung mơi hòa tan chitosan Ở tỷ lệ chitosan sử dụng 10% độ hòa tan chitosan dung dịch acid acetic 1% đạt 90% Vì vậy, để giảm thể tích chiếu xạ luận án chọn tỷ lệ chitosan hòa tan acid acetic 1% 10% (w/v) 3.4.2 Xác định liều xạ thích hợp cho việc cắt mạch chitosan tạo oligochitosan Kết phân tích cho thấy liều chiếu xạ phù hợp cho trình phân cắt chitosan dạng dung dịch khoảng 50-70 kGy liều chiếu xạ phù hợp cho trình phân cắt chitosan dạng vảy khơ > 150kGy Tuy nhiên, thực q trình chiếu xạ khơ, chế phẩm sau chiếu xạ có đặc tính trạng thái khô nên dễ vận chuyển, bảo quản, sử dụng quan trọng giá thành chế phẩm thấp 3.4.3 Tách phân đoạn chitosan sau chiếu xạ Quá trình tách phân đoạn oligochitosan từ chitosan sau chiếu xạ trình bày bảng 3.6 25 Bảng 3.6 Kết tách phân đoạn chế phẩm oligochitosan sau chiếu xạ Dạng chiếu Liều xạ Tỷ lệ phân đoạn (%) xạ (> 16 monose) (9- 16 monose) (5- monose) Chitosan 50kGy 52,46±0,3 34,21±0,3 13,23±0,2 dạng dịch 60kGy 36,94±0,3 47,38±0,3 15,68±0,2 lỏng STT 66kGy 23,76±0,3 56,27±0,3 19,97±0,2 70kGy 20,58±0,3 55,11±0,3 24,31±0,2 76kGy 16,29±0,3 50,62±0,3 33,09±0,2 100kGy 76,26±0,3 22,53±0,2 1,21±0,1 150kGy 48,36±0,3 48,16±0,32 3,48±0,1 160kGy 28,82±0,3 60,46±0,3 10,72±0,2 166kGy 18,67±0,2 65,08±0,3 16,25±0,2 10 170kGy 14,19±0,3 59,34±0,3 26,47±0,2 Chitosan dạng vẩy Sử dụng phổ FTIR để đánh giá cấu trúc sản phẩm sau chiếu xạ chitosan Các kết phân tích cho thấy chitosan oligochitosan phân đoạn khơng có thay đổi đáng kể cấu trúc chứng tỏ phân đoạn đoạn ngắn phân cắt từ chitosan Trái lại phân đoạn đỉnh 1320; 1379 2900 biến đồng thời xuất số đỉnh 2359, 1414 808 Các đỉnh đặc trưng tái tạo nhóm chức làm gia tăng khối lượng thay đổi phần cấu trúc sản phẩm 100 %T 97.5 100 %T 90 60 87.5 87.5 50 85 85 40 82.5 82.5 30 80 80 20 77.5 77.5 10 75 75 3750 3250 Chitosan 2750 2250 1750 1250 750 500 1/cm Hình 3.10 Phổ FTIR chitosan 3750 3250 Chitosan PD1 2750 2250 1750 1250 750 500 1/cm 3750 3250 Chitosan PD3 2750 2250 1750 1250 642.72 808.59 Hình 3.12 Phổ FTIR oligochitosan phân đoạn oligochitosan phân đoạn Kết Đơn vị Kết Đơn vị 3,1754e2 g/mol 317,54 Da Mẫu chế phẩm CTS 66kGy Mn 750 500 1/cm Hình 3.11 Phổ FTIR Bảng 3.7 Kết xác định phổ sắc ký gel thấm qua (GPC) chế phẩm chitosan chiếu xạ dịch lỏng với liều xạ khác Trọng lượng phân tử 1020.74 1414.20 1558.85 1709.28 -20 2359.25 -10 3177.01 577.15 1072.82 1383.34 1315.83 1541.49 1657.21 70 2883.85 72.5 3495.25 1072.82 70 1657.21 72.5 590.65 90 1543.42 70 90 1379.48 1317.76 80 2881.92 95 92.5 3524.18 95 92.5 3423.88 100 %T 97.5 26 Mw 5,8182e2 g/mol 581,82 Da Mz 9,5674e2 g/mol 956,74 Da Mv 5,8182e2 g/mol 581,82 Da 10% 1,4983e2 g/mol 149,83 Da 30% 2,8017e2 g/mol 280,17 Da 50% 4,4255e2 g/mol 442,55 Da 70% 6,8807e2 g/mol 688,07 Da 90% 1,2059e3 g/mol 1.205,9 Da Mn 2,9388e2 g/mol 293,88 Da Mw 5,3019e2 g/mol 530,19 Da Mz 8,4497e2 g/mol 844,97 Da Mv 5,3019e2 g/mol 530,19 Da 10% 1,3914e2 g/mol 139,14 Da 30% 2,6112e2 g/mol 261,12 Da 50% 4,1112e2 g/mol 411,12 Da 70% 6,3571e2 g/mol 635,71 Da 90% 1,0943e3 g/mol 1.094,3 Da Mn 2,4840e2 g/mol 248,40 Da Mw 4,5751e2 g/mol 457,51 Da Mz 8,5489e2 g/mol 854,89 Da Mv 4,5751e2 g/mol 457,51 Da 10% 1,1655e2 g/mol 116,55 Da 30% 2,2145e2 g/mol 221,45 Da 50% 3,4928e2 g/mol 349,28 Da 70% 5,4154e2 g/mol 541,54 Da 90% 1,1089e3 g/mol 1.108,9 Da Mn 2,0526e2 g/mol 205,26 Da Mw 5,7652e2 g/mol 576,52 Da Mz 9,1020e2 g/mol 910,20 Da Mv 3,7652e2 g/mol 376,52 Da 10% 9,5916e1 g/mol 95,916 Da 30% 1,8274e2 g/mol 182,74 Da 50% 2,8905e2 g/mol 289,05 Da Trọng lượng phân tử theo đỉnh Mẫu chế phẩm CTS 76kGy Trọng lượng phân tử theo đỉnh Mẫu chế phẩm CTS 100kGy Trọng lượng phân tử theo đỉnh Mẫu CTS 166 kGy Trọng lượng phân tử theo đỉnh 27 70% 4,4929e2 g/mol 449,29 Da 90% 2,2108e3 g/mol 2.210,8 Da Mn 5,5399e2 g/mol 553,99 Da Mw 1,2444e3 g/mol 1.244,4 Da Mz 1,9743e3 g/mol 1.974,3 Da Mv 1,2444e3 g/mol 1.244,4 Da 10% 2,4085e2 g/mol 240,85 Da 30% 5,9055e2 g/mol 590,55 Da 50% 1,0096e3 g/mol 1.009,6 Da 70% 1,5748e3 g/mol 1.574,8 Da 90% 2,6020e3 g/mol 2.602,0 Da Mẫu CTS 166kGy (phân đoạn 2) Trọng lượng phân tử theo đỉnh Kết phân tích cho thấy, tất mẫu có khối lượng phân tử 1,5kDa, đại đa số khoảng 30 Da So sánh với tài liệu cho thấy chitosan oligosaccharide có khối lượng phân tử từ 10kDa trở xuống Như tất mẫu tồn dạng oligochitosan Tiến hành phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân mẫu chiếu xạ chitosan dạng rắn với liều xạ 166 kGy C5+C5’ C6+C6’ C=O C1+C1’ C4+C4’ C3+C3’ C2+C2’ - CH3 CH3CH2OH Hình 3.13 Phổ 1H-NMR chế phẩm oligochitosan phân đoạn Hình 3.14 Phổ 13C-NMR Hình 3.15 Phổ HSQC Hình 3.16 Phổ COSY 28 Xác định đoạn mạch có khoảng 13 monomer Hình 3.17 Cấu trúc hóa học oligochitosan 3.4.6 Nghiên cứu đánh giá khả kháng khuẩn oligochitosan 3.4.6.1 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm oligochitosan phương pháp MIC Từ kết nghiên cứu cho thấy chế phẩm oligochitosan sản xuất có hoạt tính kháng tất loại vi khuẩn thử nghiệm bao gồm E coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S aureus, Listeria monocytogenes B subtilis Trong đó, chế phẩm chiếu xạ oligochitosan dạng vẩy liều xạ 166kGy có hoạt tính kháng khuẩn cao hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm khác bao gồm chế phẩm chiếu xạ chitosan dạng dịch lỏng 3.4.6.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn chế phẩm oligochitosan phương pháp nuôi cấy đĩa thạch Kết phân tích cho thấy độ pha lỗng 1/8 (tức nồng độ oligochitosan 0,125%) có khả ức chế hoàn vi khuẩn E coli O157:H7 nồng độ 0,0625% chế phẩm ức chế hoàn toàn vi khuẩn B subtilis Listeria monocytogenes Trong đó, khả kháng vi khuẩn Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus oligochitosan dạng khả kháng hoàn toàn loại vi khuẩn oligochitosan độ pha loãng 1/2 tức nồng độ 0,50% 3.4.7 Đề xuất quy trình hồn thiện sản xuất oligochitosan phương pháp sử dụng xạ gamma coban 60 Từ kết nghiên cứu, luận án đề xuất quy trình hồn thiện sản xuất oligochitosan phương pháp sử dụng xạ gamma coban 60 trình bày hình 3.18 * Thuyết minh quy trình + Chitosan: sử dụng chitosan sản xuất theo quy trình luận án Sau sản xuất xay nhỏ thành dạng vẩy để đảm bảo cho trình chiếu xạ chitosan thuận lợi + Đóng túi PE: bao gói chitosan dạng vẩy túi PE hút chân không, túi chứa 30g chitosan + Chiếu xạ: sau chuẩn bị xong mẫu, tiến hành chiếu xạ nguồn xạ gamma Coban60 với liều chiếu 166 kGy + Chế phẩm oligochitosan: chế phẩm chitosan sau chiếu xạ có thành phần tạp chất 29 giống chitosan ban đầu chứa loại oligochitosan bị phân cắt xạ gamma Coban-60 Chitosan Xay nhỏ Đóng túi PE Chiếu xạ Co-60 với liều xạ 166kGy Chế phẩm oligochitosan (khơ) Hình 3.18 Quy trình sản xuất oligochitosan phương pháp chiếu xạ gamma Coban-60 3.4.8 Thử nghiệm độc tính oligochitosan chuột lang thí nghiệm Thời gian nghiên cứu bao gồm giai đoạn: 20 ngày cho uống oligochitosan 20 ngày theo dõi Gan Lách Thận Hình 3.19 Hình ảnh vi thể gan, lách, thận chuột lang uống oligochitosan * Quan sát giải phẫu dày Hình 3.20 Dạ dày chuột đối chứng Hình 3.21 Dạ dày chuột uống oligochitosan (Bên ngồi bình thường, bên bình thường) (Bên ngồi bình thường, bên bình thường) Các kết đánh giá độc tính với tổng liều oligochitosan 20 ml/chuột cho nhóm 1; 10 ml/chuột cho nhóm chia suốt 20 ngày sau 20 ngày theo dõi cho thấy chế phẩm oligochitosan không gây độc cho chuột lang, thể hiện: - Toàn chuột nghiên cứu sống, khỏe mạnh, tăng trọng tốt, khơng khác biệt so với nhóm chứng 30 - Chuột có khả dung nạp tốt, khơng có phản ứng bất thường xảy sau uống sản phẩm nghiên cứu suốt thời kỳ nghiên cứu - Các kết xét nghiệm huyết học, số men gan (SGOT SGPT) xét nghiệm 10 số sinh hóa nước tiểu cho thấy giá trị khơng khác biệt so với nhóm chứng - Kết giải phẫu bệnh cho thấy đại thể tất quan hồn tồn bình thường, trọng lượng tươi gan, lách, thận (2 bên) khác biệt so với nhóm chứng Quan sát vi thể gan, lách, thận cho thấy khơng có tổn thương khác biệt chuột uống sản phẩm nghiên cứu hay uốngnước muối sinh lý (nhóm chứng) Từ kết nghiên cứu độc tính chuột lang kết luận sản phẩm oligochitosan an tồn khơng gây độc sử dụng đường uống 3.5 SỬ DỤNG OLIGOCHITOSAN TRONG BẢO QUẢN TÔM BẠC NGUYÊN LIỆU 3.5.1 Xác định nồng độ oligochitosan thích hợp cho q trình bảo quản tơm Các kết đánh giá cảm quan, phân tích hàm lượng NH3, hoạt tính chống oxy hóa pH cho thấy sau ngày bảo quản tôm nhiệt độ ÷ 4oC mẫu tơm bảo quản cách nhúng dung dịch oligochitosan 1% có chất lượng tốt Kết cho phép chọn nồng độ oligochitosan thich hợp cho bảo quản tôm bạc biển 1% 3.5.2 Xác định chế độ bảo quản tôm nguyên liệu oligochitosan Kết nghiên cứu luận án cho thấy sau ngày bảo quản tơm khơng khí lạnh nhiệt độ ÷ 4oC, mẫu dùng oligochitosan 1% với thời gian nhúng phút ÷ phút có chất lượng cảm quan tốt nhất, hàm lượng NH3 thấp nhất, hoạt tính chống oxy hóa tơm giảm chậm pH tăng chậm Luận án nghiên cứu chế độ bao gói tơm bảo quản nhận thấy sau ngày bảo quản mẫu tôm xử lý oligochitosan 1% xếp rổ nhựa bị biến đổi chậm nên giữ chất lượng cảm quan tôm tốt hơn, hàm lượng NH3 tăng chậm hơn, hoạt tính chống oxy hóa tổng tơm giảm chậm pH tăng chậm bao gói bao bì PE Kết đánh giá vi sinh vật mẫu tôm sau ngày bảo quản cho thấy tổng số vi sinh vật mẫu đối chứng, mẫu qua xử lý oligochitosan 1% bao gói bao bì PE mẫu oligochitosan 1% chứa rổ nhựa là 4,0 x 105 (cfu/g); 3,3 x 105 (cfu/g); 1,4 x 105 (cfu/g) Như vậy, mẫu tơm chưa qua xử lý oligochitosan có tổng số vi sinh vật hiếu khí bề mặt tơm cao gấp 2,9 lần so với mẫu xử lý oligochitosan 1% chứa rổ nhựa nhiều gấp 1,2 lần so với mẫu xử lý oligochitosan 1% bao gói bao bì PE Như vậy, tơm bạc nhúng oligochitosan 1% xếp rổ nhựa bảo quản ÷ 4oC phù hợp 3.5.3 Đề xuất quy trình bảo quản tơm oligochitosan Luận án đề xuất quy trình bảo quản tôm oligochitosan sau: 31 Nguyên liệu Rửa Để Nhúng dung dịch oligochitosan 1%, phút Để Xếp vào khay nhựa Bảo quản lạnh (0oC – 4oC) Hình 3.22 Sơ đồ quy trình bảo quản tơm ngun liệu oligochitosan Thuyết minh quy trình: + Ngun liệu: ngun liệu tơm tươi, có màu sắc tự nhiên, mùi tự nhiên, thịt phải săn + Rửa: Nguyên liệu rửa nước sạch, nhiệt độ rửa 10oC ÷ 15oC + Để ráo: sau rửa, vớt tôm rổ, để nước + Nhúng dung dịch oligochitosan 1%: tôm nhúng dung dịch oligochitosan 1% thời gian phút + Để ráo: tôm vớt rổ để xếp vào khay nhựa + Xếp vào khay nhựa: tôm xếp vào khay nhựa để đưa vào bảo quản + Bảo quản: Bảo quản nguyên liệu điều kiện lạnh 0oC – 4oC 32 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN Các kết nghiên cứu cho thấy Luận án hoàn thành tất nội dung mục tiêu nghiên cứu đặt Thể qua kết luận rút từ kết nghiên cứu sau: 1) Các thơng số thích hợp cho quy trình sản xuất chitin phương pháp sinh học sử dụng phối hợp vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 để lên men khử protein đầu vỏ tôm thẻ enzyme flavourzyme để khử protein tạp chất lại đầu vỏ tơm thẻ chân trắng: vi khuẩn lactic L plantarum VTCC-B 431 nuôi hoạt hóa 28 để thu dịch sinh khối có mật độ tế bào 2.109 cfu/ml, tỷ lệ nước/nguyên liệu 1/1, tỷ lệ rỉ đường bổ sung 11,15% (w/w), tỷ lệ dịch vi khuẩn L plantarum VTCC-B 431 bổ sung 11,20% (v/w), lên men nhiệt độ phòng, thời gian 6,19 ngày với pH ban đầu 7,0; Sử dụng enzyme flavourzyme khử protein lại đầu vỏ tôm thẻ chân trắng sau lên men với tỷ lệ enzyme sử dụng 0,06%, nhiệt độ thủy phân 50oC pH 7,5, thời gian 8h Sử dụng acid HCl 3% khử khống lại chitin thơ với tỷ lệ dung dịch acid/chitin thơ: 2/1 Q trình khử khống lại thực nhiệt độ phòng thời gian 10h Chitin sản xuất có chi phí ngun vật liệu 111.000 đồng/kg 2) Các thơng số thích hợp cho quy trình sản xuất chitosan có độ deacetyl 90%: deacetyl chitin NaOH 50% nhiệt độ phòng thời gian 120h tỷ lệ dung dịch NaOH so với chitin 4/1 Chitosan sản xuất theo quy trình có độ deacetyl 93% có chi phí nguyên vật liệu 361.365 đ/kg 3) Sản xuất chế phẩm oligochitosan cách sử dụng xạ gamma coban 60 phân cắt chitosan dạng vẩy với cường độ 166kGy Oligochitosan thu sau chiếu xạ có phân đoạn có khả kháng loại vi khuẩn: E coli O157:H7, Salmonella typhimurium, S aureus, B subtilis Listeria monocytogenes 4) Thử nghiệm độc tính oligochitosan chuột thí nghiệm phân tích máu, nước tiểu, giải phẫu, cắt lát quan sát vi thể gan thận, lách chuột sử dụng oligochotosan cho thấy oligochitosan hoàn toàn an tồn khơng gây độc cho chuột thí nghiệm 5) Đã nghiên cứu xây dựng quy trình bảo quản tôm cách nhúng chế phẩm oligochitosan với nồng độ 1% thời gian phút Tôm nguyên liệu xử lý oligochitosan 1% bảo quản ngày điều kiện mát mà đạt tiêu chuẩn chất lượng dùng làm nguyên liệu chế biến ĐỀ XUẤT Ý KIẾN - Tiếp tục triển khai bảo quản nguyên liệu tôm biển oligochitosan quy mô lớn tập huấn, chuyển giao quy trình bảo ngun liệu tơm biển oligochitosan cho tầu cá đánh bắt xa bờ người dân 33 - Cần tiếp tục nghiên cứu mở rộng ứng dụng oligochitosan đối tượng nguyên liệu thủy sản khác - Cần tiếp tục nghiên cứu hồn thiện việc sản xuất oligochitosan qui mơ cơng nghiệp để giảm giá thành oligochitosan DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA LUẬN ÁN Vũ Ngọc Bội, Nguyễn Thị Mỹ Trang, Hoàng Thị Kim Hạnh, Nguyễn Văn Minh, Vũ Thị Hoan, Lê Hải, Lê Lập (2013), “Assessment of antibacterial activities of oligochitosan segmented from chitosan using cobalt - 60 radiation technology", International workshop on Agricultural engineering and post - harvest technology for Asia sustainability, 5-6 December 2013, Hanoi, Vietnam, Ministry of Science and Technology, Science and Technics Publishing House, pp 331338 Vũ Thị Hoan, Vũ Ngọc Bội (2016), “Ảnh hưởng chitosan, oligochitosan oligochitin lên chất lượng tôm bạc theo thời gian bảo quản”, Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản, Số 4-2016, Trường Đại học Nha Trang, trang 27-33 34 ... làm nguyên liệu chế biến Nghiên cứu cho thấy hồn tồn sử dụng oligochitosan bảo quản thủy sản - nghiên cứu triển khai thực tế góp hạn chế việc lạm dụng hóa chất bảo quản nguyên liệu thủy sản CÁN... tính kháng khuẩn oligochitosan 7) Thử nghiệm sử dụng oligochitosan bảo quản tôm nguyên liệu Phương pháp nghiên cứu Luận án sử dụng phương pháp nghiên cứu chuẩn Thế giới Việt Nam nghiên cứu thu nhận... khai sản xuất quy mô lớn - Sản xuất oligochitosan công nghệ xạ Coban 60 sử dụng oligochitosan sản xuất bảo quản tôm biển Đối tượng phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu Đầu vỏ tôm: đầu vỏ tôm