Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu

Tính cấp thiết của đề tài Từ lâu, vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật được coi là an toàn GRAS vàviệc ứng dụng thành công nhóm vi khuẩn này hay những hợp chất kháng vi sinh vật mà chúng

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi.Các số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận án là trung thực, một phần đãđược công bố trên các tạp chí, tập san khoa học với sự đồng ý của các đồng tác giả,phần còn lại chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ thực hiện luận án đã được cảm ơn vàcác thông tin trích dẫn trong luận án này đều đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận án

Bùi Kim Thúy

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạođiều kiện của Lãnh đạo Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạch, cácnhà khoa học trong và ngoài nước Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sựgiúp đỡ này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Duy Lâm vàPGS.TS Nguyễn Thị Hoài Trâm, những thầy cô giáo trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảotận tình cho tôi hoàn thành luận án

Tôi xin trân trọng cảm ơn Vụ Khoa học và công nghệ, Bộ Công Thương đã

hỗ trợ một phần kinh phí để thực hiện đề tài nghiên cứu này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ Phòng Vi sinh học phân tử, ViệnCông nghệ sinh học đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện thínghiệm phục vụ luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp của tôi đang công tác tạiViện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchvà gia đình đã động viên,khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thànhluận án này

Hà Nội, ngày 3 tháng 10 năm 2016

Tác giả luận án

Bùi Kim Thúy

MỤC LỤC

KÍ HIỆU VIẾT TẮT

AA : Axít ascorbicBZN : Benzoat natriCBTT : Chế biến tối thiểuCFU/ml : Colony Forming Unit

Số đơn vị khuẩn lạc/ml mẫu

CL : Canxi lactatFAO : Food and Agriculture Organization

Tổ chức lương thực và nông nghiệp

FDA : Food and Drug Administration

Cục Quản lý thuốc và dược phẩm Hoa Kỳ

GRAS : Generally Recognized as Safe

Chứng nhận tuyệt đối an toàn

HPLC : High Pressure Liquid Chromatography

Sắc kí lỏng cao áp

MAP : Modified Atmosphere Packaging

Bao gói khí điều biến

MIC : Minimum Inhibitory Concentration

Nồng độ ức chế tối thiểu

MRS : Man Rogosa SharpePDA : Potatoes Dextrose AgarPLA : Axít phenyllacticPPA : Axít phenylpyruvicPVC : Polyvinylchloride

Màng nhựa dẻo

TCVN : Tiêu chuẩn Việt NamTSS : Tổng số chất rắn hòa tanVKHKTS : Vi khuẩn hiếu khí tổng sốNMNMT

S : Nấm men, nấm mốc tổng số

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Từ lâu, vi khuẩn lactic là nhóm vi sinh vật được coi là an toàn (GRAS) vàviệc ứng dụng thành công nhóm vi khuẩn này hay những hợp chất kháng vi sinh vật

mà chúng sản sinh ra trong bảo quản thực phẩm đã được đề cập nhiều Một số loạichế phẩm sinh học đã được thử nghiệm và ứng dụng trong thực tiễn đem đến hiệuquả cao như bacterioxin và một số loại axít hữu cơ như axít lactic, axetic, xitric.Bacterioxin là các hợp chất có bản chất protein có khả năng ức chế vi sinh vật khátốt được ứng dụng nhiều trong thực phẩm tuy phổ kháng vi sinh vật không rộng[35] Trong khi đó, axít lactic, axít axetic và axít xitric lại có khả năng phòng trừ visinh vật tương đối yếu Do vậy, những loại axít này thường được sử dụng kết hợpvới những hợp chất khác để làm tăng hiệu quả Gần đây, một hợp chất sinh học mới

có tiềm năng ứng dụng như là chất bảo quản thực phẩm được sinh tổng hợp bởinhóm vi khuẩn lactic được các nhà khoa học thế giới phát hiện có tên là axítphenyllactic So với nhiều loại bacterioxin sản sinh bởi vi khuẩn lactic như nisin thìaxít phenyllactic có khối lượng phân tử thấp, phổ kháng vi sinh vật rộng và tính bềncũng như độ hòa tan cao [109] Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng axítphenyllactic là một hợp chất an toàn, có khả năng ức chế cả vi khuẩn gram âm lẫngram dương và nấm men, nấm mốc, đặc biệt là nhiều loài nấm sinh độc tố [54][100][110]

Trước những lợi ích cũng như tiềm năng đã được kiểm chứng thì axítphenyllactic là sản phẩm rất phù hợp sử dụng cho những đối tượng nông sản, thựcphẩm dễ bị lây nhiễm bởi vi sinh vật gây hại và đòi hỏi có tính an toàn cao khi sửdụng Rau quả chế biến tối thiểu (CBTT) là một trong những đối tượng nông sảnđang được người tiêu dùng hướng tới hiện nay với tiêu chí đảm bảo độ tươi, ngon,tiện dụng và an toàn ít sử dụng hóa chất bảo quản nhất Hơn nữa, rau quả chế biếnthối thiểu là một dạng sơ chế, là những sản phẩm rau quả tươi đã thay đổi hình dạngban đầu bằng một số tác động nhưng không bị xử lý nhiệt hay hóa chất đến mứcchúng bị thay đổi trạng thái tươi sống Rau quả tươi được chế biến tối thiểu thườngphải qua các công đoạncơ bản mà không phải qua khâu nấu chín như xử lý cơ học(làm sạch, tách vỏ, cắt gọt, tạo hình,…), ổn định sản phẩm (xử lý hóa học) và baogói[80] Nhược điểm lớn nhất của chế biến tối thiểu là thời hạn sử dụng sản phẩm bịgiảm do khả năng bảo quản bị kém đi so với bảo quản các sản phẩm nguyên vẹn

Do rau quả CBTT bị loại bỏ lớp vỏ bảo vệ bên ngoài, làm kích hoạt các enzymehoạt động tạo môi trường thuận lợi cho sự xâm nhập và phát triển của các loài vi

sinh vật khác nhau nên đã làm thay đổi màu sắc, cấu trúc, mất trọng lượng dẫn tớitổn thất về cả số lượng và chất lượng trong quá trình bảo quản [78]

Vi sinh vật gây hại rau quả CBTT rất đa dạng về chủng loại và số lượng.Trong các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu người ta tìm thấy một số vi sinh vậtphát triển mạnh như vi khuẩn ưa ẩm, vi khuẩn lactic, coliform, nấm men, nấm mốc,trong đó có nhiều loài có khả năng sinh độc tố mycotoxin [21] Ngoài ra, những sảnphẩm rau quảsẵn sàng để sử dụng vẫn còn bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh sau quátrình CBTT là một vấn đề tồn tại trong đảm bảo an toàn thực phẩm Trong số đó,

đáng kể đến là Listeria monocytogenes, Salmonella typhivà Escherichia coli, đặc biệt là E coli O157: H7 [104]

Hạn chế tới mức thấp nhất vi sinh vật gây hại và ngăn chặn quá trình làmbiến màu sản phẩm là những vấn đề cần được quan tâm và giải quyết trong CBTT.Những hợp chất hóa học thông thường được sử dụng cho mục đích này gồm clo,axít ascorbic, axít axetic, axít lactic và muối canxi (canxi lactat, canxi clorua) [45][60] Do khả năng ức chế vi sinh vật của những hợp chất này đối với rau quả cắtkhông cao nênmột số hợp chất hóa học khác được sử dụng kết hợp như 4-hexylresorcino, cysteine, benzoat natri, sorbat kali,… để đem lại hiệu quả tốt hơntrong việc ngăn chặn biến màu, giảm thối hỏng do vi sinh vật gây ra và đảm bảođược độ cứng của sản phẩm [38] Việc sử dụng những chất hóa học này đang ngàycàng bị hạn chế bởi mong muốn của người tiêu dùng đang ngày càng ưa chuộng sửdụng những sản phẩm thực phẩm tươi và tự nhiên có tính an toàn cao không sửdụng chất bảo quản hoá học Nhiều nỗ lực đã được thực hiện nhằm tìm ra nhữnghợp chất tự nhiên hay những chế phẩm sinh học để thay thế những chất hóa học cókhả năng phòng trừ vi sinh vật gây hại trên rau quả chế biến tối thiểu [38]

Xu hướng sử dụng thực phẩm tươi và thực phẩm ít chế biếncủa người tiêudùng hiện nay ngày càng tăng, hình thành nên một dạng thực phẩm mới là các sảnphẩm rau quả chế biến tối thiểu Rau quả CBTT hiệnlà một trong những mặt hànghóa sôi động nhất trong các cửa hàng rau quả thực phẩm ở Mỹ Thị trường rauquả cắt ở các nước Châu Á đã phát triển từ cuối những năm 80 và đầu những năm90,đặc biệt là Nhật Bản và Hàn Quốc Ở nhiều nước phát triển, việc sản xuất cácsản phẩm rau quả tươi dạng CBTT đã trở thành một ngành công nghiệp có thị phầnkhông nhỏ [47] Tuy nhiên, ở Việt Nam, CBTT gần đây mới bắt đầu được quan tâmnghiên cứu và thương mại Dạng thực phẩm này tuy mới xuất hiện với số lượng hạnchế về chủng loại nhưng có tiềm năng phát triển mạnh mẽ vì phù hợp với xu thếphát triển kinh tế xã hội và lối sống hiện đại Một số kết quả nghiên cứu bước đầu

về công nghệ CBTTcủa Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ sau thu hoạchđạtđượcmột số kết quả nhất định như đảm bảo được độ cứng, màu sắc của mít, dứa cắtmặc dù thời gian bảo quản còn ngắn (8-10 ngày) [2-4].Công nghệ CBTT ở ViệtNam hiện nay rất cần có hướng nghiên cứu sâu hơn, đa dạng hơn về chủng loại.

Cho tới nay, những công trình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic trênthế giới mới dừng ở phạm vi tuyển chọn những chủng vi khuẩn lactic có khả năngsinh axít phenyllactic cao ứng dụng trực tiếp trong thực phẩm như bổ sung vào bộtlàm bánh hay bổ sung vào thức ăn chăn nuôi [99][105], chỉ có một vài nghiên cứuthử nghiệm sản xuất axít phenyllactic thông qua quá trình lên men ở quy mô nhỏ

phòng thí nghiệm (3-10 lít) [69] Do đó, việc “Nghiên cứu tạo axít phenyllactic và ứng dụng trong bảo quản một số rau quả chế biến tối thiểu”là thực sự cần thiết.

2 Mục tiêu nghiên cứu

Nghiên cứu tạoaxít phenyllactic từ vi khuẩn lactic và đánh giá được hiệu quảcủa axítphenyllactic trong việc duy trì chất lượng và đảm bảo an toàn thực phẩm đốivới một số sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu

3 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh axítphenyllactic cao;

- Tạo axít phenyllactic từ vi khuẩn tuyển chọn được bằng phương pháp lên men;

- Đánh giá chất lượng của axít phenyllactic thu được;

- Đánh giá hiệu quả của axít phenyllactic trong sơ chế, bảo quản một số rau(cà rốt, khoai tây) quả (dứa, mít, vải)chế biến tối thiểu

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

 Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm axít phenyllactic để

có thể chủ động sản xuất chế phẩm đáp ứng nhu cầu sử dụng trong nước, đadạng hóa sản phẩm bảo quản sinh học an toàn;

 Đối tượng lựa chọn để ứng dụng chế phẩm tạo ra là rau quả chế biến tốithiểu Đây là những sản phẩm rau quả ‘sẵn sàng để ăn’ và ‘sẵn sàng để nấu’với yêu cầu phải đảm bảo chất lượng tươi, ngon và chứa những thành phần

tự nhiên Bởi vậy, việc ứng dụng chế phẩm PLA là chế phẩm bảo quản sinhhọc an toàn để bảo quản các sản phẩm CBTT có ý nghĩa thực tiễn cao;

 Tạo ra cơ sở dữ liệu làm tài liệu tham khảo khi nghiên cứu sản xuất chếphẩm sinh học từ vi sinh vật ứng dụng trong bảo quản thực phẩm

5 Điểm mới của luận án

 Đã tuyển chọn được 02 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarumC2 và C15

có khả năng sinh axít phenyllactic cao (hàm lượng đạt 1,2 g/l) với trình tự

gen rADN 16S tương đồng 99% với trình tự gen của chủng Lactobacillus plantarum NRIC 1767 Hai chủng vi khuẩn này là hai chủng hoàn toàn mới

so với các công trình đã công bố trước đây trong và ngoài nước

 Đã xây dựng được quy trình tạo axít phenyllactic bởi chủng L.plantarum C2

bằng phương pháp lên men gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng quy mô 800lít/mẻ hoàn chỉnh, là tiền đề tiến tới sản xuất chế phẩm quy mô công nghiệp;

 Đã tạo ra được chất bảo quản thực phẩm có nguồn gốc sinh học và ứng dụngtrong bảo quản rau quả chế biến tối thiểu, đây là điểm mới so với các côngtrình nghiên cứu và ứng dụng axít phenyllactic khác trên thế giới;

6 Cấu trúc của luận án

Luận án được trình bày trong 155 trang gồm 3 phần với 35 bảng, 53 hình và

đồ thị.Phần 1 Tổng quan; Phần 2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu; Phần 3 Kếtquả và thảo luận; Phần 4 Kết luận và kiến nghị; Tài liệu tham khảo với 112 tài liệutham khảo và Phần phụ lục



CHƯƠNGI.TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về axít phenyllactic

1.1.1 Đặc tính và tác dụng của axít phenyllactic

Axít phenyllactic (PLA) là một loại axít thơm, có công thức phân tử là

C9H10O3, trong phân tử có chứa vòng thơm (thể hiện ở hình 1.1) PLA dễ dàng hòatan trong nước tạo thành dung dịch, nhiệt độ nóng chảy là 121-125ºC, khối lượngphân tử 166,2 [53]

Hình 1 1 Cấu trúc phân tử của axít phenyllactic

PLA đã được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự phát triểncủa một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men, nấm mốcgây hư hỏngthực phẩm [54][63][93] PLA có thể gây ra những biến đổi về hoạt

động và cấu trúc của vi khuẩn Listeria monocytogenes Cơ chế tiêu diệt vi khuẩn

là dưới sự hiện diện của PLA, vi khuẩn tập hợp thành khối, các polysaccaritđược tách ra, thành tế bào mất đi tính chất mềm dẻo, linh hoạt, bán thấm, làmcho tế bào trương nước, căng ra và kết quả là các tế bào vi khuẩn bị vỡ và tan rã[95]

Bên cạnh việc sử dụng PLA là chất kháng vi sinh vật trong nông sản vàthực phẩm, gần đây PLA còn được sử dụng trong một số dược phẩm và mỹ phẩm[29][74] Hơn nữa, PLA còn được chứng minh là có ảnh hưởng tốt đến hệ thốngmiễn dịch, khả năng đẻ trứng của gà Tỷ lệ đẻ trứng của gà tăng lên, độ cứng của

vỏ trứng cũng tăng khi bổ sung PLA vào khẩu phần ăn hàng ngày [105] Một sốnghiên cứu cho thấy PLA hoàn toàn không gây độc với con người và động vật.PLA có mặt trong một số loại mật ong tự nhiên với hàm lượng cao và được đánhgiá là rất an toàn với môi trường sống [109]

Như vậy, axít phenyllactic được đánh giá là hợp chất an toàn có khả năng

ức chế, kiểm soát tốt nhiều loài vi sinh vật gây hại thực phẩm nên rất có tiềm năngứng dụng trong bảo quản nông sản và thực phẩm Từ đó, việc nghiên cứu tạo ra chếphẩm axít phenyllactic tự nhiên an toàn để ứng dụng trong bảo quản là hướng đimới và cần thiết hiện nay

1.1.2 Cơ chế tổng hợp PLA

PLA có thể được tạo ra bằng phương pháp hóa học và sinh học PLA được tổnghợp bằng con đường hoá học thông qua quá trình khử của kẽm và axit hydrochloric vàazlactone, hoặc quá trình hydro hoá dưới sự xúc tác của Raney-N hoặc hợp kim củaPd-C.Bằng phương pháp này có thể sinh ra cả 2 dạng đồng phân là dạng D và dạng L.Tuy nhiên, việc sản xuất PLA theo phương pháp này còn nhiều hạn chế như điều kiệntiến hành phản ứng phải tuân thủ một cách nghiêm ngặt và gây ảnh hưởng tới môitrường sống [101]

Ngược lại, quá trình tổng hợp PLA bằng con đường sinh học có nhiều ưu điểmhơn Sản xuất PLA theo phương pháp này chủ yếu sinh ra đồng phân dạng D là dạng

có mặt trong cơ thể sống Do vậy, PLA sản xuất theo phương pháp tổng hợp sinh học

dễ dàng được người tiêu dùng chấp nhận [109]

Hình 1.2 Cơ chế sinh tổng hợp axít phenyllactic[68]

Ở quá trình này, PLA được sản sinh ra bởi một số loài vi sinh vật thông quaquá trình lên men PLA là sản phẩm cuối cùng của quá trình biến đổi phenylalanine,một trong số 20 axít amin thiết yếu sinh protein được mã hóa bởi AND (hình 1.2)

Trong quá trình biến đổi đó, ở điều kiện nhất định, phenylalanine chuyển hóathànhaxít phenylpyruvic.Tiếp đến, sự hoạt hóa của enzym D-phenyllactic aciddehydrogenase, axít phenylpyruvic tiếp tục chuyển hóa thành axít phenyllactic [68].

Do đó, sản lượng PLA được tạo ra phụ thuộc rất nhiều chủng vi sinh vật sinh PLA

và thành phần, điều kiện môi trường nuôi cấy vi sinh vật [69]

1.1.3 Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA và các yếu tố ảnh hưởng

1.1.3.1 Vi sinh vật sinh tổng hợp PLA

Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra được một số chủng vi sinhvật có khả năng sinh PLA thông qua quá trình lên men trên môi trường đặc hiệu

(bảng 1.1) Chủng nấm men Geotrichum candidumđược phát hiện lần đầu tiên là có

khả năng sản sinh PLA trên môi trường lên men từ dịch chiết đậu tương và dịchchiết nấm men [36] Nhiều nghiên cứu sau đó đã tìm ra được nhiều chủng vi khuẩn

chủ yếu thuộc nhóm vi khuẩn lactic, đặc biệt là chi Lactobacilluscó khả năng sinh

PLA [97][100] Trong số những chủng vi khuẩn có khả năng sinh PLA thuộc chi

này thì loài Lactobacillus plantarum được phát hiện nhiều hơn cả [97][101][109]

Nhóm vi khuẩn lactic bao gồm nhiều giống có đặc tính chung là lên mengluxit thành axít lactic Tất cả những vi khuẩn lactic này đều có đặc điểm chung là:gram dương, bất động, không sinh bào tử, catalaza âm tính, nitratoreducaza âm tính,

là vi khuẩn kị khí chịu khí, là loại cơ thể độc nhất có khả năng lên men hiếu khí cũngnhư kị khí Nhóm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau Tế bào của

chúng có thể là hình cầu như Streptoococcus hay Lactococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus Người ta phân biệt chúng bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình[100].

Giống (chi) Lactobacillus là những vi khuẩn không sinh bào tử thuộc lớp vi

khuẩn gram dương Những trực khuẩn này đứng riêng lẻ hay thành chuỗi, thủy phânđường saccharoza mạnh, hình thành axít dạng D, L hay DL, không khử nitrat, chúngphân giải gelatin, casein, indole và H2S Chúng không có catalaza và cytochromeoxydaza Chúng là những vi khuẩn khuyết dưỡng nhiều loại vitamin, axít amin

Nhiều vi khuẩn thuộc nhóm lactic đã được phát hiện có khả năng sinh PLA như

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus brevis, (bảng

1.1)

Bảng 1.1 Một số loài vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp axít phenyllactic [93]

Brevibacterium lactofermentum Axít phenyllactic

Geotrichum candidum Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum MiLAB 14 Hydroxy fatty acids, Axít phenyllactic ,

cyclo (Phe-pro), cyclo (Phe-OH-Pro)

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus

alimentarius, Lactobacillus rhamnosus,

Lactobacillus sanfranciscensis,

Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus

brevis, Leuconostoc citreum

Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum FST1.7 Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum ITM21B Axít phenyllactic

Lactobacillus sp SK007 Axít phenyllactic

Lactobacillus plantarum CRL778,

Lactobacillus reuteri CRL1100,

Lactobacillus brevis CRL772và

CRL796

Axít phenyllactic, axít axetic

Lactobacillus có khả năng sinh bacterioxin, PLA, axít 4-hydroxy

phenyllactic và có khả năng sinh protein kháng khuẩn có trọng lượng phân tử 10

-30 KDa [62]

1.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của Lactobacillus plantarum

Để tổng hợp và thu nhận PLA đạt hiệu suất cao nhất từ Lactobacillus plantarum, phương pháp nuôi cấy chìm gián đoạn với thành phần môi trường và

điều kiện nuôi cấy thích hợp thường được sử dụng Thành phần môi trường là

nhân tố quyết định tới quá trình sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus plantarum cũng như hiệu suất sinh PLA Thành phần dinh dưỡng bao gồm các yếu

tố như nguồn cacbon, nguồn nitơ, nguồn khoáng… và các yếu tố môi trường nhưảnh hưởng của pH, thời gian lên men, hàm lượng oxy

a Ảnh hưởng của môi trườngnuôi cấy

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về dinh dưỡng khá phức tạp bởi khả năng tổnghợp hạn chế những yếu tố sinh trưởng của chúng như vitamin B và các axít amin.Chúng đòi hỏi một số nhân tố cho sinh trưởng như nguồn cacbon và nitơ ở dạngcacbohydrate, axít amin, vitamin và khoáng chất [53] Một số yếu tố kích thích sinhtrưởng cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ sản xuất axít phenyllactic Hỗn hợp các axítamin, peptit luôn kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic và làm cho tỷ lệ pháttriển cao hơn những chủng chỉ có axít amin tự do [100] Axít béo cũng có ảnhhưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic và các muối phosphate là những muốiquan trọng nhất trong quá trình lên men lactic Ion ammonium không phải là nguồnnitơ duy nhất mà chúng còn có một số ảnh hưởng đến quá trình chuyển hóa một sốaxít amin nhất định Nhìn chung, những đặc tính tốt của vi khuẩn lactic sử dụngtrong công nghiệp là khả năng chuyển hóa nhanh và hoàn toàn những nguyên liệu rẻtiền thành axít với nhu cầu dinh dưỡng thấp nhất và cung cấp chất đồng phân lập thểthích hợp hơn với sản lượng cao mà không có sản phẩm phụ nào [93]

Nhu cầu về cacbon

Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại nguồn cacbon khác nhau để đáp ứngnhu cầu dinh dưỡng cacbon của chúng Tuy nhiên, nguồn cacbon quan trọng nhất đốivới vi khuẩn vẫn là monosaccharide và disaccharide [8][108].Những nguyên liệu tinhbột thường được sử dụng để sản xuất axít lactic bao gồm cao lương, lúa mì, ngô, sắn,khoai tây, gạo, lúa mạch đen và đại mạch Những nguyên liệu này phải được thủyphân thành đường trước khi lên men bởi chúng chứa chủ yếu là α(1,4)-glucose và

α(1,6)-glucose [71] Những chủng vi khuẩn L.amylophilus và L.amylovorus có khả

năng sản sinh amylase thường được sử dụng để lên men trực tiếp nguyên liệu tinh bột

để tạo ra axít lactic [106] Nguyên liệu xenlulose được sử dụng để sản xuất axít lactictheo cách tương tự như tinh bột,chúng chứa chủ yếu là β(1,4)-glucan gồm xylan,arabinan, galactan và lignin [107] Rỉ đường là phụ phẩm của quá trình sản xuất

đường và nó thường chứa một lượng lớn đường saccharose [53] L delbrueckii và E faecalis là hai chủng được sử dụng để sản xuất axít lactic từ rỉ đường [49]

Nhu cầu về nguồn nitơ

Phần lớn vi khuẩn lactic đều là các vi khuẩn dị dưỡng nitơ, vì vậy để đảmbảo cho quá trình phát triển và sinh tổng hợp axít hữu cơ được dễ dàng chúng cần

có nguồn nitơ sẵn có trong môi trường Nguồn cung cấp dinh dưỡng nitơ là các axítamin, trong quá trình nuôi cấy con người sẽ bổ sung các nguồn chứa nitơ như: caonấm men, cao thịt, pepton, cao ngô, casein.Dinh dưỡng phổ biến nhất cho quá trìnhlên men sản xuất axít lactic, axít phenyllactic là dịch chiết nấm men, nhưng chínhđiều này lại làm tăng giá thành sản xuất Dịch chiết ngô, một phụ phẩm của quytrình ngâm chiết ngô, đã được sử dụng thay thế dịch chiết nấm men trong sản xuấtthành công axít lactic [27] Hàm lượng nitơ của dịch chiết ngô phụ thuộc vào quytrình ngâm chiết được sử dụng 85% hàm lượng nitơ tổng số gồm protein, peptit vàaxít amin Mu và cộng sự (2008) đã nghiên cứu chọn lọc ra được thành phần môitrường tối ưu có chứa dịch chiết ngô (4,7%) và bột nấm men ((3%) để sản xuất axítphenyllactic với sản lượng 2,3 g/l [68].Yun và cộng sự đã chỉ cho thấy cám gạo vàcám lúa mì là thành phần dinh dưỡng quan trọng để sản xuất axít lactic bởi vì chúngchứa một số nhân tố dinh dưỡng cũng như cacbohydrat có khả năng lên men [108]

Nhu cầu về các chất khoáng

Để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển đầy đủ của mình, vi khuẩn

Lactobacillus plantarum cần phức hợp các hợp chất vô cơ như: photpho, lưu huỳnh,

kali, magie, mangan, đồng, sắt, natri…đặc biệt là mangan

Lactobacillus plantarum cần một nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ cho

sự phát triển của chúng Axít axetic, axít xitric, axít oleic hoặc axít linolenic có tác

động thuận lợi đến tốc độ phát triển của vi khuẩn Lactobacillus plantarum Đó cũng

là lý do mà môi trường nuôi cấy và bảo quản Lactobacillus plantarum thường có

mặt của các muối axetat, xitrat và Tween-80 [44]

b Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Nhiệt độ và pH cũng là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triểncủa vi khuẩn lactic và sản xuất axít [69]

Ảnh hưởng của pH

Hoạt động của vi khuẩn lactic chịu tác động rất mạnh của pH môi trường lênmen Độ pH của môi trường tác động đến quá trình trao đổi chất của tế bào, đặc biệt

là tác động đến hệ enzim của chúng, mỗi enzim đều có một dải pH tối ưu mà tại đóhoạt lực của enzim là cao nhất [53] Nếu pH không thích hợp, vi khuẩn có thể bị ứcchế, phát triển kém hay bị tiêu diệt Cho nên việc xác định pH ban đầu thích hợp vàduy trì pH cần thiết trong thời gian sinh trưởng của tế bào là rất quan trọng Các vi

khuẩn lactic có pH tối ưu cho sự phát triển là 5,5 – 6,2 (Lactobacillus), 5,5 – 6,5 (Pecliococcus), 6,3 – 6,5 (Leuconostoc) Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic có thể chịu được là khác nhau: Lactobacillus có thể chịu được pH = 3,2 – 3,5, Pecliococcus có thể chịu được pH = 3,5 – 4,4, Leuconostoc là pH = 5 Khoảng pH thích hợp cho Lactobacillus plantarum sinh PLA cao nhất là 5,5 - 6,5

[57]

Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của vi khuẩn, do tốc độ phảnứng phụ thuộc vào nhiệt độ Tốc độ phản ứng hóa sinh, hoạt lực enzim, tốc độ củaquá trình chuyển hóa phụ thuộc vào nhiệt độ Mỗi loài vi khuẩn phát triển ở dảinhiệt độ khác nhau Đã có nhiều nhà khoa học nghiên cứu cho rằng vi khuẩn

Lactobacillus plantarum có thể phát triển trong dải nhiệt độ từ 30°C- 45°C [95].

Nhưng nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng phát triển là 300C Nếu nhiệt độ thấp vikhuẩn sinh trưởng kém, mất nhiều thời gian, nếu nhiệt độ quá cao trên 45°C thì vikhuẩn sẽ bị tiêu diệt

Ảnh hưởng của thời gian lên men

PLA là một axít, khi nó được sinh ra trong điều kiện lên men sẽ làm giảm

pH của môi trường Do đó, thời gian lên men là một yếu tố rất quan trọng để PLA

thu được với hiệu suất cao nhất Nếu thời gian ngắn có thể sinh khối Lactobacillus plantarum tạo ra ít, PLA chưa được tạo ra, còn nếu thời gian quá dài thì lượng

dinh dưỡng của môi trường giảm, không đủ thức ăn cho vi khuẩn, vi khuẩn sẽchết, đồng thời pH giảm mạnh sẽ ức chế vi khuẩn hoạt động, gây tốn kém Bởivậy, việc tối ưu hoá thời gian lên men là rất cần thiết Theo những nghiên cứu mớiđây, PLA tạo ra đạt năng suất cao khi thời gian lên men kéo dài từ 24 giờ – 72 giờ

ở điều kiện lên men chìm sục khí, gián đoạn có điều chỉnh pH 6 và bổ sung cơchất [69]

1.1.4 Công nghệ sản xuất axít phenyllactic

1.1.4.1 Công nghệ lên men sinh axít phenyllactic

Axít phenyllactic được phát hiện lần đầu tiên là do chủng nấm men

Geotrichun candidum sảnsinh ra khi chủng này được nuôi cấy trên môi trường dịch

chiết đậu tương và dịch chiết nấm men với sản lượng từ 0,6 - 1 g/l [112] Sau đó,nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm lactic có khả năng sinh PLA cũng được tìm thấy

như Lactobacillus plantarum, Lactobacillus alimentarius, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus sanfranciscensis, Lactobacillus hilgardii, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis [100] Trong số 12 chủng vi khuẩn lactic được sử

dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm lên men đã phát hiện được 9 chủng có khảnăng sinh PLAvới sản lượng từ 0,028 – 0,091 g/l.Một số chủng vi khuẩn được phân

lập từ bột mỳ lên men có khả năng sinh PLA nhưLactobacillus plantarumITM21A

và L.sanfranciscensis IDMC57 với hàm lượng PLA là 0,058 g/l,L.citreum ITM22A với hàm lượng PLA 0,071 g/l Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides

ITMY30phân lập từ quả oliu có khả năng sinh 0,094 g/l PLA [97].Ngoài ra, một số

vi khuẩn probiotic thương mại được phát hiện là có khả năng sinh PLA như

L.johnsonii La1 và L.acidophillus IBB801 có thể sinh 0,042 g/l và 0,025 g/l PLA [64] Lactobacillus plantarumFST1.7 được xác định là có khả năng sinh 33,47mg PLA trong 1kg bột mỳ lên men [20] L.plantarum TMW1.468 cũng được phát hiện

là có khả năng sinh 0,083 g/l PLA [101] Trong số 112 chủng vi khuẩn phân lập từrau củ lên men truyền thống của Trung Quốc thì 70 chủng có khả năng sinh PLA

với sản lượng cao hơn, trong đó chủng Lactobacillus plantarum SK007 có thể sinh 0,094 g/l PLA tương đương với chủng Leuconostoc mesenteroides subsp mesenteroides ITMY30[56].

Mặc dù PLA có thể được sản sinh ra bởi nhiều loài vi khuẩn Lactobacillus,

nhưng hoạt tính sinh PLA vẫn còn thấp PLA được sản sinh bởi vi khuẩn lacticnuôi cấy trên môi trường MRS cao nhất cũng chỉ đạt đến 0,94 g/l [56][99] Nhữngnghiên cứu sản xuất PLA từ vi khuẩn lactic đều ứng dụng axít amin làm cơ chất

Sản lượng PLA sinh ra từ L.plantarum ITM21B tăng lên khi tăng lượng axít amin

phenylalanin [99] Tuy nhiên, quá trình trao đổi axít amin bởi vi khuẩn lactic bịgiới hạn bởi khả năng huy động của chất nhận amin trong phản ứng chuyển hóaamin Vermeulen và cộng sự đã chỉ ra rằng việc chuyển hóa phenylalanin là một

nhân tố hạn chế trong quy trình sản xuất PLA bởi L.sanfranciscensis DSM20451

và L.plantarum TMW1.468 Họ cũng nhận thấy rằng sản lượng PLA tăng từ

5-30% khi bổ sung α-ketoglutarate vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn [101] Li và

cộng sự (2007) đã chỉ ra rằng quá trình sinh tổng hợp PLA bởi Lactobacillus plantarum SK007 bị hạn chế bởi phenylalanin và điều này có thể vượt qua được

nhờ giải pháp thay thế cơ chất phenylalanin bằng axít phenylpyruvic Kết quả làsản lượng PLA đã tăng từ 0,094 g/l lên 1,31 g/l (tăng 14 lần)[56] Trong mộtnghiên cứu khác, khi bổ sung 3 g/l axít phenylpyruvic vào môi trường nuôi cấy vi

khuẩn Lactobacillus plantarum IMAU 10124 thu được sản lượng axít phenyllactic

lên tới 2,9 g/l, gấp trên 12 lần so với không bổ sung tiền chất [110]

Axít phenyllactic có nhiều đặc tính giống với axít lactic và cùng được sảnsinh ra từ vi khuẩn lactic Tuy nhiên, khác với axít phenyllactic mới được phát hiện

và nghiên cứu thì axít lactic đã được nghiên cứu từ lâu và cho đến nay được sảnxuất thương mại ứng dụng nhiều trong thực phẩm Để sản xuất axít lactic bằng côngnghệ sinh học tiện lợi thì những nguyên liệu thô rẻ tiền thường được sử dụng bởinhững nhà sản xuất polymer và sản xuất công nghiệp khác luôn luôn cần số lượnglớn axít lactic với giá thành tương đối thấp Những nguyên liệu thô sử dụng để sảnxuấtaxít lactic phải có những đặc tính là rẻ, mức nhiễm tạp thấp, tỷ lệ sản xuấtnhanh, sản lượng cao, ít hoặc không có sản phẩm phụ, khả năng lên men không cầntiền xử lý hoặc xử lý ít và luôn sẵn có quanh năm Khi những nguyên liệu tinh chếđược sử dụng cho sản xuất, giá thành cho tinh sạch sản phẩm cần phải thấp Tuynhiên, điều này không có lợi về mặt kinh tế vì cacbohydrate tinh chế quá đắt làmtăng giá thành sản xuất [44] Bởi vậy, nhiều nghiên cứu đã sàng lọc những nguyênliệu thô rẻ tiền cho sản xuất axít lactic đạt hiệu quả kinh tế Những nguyên liệu rẻtiền như tinh bột, xenlulose, whey và rỉ đường thường được sử dụng để sản xuất axítlactic Trong số đó, tinh bột và xenlulose được quan tâm sử dụng nhiều hơn bởi giáthành rẻ, số lượng nhiều và có thể thay mới được [8]

Bên cạnh đó, một số phế phụ phẩm công nghiệp như whey và rỉ đường được

sử dụng làm cơ chất cho sản xuất axít lactic Whey là phụ phẩm chính của ngànhcông nghiệp sữa và nó chứa lactose, protein, chất béo và muối khoáng Để tận dụnghoàn toàn lactose của whey, người ta thường bổ sung thêm nguồn nitơ vào wheynhằm mục đích giảm lượng dinh dưỡng không sử dụng hết của quá trình lên men vàtăng hiệu quả kinh tế Schepers và cộng sựđã bổ sung thêm dịch chiết nấm men vào

whey làm cho quá trình sản xuất axít lactic bởi chủng L helveticus tăng nhanh [92].

Ngoài ra, để tăng nhanh quá trình sản xuất axít lactic cần phải bổ sung thêm dinhdưỡng vào môi trường lên men Dinh dưỡng phổ biến nhất để sản xuất axít lactic làdịch chiết nấm men, nhưng chính điều này lại làm tăng giá thành sản xuất Dịchchiết ngô, một phụ phẩm của quy trình ngâm chiết ngô, đã được sử dụng thay thếdịch chiết nấm men trong sản xuất thành công axít lactic [27]

Với mục tiêu sản xuất axít lactic, axít phenyllactic đạt hiệu suất cao, ngoàiviệc tối ưu hóa môi trường nuôi cấy vi sinh vật và lựa chọn chủng vi sinh vật thíchhợp, thì việc lựa chọn công nghệ lên men tối ưu để thu được axít với hàm lượngcao, giảm thời gian lên men cũng như giá thành sản xuất đóng vai trò hết sức quantrọng Axít lactic, axít phenyllactic thường được sản xuất theo phương pháp lên men

gián đoạn, gián đoạn có bổ sung dinh dưỡng và liên tục Lên men gián đoạn và giánđoạn có bổ sung dinh dưỡng thường thu được nồng độ axít cao hơn lên men liêntục, trong khi đó hiệu suất cao hơn có thể đạt được khi sử dụng lên men liên tục[92] Một ưu điểm nữa của lên men liên tục so với gián đoạn là khả năng liên tụcquy trình trong một thời gian dài hơn Những quy trình lên men liên tục và giánđoạn lặp lại cùng với hệ thống tuần hoàn tế bào có thể thu được mật độ tế bào vàsản lượng sản phẩm lớn Oh và cộng sự đã sản xuất axít lactic ở tỷ lệ 6,4 g/l.h bằngphương pháp lên men gián đoạn lặp lại tuần hoàn tế bào Kết quả cũng chỉ cho thấychỉ 26% lượng dịch chiết nấm men so với lên men gián đoạn thông thường cần đểsản xuất ra cùng một lượng axít lactic, bởi vậy đã giảm được giá thành sản xuấtđáng kể Mật độ tế bào cao nhất thu được lớn hơn 28 g/l, làm tăng hiệu suất và giảmlượng dinh dưỡng bổ sung thêm [72] Phương pháp lên men gián đoạn chủng

Lactobacillus plantarum SK007 có bổ sung dinh dưỡng 2 giờ/một lần (100g/l PPA,

500g/l glucose) và điều chỉnh pH 6,0 có thể đạt được sản lượng PLA cao nhất là17,38 g/l [69]

Gần đây, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm loại bớt axít lactic đồngthời ngay khi nó được hình thành Quá trình lên men thẩm tách bằng điện với màngtrao đổi ion cũng thường được sử dụng để loại bớt axít lactic Hệ thống lên menthẩm tách điện có đồng hồ đo mức độ là hệ thống hiệu quả nhất và thu được sảnlượng cao hơn nếu nồng độ glucose trong dịch lên men được kiểm soát luôn duy trì

ở một mức thấp hơn Màng lọc nano và nhựa trao đổi ion được ghép với lò phảnứng sinh học trong việc lấy bớt axít lactic [71]

1.1.4.2 Thu hồi axít phenyllactic

Trong quy trình sản xuất axít hữu cơ, tiếp ngay sau quá trình lên men là quátrình thu hồi sản phẩm axít từ dịch lên men Một số phương pháp được sử dụng đểthu hồi axít lactic bao gồm trích li,thu hồi bằng hóa học, chưng cất, thẩm tách điện

và trao đổi ion … Nhiều quá trình dùng dung môi trích li đã được dùng để tinh chếaxít lactic sau khi tế bào vi sinh vật đã được tách khỏi dịch đường Một hệ thốngtrích li liên tục dựa trên ete isopropyl được công ty Anh Croda Bowmans ChemicalsLtd đưa vào ứng dụng ở mức độ sản xuất công nghiệp [72] Tuy nhiên, phươngpháp trích li lỏng-lỏng có nhược điểm là khó chọn các dung môi thích hợp, cácdung môi trích li tốt lại thường có độc tính cao đối với tế bào và ngược lại

Thu hồi axít lactic bằng phương pháp chưng cất cũng được sử dụng dựa trênnguyên tắc este hóa axít lactic bằng rượu methanol rồi sau đó thủy phân metyllactate thành axít lactic bằng cách chưng cất Đối với phản ứng este hóa, người tadùng chất xúc tác để đảm bảo chỉ có quá trình este hóa xảy ra Hỗn hợp sản phẩm

este hóa sau đó gồm rượu chưa phản ứng, nước và este được đưa vào một hệ thốngchưng cất gồm có bộ phận ngưng tụ chính ở trên và phụ ở dưới Hỗn hợp hơi vào hệthống ngưng tụ, đầu tiên qua bộ phận ngưng tụ phụ, các hợp phần của hơi là metyllactate và nước ít bay hơi nhất được ngưng tụ chảy xuống nồi đun phía dưới Tạiđây, chỉ có phản ứng thủy phân xảy ra vì rượu methanol đã bị bay hơi lên trên, cònaxít lactic ở lại nồi ở dạng lỏng, methanol có độ bay hơi lớn nhất tiếp tục đi lên bộphận ngưng tụ chính phía trên và được đưa hồi lưu trở lại cho phản ứng este hóa[106].

Một trong những phương pháp hiện đại mới được áp dụng và cho kết quảkhả quan là phương pháp thu hồi axít lactic bằng thẩm tách điện Vũ Hồng Thắng

và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm thu hồi axít lactic bằng thiết bị thẩm tách điện

của Nhật Bản Sử dụng chủng Lactobacillus lactis lên men trên môi trường dịch

thủy phân tinh bột sắn tạo dạng axít lactic dạng L(+) Sau khi xử lý dịch lên menbằng than hoạt tính, năng suất thu hồi khoảng 261 g/l.h với dung dịch chuẩn là 272g/l.h Nồng độ axít cuối cùng là 191 g/l, hiệu suất thu hồi đạt 91,5% [1]

Phương pháp trao đổi ion dựa trên khả năng trao đổi anion của nhựa trao đổiion (anionit).Khi cho dịch lên men tiếp xúc với anionit ở dạng OH, các gốc axít sẽthay thế các nhóm OH hoạt động có trong nhựa và bị giữ lại, axít lactic sau đóđược tách ra khỏi nhựa bằng cách cho một dung dịch điện li thích hợp tiếp xúc vớinhựa, các gốc axít sẽ bị đẩy ra khỏi nhựa bởi các anion của dung dịch điện li nàytheo cùng một cơ chế.Phương pháp trao đổi ion thực ra đã được ứng dụng từ rất lâutrong công nghiệp, chủ yếu là để tách loại như: xử lý và làm mềm nước, tách cácaxít vô cơ và hữu cơ, tẩy màu, thu hồi và tinh chế các protein, do vậy phạm vi ứngdụng khá rộng.Đối với quá trình lên men lactic liên tục, nhựa trao đổi ion ngoài việcthu hồi axít còn được dùng để tạo độ pH thích hợp cho dịch lên men, dịch sau khicho qua nhựa sẽ được đưa trở lại để lên men tiếp Năng suất của quá trình có thể lớngấp 5 lần so với quá trình lên men gián đoạn [67].Bản chất nhựa trao đổi ion làpolyme có chứa các nối ngang (liên kết giữa các chuỗi cacbon dài trong polyme).Trong nhựa có chứa các nhóm hoạt động ở các vị trí có tích điện, tại những vị trínày, các ion tích điện trái dấu có thể được hút hoặc thay thế bằng các ion khác tùythuộc vào nồng độ và ái lực của các ion đó so với vị trí có tích điện Hiệu quả củaquá trình trao đổi ion phụ thuộc vào hai yếu tố là số nhóm hoạt động và khả năngtrao đổi của nhựa đối với mỗi loại ion nhất định.Mỗi loại nhựa có khả năng hấp phụkhác nhau đối với các ion khác nhau trong dung dịch, điều đó được gọi là tính chọnlọc của nhựa và được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc hay nói cách khác, ái lực của cácloại ion khác nhau thì khác nhau đối với mỗi loại nhựa khác nhau [67]

Quá trình trao đổi giữa hai ion (một của ion và một của nhựa) là một quátrình thuận nghịch, lấy ví dụ quá trình trao đổi cation là ví dụ:

P(RnX) + nY+p<-> n (RpY) + pX+n

Trong đó, RX là nhựa với X là ion trao đổi, Y (+) là ion trong dung dịch Trong quá trình trao đổi, ion Y+p vào trong nhựa còn ion X+n bị thay thế và đivào trong dung dịch Cân bằng sẽ được thiết lập sau một thời gian nhất định tùythuộc và bản chất của nhựa và tính chất của dung dịch, sau đó sự trao đổi không xảy

ra nữa

Có thể sử dụng nhựa để trao đổi theo hai phương pháp tĩnh hoặc phươngpháp động Trong phương pháp tĩnh, người ta cân nhựa rồi cho tiếp xúc với mộtthể tích xác định của dung dịch chứa ion cần tách Tuy vậy trong trường hợp nàykhông tách được hoàn toàn ion khỏi dung dịch cần tách và quá trình trao đổi ion

là quá trình thuận nghịch và ion bị hấp phụ vẫn còn lại trong dung dịch ở nồng độcân bằng Do đó, trong thực tế nghiên cứu sản xuất người ta thường dùng phươngpháp động nghĩa là tiến hành cho trao đổi ion trên cột Cột trao đổi ion thường cóhình trụ trong có chứa hạt nhựa (đường kính và chiều cao tùy thuộc vào mục đíchnghiên cứu hay sản xuất), dung dịch nghiên cứu được cho nhảy từ trên xuống rakhỏi đáy cột Khi dội dung dịch qua cột, trong các điều kiện thuận lợi, ion củadung dịch sẽ bị hấp phụ hoàn toàn bởi ionit và dung dịch trong quá trình chảy quacột sẽ dần dần tiếp xúc với các lớp nhựa mới.Chu kỳ trao đổi ion trên cột thườngdiễn ra theo hai giai đoạn: giai đoạn hấp phụ ion trên ionit và giai đoạn giải hấphay còn gọi là giai đoạn tách rửa Dung dịch chất diện ly dùng để tách ion bị hấpphụ ra khỏi cột gọi là chất tách rửa [67]

Phương pháp thu hồi bằng hóa học là phương pháp khá cổ điển song nó lạithích hợp cho việc thu hồi axít từ dịch lên men chứa nhiều tạp chất Phương phápnày gồm các công đoạn: xử lý dịch lên men, kết tinh thu nhận muối canxi, axít hóa,tẩy màu, loại bỏ tạp chất và cô đặc.Trong quá trình lên men, ngoài sự tạo axít, vikhuẩn lactic còn sinh tổng hợp ra các enzyme ngoại bào, các axít nucleic và các axíthữu cơ khác, các chất này cản trở quá trình kết tinh thu nhận muối canxi và ảnhhưởng tới độ tinh khiết của sản phẩm Vì vậy dịch lên men phải được xử lý nhằmloại bỏ sơ bộ các tạp chất này Thông thường dịch lên men được điều chỉnh pH tới10- 12 bằng Ca(OH)2 và gia nhiệt có các chất keo tụ protein, kết lắng cùng với xác

tế bào vi khuẩn, tạp chất Sau đó được lọc tách cặn, thu nhận dịch muối canxitrong.Kết tinh là quá trình tách chất rắn hòa tan trong dung dịch, là một trong nhữngphương pháp chủ yếu để thu được chất rắn ở dạng nguyên chất Kết tinh các chất

rắn hòa tan trong dung dịch dựa vào độ hòa tan hạn chế của chất rắn Khi độ hòa tancủa chất rắn đạt cực đại, dung dịch dần đạt đến trạng thái bão hòa và quá bão hòa.Cuối cùng, tinh thể muối canxi nhận được từ quá trình kết tinh được hoàn nguyênthành axít nhờ tác nhân axít mạnh Phản ứng xảy ra như sau:

(R-COO)2Ca.5H2O + H2SO42R-COOH +CaSO4 + 5H2O

Kết tủa canxi sunfat được tách loại bằng phương pháp lọc để thu được dịchtrong chứa axít phenyllactic Hiệu suất thu hồi axít lactic đạt 68,94% khi sử dụngphương pháp này với điều kiện pH đạt 11, nhiệt độ kết tinh 5-10ºC và khuấy với tốc

độ 35 vòng/phút [1]

1.1.5 Ứng dụng của axít phenyllactic

PLA đã được chứng minh là có khả năng ức chế sinh trưởng và sự pháttriển của một số loài vi khuẩn gram âm, gram dương, cùng nhiều loài nấm men,nấm mốc gây hại thực phẩm [62][99] Lavermicocca và cộng sự đã nghiên cứu

và chỉ ra rằng PLA được sinh ra từ chủng Lactobacillus plantarum có khả năng

ức chế sinh trưởng và phát triển của 23 chủng nấm mốc thuộc 14 loài của 3 chi

Aspergillus, Penicillium và Fusarium, đặc biệt có những loài sinh độc tố như Aspergillus ochraceus, Aspergillus flavus, Penicillium roquefoti, Penicillium verrucosum và Penicillium citrium phân lập từ các sản phẩm như bánh, bột, ngũ

cốc Với liều lượng thấp hơn 7,5 mg/ml PLA có khả năng ức chế phần lớn sựphát triển của các chủng này [35][54]

Ngoài ra, PLA cũng được chứng minh là có khả năng ức chế Listeria monocytogenes ở liều lượng 13 mg/ml và ở nồng độ 20 mg/ml ức chế một số vi khuẩn gây bệnh ở người là Escherichia coli, và Aeromonas hydrophila [62][64].

Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng ở nồng độ 7mg/ml, PLA có thể tiêu diệt được

Listeria monocytogenes trên môi trường dịch chiết đậu tương và dịch chiết nấm men (TSB – YE) Mật độ Listeria monocytogenes đã giảm 100 lần so với ban

đầu sau 4 ngày nuôi cấy ở 25ºC trên môi trường TSB – YE có PLA.Mật độ của

vi khuẩn này cũng giảm 1.000 lần khi có mặt PLA trong giai đoạn vi khuẩn đangtăng trưởng PLA có tác dụng ức chế vi khuẩn trong sữa, lượng vi khuẩn giảm4,5 lần so với lượng vi khuẩn ban đầu kiểm tra trong sữa [63]

PLA được sản sinh trong quá trình lên men của vi khuẩn L.plantarum

trong sản xuất bánh mỳ đã chỉ ra có khả năng ức chế rất tốt vi khuẩn gây hỏng

bánh Bacillus subtilis, kéo dài thời gian bảo quản bánh mỳ tới 7 ngày trong khi bánh không xử lý sau 3 ngày mật độ Bacillus subtilis đã lên tới 109 cfu/g [99]

Bên cạnh đó, sử dụng chủng L plantarum sinh PLA làm chủng khởi động lên

men bột làm bánh đã kéo dài thời gian bảo quản bánh tới 7 ngày và ức chế sựphát triển của nhiều loài nấm mốc gây hại [53] Mặc dù mới được phát hiện vànghiên cứu trong thời gian gần đây nhưng tiềm năng ứng dụng của PLA trongbảo quản nông sản, thực phẩm là rất lớn Nhiều nghiên cứu, khảo sát quy môphòng thí nghiệm đã chỉ cho thấy PLA có nhiều triển vọng ứng dụng trên sảnphẩm thực phẩm quy mô lớn [86]

Như vậy, axít phenyllactic là chất kháng vi sinh vật đang được các nhà khoahọc trên thế giới quan tâm nghiên cứu để ứng dụng trong bảo quản thực phẩm.Những công bố về sản xuất PLA bằng phương pháp lên men chủ yếu là ở qui mônhỏ phòng thí nghiệm Kết quả thử nghiệm hiệu quả kháng vi sinh vật của PLA chủyếu là tác dụng của PLA tới các chủng vi sinh vật nuôi cấy trên thạch đĩa và môitrường nhân tạo mà ít có các thử nghiệm trên rau quả Ở Việt Nam trên thị trườnghiện vẫn chưa có sản phẩm axít phenyllactic Vì thế, việc chủ động sản xuất chếphẩm PLA bằng con đường sinh học thông qua quá trình lên men của vi khuẩnlactic sử dụng thiết bị sẵn có trong nước để ứng dụng trong bảo quản nông sản thựcphẩm có ý nghĩa khoa học và thực tiễn rất lớn

1.2 Chế biến tối thiểu rau quả

1.2.1 Tình hình sản xuất rau quả chế biến tối thiểu trên thế giới

1.2.1.1 Khái niệm và vai trò của chế biến tối thiểu trong công nghiệp chế biến rau

quả và tiêu dùng

Hiệp hội sản phẩm cắt quốc tế (IFPA) định nghĩa sản phẩm cắt là rau quả đãđược làm sạch, gọt vỏ, cắt và đóng gói để đem đến cho người tiêu dùng những sảnphẩm tiện dụng có dinh dưỡng và hương vị cao mà vẫn giữ được độ tươi ngon [38].Công nghệ CBTT đang ngày càng phát triển do xu hướng hiểu biết về sức khỏe và sựquan tâm đến vai trò của thực phẩm trong duy trì và nâng cao chất lượng cuộc sốngcủa người tiêu dùng [34] CBTT mô tả những công nghệ chế biến thực phẩm không

sử dụng nhiệt đảm bảo an toàn thực phẩm và bảo quản cũng như duy trì những đặctính của rau quả càng tươi càng tốt Những đặc điểm trực quan của sản phẩm rau quảcắt là một trong những thông số quan trọng nhất để đánh giá chất lượng tổng thể củasản phẩm bởi người tiêu dùng Trong bảo quản, tiêu chí đánh giá sản phẩm là có haykhông hiện tượng biến màu (nâu hóa bề mặt cắt, úa vàng hay bạc màu của rau xanh,

…), tổn thương cơ học cũng như thối hỏng do vi sinh vật gây ra [48]

Rau quả cắt hấp dẫn người tiêu dùng bởi chúng tươi, dinh dưỡng, giá thànhkhông cao và ăn được ngay Vì vậy, nhiều sản phẩm rau quả CBTT đã được pháttriển để đáp ứng nhu cầu sử dụng những sản phẩm nhanh và tiện dụng của ngườitiêu dùng CBTT nâng cao giá trị của sản phẩm cắt nhờ tính tiện dụng và tiết kiệmthời gian, mặc dù một vài rào cản gặp phải như rất khó giữ được độ tươi trong suốtquá trình bảo quản [50].

1.2.1.2 Các sản phẩm rau quả chế biến tối thiểu phổ biến trong thương mại

Thị trường rau quả chế biến tối thiểu (CBTT) đã có những bước phát triểnvượt bậc trong những năm gần đây, được khuyến khích lớn bởi nhu cầu cần sử dụngnhững sản phẩm tươi, ngon, bổ dưỡng, tiện dụng và không sử dụng phụ gia đảmbảo an toàn cho người tiêu dùng Người tiêu dùng đang ngày càng quan tâm đến thịtrường quốc tế về sản phẩm cắt với những vị mới và lạ Những sản phẩm rau quảcắt nhiệt đới có sức hấp dẫn đặc biệt đối với những người tiêu dùng trẻ, nhữngngười thích sử dụng những sản phẩm nhẹ ăn liền Những nhà sản xuất ở nhiều nướcnhiệt đới nắm bắt được nhu cầu phát triển này đã tập trung sản xuất nhiều loại sảnphẩm cắt cho xuất khẩu [47]

Rau quả CBTT đang ngày càng đóng vai trò quan trọng trong hệ thống phục

vụ thực phẩm ở Mỹ Năm 2006, 27% sản phẩm cắt ở Mỹ được bán trên hệ thốngphân phối thực phẩm, trong khi 73% được bán ở hệ thống bán lẻ Doanh thu của sảnphẩm cắt tăng từ 3,3 tỷ USD năm 1999 lên đến 15,5 tỷ USD năm 2007 [26]

Trong khi đó, công nghiệp rau quả cắt ở Châu Âu phát triển vượt bậc từnhững năm 80 Theo Rabobank (2009), người tiêu dùng đã chú ý đến tính tiện dụng

và sức khoẻ cuộc sống là hai yếu tố chủ yếu quyết định sự phát triển rau quả cắt vớiviệc bán lẻ như là kênh phân phối chính Một số nước như Hà Lan, Thuỵ Sỹ, Ý vàTây Ban Nha đã thiết lập thị trường và phát triển mạnh mẽ kinh doanh sản phẩm rauquả cắt Ý nổi lên là một trong những thị trường kinh doanh rau quả cắt hàng đầucủa Châu Âu, nơi mà rau và quả CBTT hưng thịnh nhất trong những năm gần đây

và hiện tại đứng thứ hai chỉ sau Anh về mặt hàng này [47]

Rau quả cắt cũng được bán nhiều ở các chợ và gian hàng thực phẩm và siêuthị ở nhiều nước Châu Á Thị trường rau quả cắt ở Nhật Bản và Hàn Quốc phát triển

từ cuối những năm 80 và đầu những năm 90 Khi ngành công nghiệp dịch vụ thựcphẩm cho nhà hàng và trường học sử dụng sản phẩm rau quả cắt là chủ yếu ở nhữngnước này thì nhu cầu sử dụng rau quả cắt cũng phát triển ở thị trường bán lẻ Cùngvới nhu cầu của người tiêu dùng về những sản phẩm rau quả sẵn sàng để ăn ngày

càng tăng, thị trường về sản phẩm cắt ở Thái Lan đang có xu hướng ngày càng pháttriển Cũng giống như Thái Lan, Việt Nam là nước nhiệt đới rất phong phú về rauquả Thị trường về rau quả cắt ở Việt Nam cũng bắt đầu được chú ý phát triển Tuynhiên, chủng loại vẫn còn hạn chế và sản phẩm chủ yếu vẫn còn ở siêu thị [48].

Quả cắt nhiệt đới trên thị trường ngày nay gồm dưa bở, dưa hấu, dưa đỏ,xoài, măng cụt, chôm chôm, mít, bưởi, đu đủ, sầu riêng, dứa và hỗn hợp các loạiquả Sản phẩm rau cắt trên thị trường gồm các loại rau ăn lá và hỗn hợp salát Raucắt sử dụng cho nấu nướng gồm cà rốt, xúp lơ xanh, xúp lơ trắng, cần tây, bắp cải,măng tây, khoai tây, khoai lang Ngoài ra, một số thảo mộc cắt cũng được bán trênthị trường Cùng với sự quan tâm về các sản phẩm nhập ngoại và xu hướng sử dụngsản phẩm có lợi cho sức khoẻ thì nhu cầu về các sản phẩm rau quả nhiệt đới CBTT

ở các nước Châu Âu đang ngày càng tăng lên Những loại rau quả nhiệt đới CBTThấp dẫn người tiêu dùng bận rộn bởi tính tiện dụng và đa dạng về chủng loại [47]

1.2.2 Công nghệ chế biến tối thiểu rau quả

1.2.2.1 Các công đoạn và yêu cầu kỹ thuật

Chế biến tối thiểu rau quả thúc đẩy quá trình hư hỏng sinh lý, những biến đổisinh hoá diễn ra nhanh hơn cùng những biến đổi về vi sinh vật dẫn đến thay đổi vềmàu sắc, cấu trúc và hương vị Trước khi được đóng gói chuyển đi tiêu thụ, rau quảCBTT trải qua một hay nhiều khâu chế biến như gọt vỏ, cắt, thái lát, tạo hình, xử lýhóa học,…(hình 1.3).Mỗi khâu trong quy trình sản xuất, đóng gói và bảo quản đều

có thể ảnh hưởng đến dinh dưỡng và chất lượng của sản phẩm Những khâu xử lý

cơ học được xem như là tiêu chí giới hạn tuổi thọ của sản phẩm cắt bởi có thể gâynên sự phá vỡ của nhiều tế bào và giải phóng ra những sản phẩm nội bào (nhưenzyme ôxi hoá), lây nhiễm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc [48] Điều quan trọng

là quá trình cắt gọt làm tăng diện tích mô bị chấn thương làm hô hấp tăng lên, tạođiều kiện thuận lợi cho vi sinh vật xâm nhập và phát triển, quá trình thối hỏng diễn

ra nhanh chóng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng thời điểm chế biến tối thích đểgiảm thiểu những hư hỏng do cắt gọt phụ thuộc vào loài, giống và mùa vụ, quá trìnhthu hoạch và những điều kiện sau thu hoạch [34]

Trong quy trình chế biến, khâu rửa là khâu quan trọng nhất tác động đến chấtlượng và tuổi thọ của sản phẩm Bước đầu tiên trong khâu rửa rau quả nguyên nhìnchung được tiến hành bằng cách ngâm rửa trong nước máy để loại bỏ dư lượngthuốc trừ sâu, tàn dư thực vật và những tạp chất khác Bước rửa thứ hai được thựchiện sau quá trình loại vỏ hay cắt gọt để loại bỏ vi sinh vật và dịch mô Chất lượng

cảm quan và vệ sinh của nước rửa phải đảm bảo và có nhiệt độ thấp (dưới 5ºC) Nếukhâu rửa này được thực hiện cẩn thận thì tuổi thọ của sản phẩm CBTT có thể kéodài được vài ngày Nhìn chung, rau quả hay được ngâm trong dung dịch sát trùngchứa clorin hoặc hoá chất kháng vi sinh vật Nhiều kết quả nghiên cứu công bố hiệnnay chỉ ra rằng các biện pháp rửa và vệ sinh bao gồm những hóa chất vệ sinh mớinhất (clorin dioxit, ozon và axít peroxyaxetic) không có khả năng loại bỏ trên 90hay 99% vi sinh vật [37] Ngoài ra, những xử lý rửa và vệ sinh khác nhau có thể cónhững tác động xấu đến chất lượng dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm [90]

Hình 1.3 Sơ đồ CBTT rau quả [38]

Những sản phẩm cắt được đặc trưng bởi tuổi thọ ngắn hơn so với sản phẩmnguyên, bởi tính mẫn cảm hơn với thối hỏng do vi sinh vật, tỷ lệ hô hấp và sản sinhetylen tăng do mô bị tổn thương Quá trình chế biến (như cắt, tạo hình,…) gây ranhững tổn thương ở mô là nguyên nhân gây nên biến màu do enzyme, biến đổi vềcấu trúc, tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, gây tổn thất về khốilượng và sản sinh ra mùi vị không mong muốn, bởi vậy làm giảm tuổi thọ sảnphẩm

Tiềm năng của MAP trong bảo quản nhiều loại nông sản, thực phẩm đã đượcbiết đến nhiều Từ những lợi ích của khí điều biến trong bao gói sản phẩm rau quả

cắt, nhiều vật liệu bao gói có khả năng kiểm soát thành phần ôxi và cacbonic phùhợp được lựa chọn [70] Thực tế, nhiều loại polymer và hỗn hợp khí tối ưu cho cácloại sản phẩm rau quả cắtđược sử dụng Tuy nhiên, vẫn tồn tại một vấn đề chính liênquan đến độ an toàn của sản phẩm khi sử dụng MAPlà bên cạnh việc làm suy giảmquần thể vi sinh vật gây hại thì vẫn có sự phát triển dần dần của vi khuẩn gây bệnh[21] Bởi vậy, những kỹ thuật mới nhằm duy trì chất lượng và ức chế sự phát triểncủa vi sinh vật được áp dụng ở tất cả các khâu của sản xuất và chuỗi phân phối sảnphẩm do vi sinh vật có thể thích nghi sống sót ở điều kiện áp dụng biện pháp kiểmsoát trước đó Ngoài ra, rất cần có sự phối hợp sử dụng của nhiều biện pháp bảoquản khác nhau để đem đến hiệu quả kéo dài thời gian bảo quản rau quả cắt [50].

Xuất phát từ những tiêu chí về chất lượng mong muốn giữ được những đặctính tốt nhất của rau quả cắt, người tiêu dùng quan tâm những đặc điểm về hìnhdáng ngoài, mùi vị và tính tiện dụng giống như dạng tươi Thực tế rõ ràng rằng bất

cứ một sản phẩm thực phẩm nào cũng đòi hỏi độ an toàn đối với người tiêu dùng,thì ở đây sản phẩm cắt rất mẫn cảm với sự lây nhiễm Trong số những giới hạn củathời hạn bảo quản sản phẩm cắt gồm sự gây hại do vi sinh vật, sự mất nước, biếnmàu hay hóa nâu, tẩy màu, biến đổi về cấu trúc và sự phát triển những mùi lạ.Những khía cạnh về chất lượng đầu tiên cần quan tâm chính là màu sắc, cấu trúc,hương thơm và giá trị dinh dưỡng[52]

1.2.2.2 Biện pháp xử lý cơ học rau quả chế biến tối thiểu

Cắt tạo hình rau, củ quả đóng vai trò rất quan trọng trong chế biến nói chung.Ngoài việc làm tăng thêm tính hấp dẫn của món ăn, rau, củ, quả được cắt với kích thướchợp lý còn giúp các chuyên gia chế biến tìm ra chế độ công nghệ tối ưu của qui trình chếbiến cho từng sản phẩm cụ thể

Cắt tạo hình rau quả CBTT có ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm trong quátrình bảo quản Thời hạn bảo quản của đu đủ cắt lát ở 5ºC và 10°C kéo dài hơn đu đủ cắthình trụ là 2 và 1 ngày tương ứng [70] Độ sắc của dao cắt cũng có thể ảnh hưởng đếnchất lượng của sản phẩm CBTT Dưa hấu được cắt tạo hình bằng dao cùn sẽ làm tănghàm lượng etanol, xuất hiện mùi lạ, rò gỉ chất điện giải và có khả năng sản sinh etylencao hơn so với sản phẩm được cắt bằng dao sắc [7] Tương tự, sử dụng thiết bị cắt sắccũng sẽ làm giảm những tổn thương cơ học, sự tích lũy lignin, vệt trắng, mềm hóa và sựphát triển của vi sinh vật ở cà rốt CBTT [19]

Trong quá trình CBTT (bao gồm gọt vỏ, cắt tạo hình và phân loại) nhiều tế bào bịphá vỡ và những sản phẩm nội bào như enzym ô xi hóa được giải phóng làm gia tăng

quá trình thối hỏng của sản phẩm do bề mặt cắt của rau quả rất dễ bị VSV tấn công Thực

tế, mỗi khâu của quá trình chế biến đều có ảnh hưởng đến chất lượng và hệ vi sinh vậtcủa rau quả cắt Nhiều loại quả như táo, kiwi, lê, dưa luôn đòi hỏi phải gọt vỏ trongquy trình CBTT Một số phương pháp loại vỏ được sử dụng Tuy nhiên, ở quy môcông nghiệp loại vỏ thường được thực hiện bằng cơ học, hoá học hay bằng thiết bị

áp suất cao Khâu này nên được thực hiện càng nhẹ nhàng càng tốt và biện pháp tốtnhất là cắt gọt và bào vỏ phải được thực hiện bằng dao hay lưỡi dao làm bằng thép càngsắc càng tốt.Biện pháp loại vỏ bằng cách bào và quay tròn làm tăng tỷ lệ phát triểncủa vi sinh vật hơn là loại vỏ bằng tay Bởi vậy, nếu sử dụng biện pháp gọt vỏ cơhọc thì cần phải sử dụng dao để gọt Những biện pháp khác gây phá vỡ thành tế bàocủa sản phẩm và làm tăng hư hỏng cần phải tránh [15]

Nhiều dung dịch khác nhau được đánh giá nhằm hạn chế sự hư hỏng trong quátrình gọt vỏ, cắt hay thái lát Xu hướng mới nhất hiện nay là phương thức ngâm [5][13][45] Cắt gọt quả trong khi ngâm nước sẽ kiểm soát được áp suất trương nở bởi sự hìnhthành màng ngăn nước hạn chế sự thất thoát của dịch quả Hơn nữa, môi trường nướccũng giúp loại bỏ enzym phân hủy vật chất ở mô thực vật Ngoài ra, chiếu tia UV-C cũng

có thể được sử dụng trong quá trình cắt gọt rau quả nhằm tạo ra hiệu ứng phòng chốngkhả năng tăng nhạy cảmdiễn ra ở mô rau quả, bởi vậy giảm được nâu hóa và tổn thươngcủa sản phẩm rau quả cắt [9] Một phương pháp thay thế khác là cắt gọt phun nước làphương pháp cắt không tiếp xúc sử dụng hơi nước áp lực cao để cắt sản phẩm

1.2.2.3 Biện pháp xử lý vi sinh vật trên rau quả chế biến tối thiểu

Rau quả cắt rất dễ bị thối hỏng do vi sinh vật gây ra phụ thuộc vào nhiềuyếu tố Nhìn chung, pH của mô thực vật dao động trong khoảng 5-7 thích hợp cho

sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật gây hại Hệ vi sinh vật gây hại trên rauhoàn toàn khác với trên quả Nhiều loại quả có đặc tính bảo vệ cơ học như vỏ dày,chứa hợp chất kháng vi sinh vật như tinh dầu Quả có chứa axít hữu cơ với sốlượng vừa đủ làm cho pH= 4-6 hoặc thấp hơn Bởi vậy, vi sinh vật gây thối hỏngtrên quả cắt chủ yếu là nấm men, nấm mốc và một số ít là vi khuẩn bởi tính axítcủa quả một phần nào ức chế được khả năng phát triển của vi khuẩn gây hại, trongkhi đó sản phẩm rau cắt thường có pH cao hơn (từ 4,5-7) lại là nơi phát triển thíchhợp cho vi khuẩn gây hại [104]

Quá trình gây thối hỏng của vi sinh vật ở sản phẩm quả cắt thường diễn ranhanh hơn ở rau cắt bởi hàm lượng đường của quả cắt cao hơn Đường chính lànguyên nhân thúc đẩy sự xâm nhập và phát triển nhanh của vi sinh vật [22] Nhìnchung, khoảng 2/3 thối hỏng của quả cắt là do nấm mốc Những loài nấm gây hại

trên quả cắt thường gặp thuộc giống Fusarium, Penicillium, Botrytis, Sclerotinia, Rhizopus, Aureobasidium, Aspergillus, và Alternaria, trong đó có nhiều loài có

khả năng sinh độc tố mycotoxin Một số loài vi khuẩn được tìm thấy trên rau

như: Erwinia carotovora, Pseudomonas fluorescens, P aeruginosa, P luteola, Bacillus sp, Cytophaga johnsonae, Xanthomonas campestri, Vibrio fluvialis [37].

Nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm phân hủy pectin (pectinolitic) gây thối nhũn môchiếm 10-20% tổng số chủng phát hiện trên rau xà lách thái nhỏ và số lượng lớn

loài thuộc Pseudomonads (chiếm 20-60% tổng số chủng) trên cà rốt và chicory thái sợi Những loài được xác định chủ yếu là: P paucimobilis, P viridiflora, P luteola, Xanthomonas malthopila, Flavobacterium sp, Cytophaga sp Ở nghiên

cứu khác cho thấy có tới 50-60% chủng vi khuẩn được phát hiện trên một số rau

ăn lá được bảo quản lạnh thuộc giống Pseudomonads, chủ yếu là loài Pseudomonas fluorescens [70]

Những sản phẩm rau quả sẵn sàng để sử dụng vẫn còn bị nhiễm vi sinh vậtgây bệnh sau quá trình CBTT là một vấn đề tồn tại trong đảm bảo an toàn thực

phẩm Trong số đó, đáng kể đến là Listeria monocytogenes và Escherichia coli Kết

quả kiểm tra trên nhiều mẫu rau CBTT ở Anh như bắp cải, cần tây, hành tây, cà rốt,

xà lách, dưa chuột,…phát hiện thấy 6,7% nhiễm Listeria monocytogenes, và 12,5%

trên mẫu quả CBTT ở Venezuela [80]

Một loài vi khuẩn gây bệnh nguy hiểm với con người có tần xuất xuất hiện

lớn trên rau quả trong CBTT phải kể đến vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy Escherichia coli, trong đó có chủng E coli O157: H7 là một trong những chủng có khả năng gây bệnh nặng nhất Đặc biệt, chúng là loại rất dễ lây nhiễm giữa người với người E coli O157: H7 là chủng có khả năng chịu được nhiệt độ thấp và pH thấp Nghiên cứu kiểm tra khả năng phát triển của Salmonella sp, E coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus trên cam bóc vỏ cho thấy số lượng E coli

vẫn giữ nguyên khi bảo quản ở nhiệt độ 4 và 8ºC [90] Một số tác giả đã chỉ ra rằng

Salmonella và Shigella có khả năng thích nghi với những điều kiện pH khác nhau

và phát triển trên táo, đu đủ, dưa hấu, dưa vàng cắt đặc biệt là ở nhiệt độ thường[104]

Rau quả cắt rất dễ bị tấn công bởi vi sinh vật, chính điều này làm giảm thờihạn bảo quản của rau quả cắt Bởi vậy, tiêu chí đầu tiên trong bảo quản rau quả cắtchính là hạn chế tới mức thấp nhất sự phát triển của vi sinh vật gây hại rau quả Một

số hợp chất kháng vi sinh vật khác được sử dụng để nhúng hay bao bề ngoài sảnphẩm và những xử lý với các loại màng bao ăn được cũng có tác dụng kéo dài thời

gian bảo quản của rau quả chế biến tối thiểu Ngoài ra, phương pháp bao gói khíđiều biến (MAP) và phương pháp vật lý như chiếu xạ (UV), xử lý nhiệt và bức xạcũng thu được kết quả tốt trong bảo quản rau quả CBTT [96].

a. Sử dụng hoá chất

Một số hợp chất hoá học đã được sử dụng nhằm giảm quần thể vi sinh vậttrên rau quả cắt và những hoá chất này được sử dụng nhiều nhất trước, trong và sauquá trình CBTT [26] Những hoá chất có chứa clo như dung dịch clo, hypoclorit vàclorin dioxide thường được sử dụng ở nồng độ 50 – 200 ppm và xử lý ít hơn 5 phút[36] Từ lâu người ta đã sử dụng nước clo hóa ở nồng độ cho phép (200 ppm) để xử

lý rau quả cắt Việc này có thể hỗ trợ để kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm thôngqua việc làm giảm quần thể vi sinh vật gây hại, loại bỏ dịch quả tại bề mặt cắt vàngăn chặn phản ứng enzyme liên quan đến quá trình nâu hóa Thực tế thì nước clohóa hay được sử dụng để làm sạch rau chẳng hạn như salad và một số ít loại quả cắtbởi nó có thể đem đến những ảnh hưởng không mong muốn như làm tăng hoạt độnước hay làm mất thành phần liên quan đến hương của sản phẩm Một số loại quả íthoặc hầu như không bị biến màu như dưa đỏ và dưa bở thì có thể dùng hypoclorit(pH 6, 50 µl/l) để nhúng ngay sau khi cắt miếng và đóng gói khí điều biến (95% N2+ 5% O2) bảo quản ở nhiệt độ 2,2ºC Điều kiện xử lý này giữ được sản phẩm đảmbảo chất lượng cảm quan và vi sinh vật [37]

Bên cạnh việc sử dụng clo, một số hợp chất canxi cũng được biết đến là cókhả năng làm giảm quần thể vi sinh vật và kéo dài thời gian của rau quả, đặc biệt làcanxi lactate được sử dụng trên nhiều loại quả như dưa đỏ cắt [51] và táo cắt [13]

Tuy nhiên, việc sử dụng hóa chất đang ngày càng bị hạn chế bởi mong muốncủa người tiêu dùng đang hướng tới những sản phẩm có bản chất tự nhiên có tính antoàn cao Một số nghiên cứu chỉ ra rằng tinh dầu có thể là ứng cử viên tốt sử dụngtrong bảo quản so với chất hoá học Chẳng hạn như, methyl jasmonate (MJ), mộthợp chất tự nhiên được phát hiện ở trong tinh dầu Jasminum và nhiều loài thực vậtkhác được chứng minh là có khả năng kéo dài thời gian bảo quản của xoài cắt, ổicắt và dâu tây cắt [40] Một bằng chứng khác được cung cấp bởi nghiên cứu củaRoller và Seedhar là carvacrol và axít cinnamic có khả năng ngăn chặn được sự thốihỏng do vi sinh vật gây ra trên dưa hấu và kiwi CBTT Quả kiwi sau khi gọt vỏ, cắtmiếng được ngâm vào trong dung dịch chứa 5-15 mM carvacrol hoặc 1 mM axítcinnamic trong thời gian 1 phút đã làm giảm vi sinh vật tổng số từ 6,6 xuống dưới 2

log CFU/g trong thời gian 21 ngày bảo quản ở 4ºC [83] Tuy nhiên, hiệu quả kiểmsoát vi sinh vật của tinh dầu bị giảm đi khi kéo dài thời gian bảo quản.

Trong số những hợp chất tự nhiên sử dụng cho rau quả, axít xitríc và axítascorbic cũng được công bố nhiều với khả năng làm giảm quần thể vi sinh vật gâyhại trên rau quả Hoạt động kháng vi sinh vật những axít này dựa trên cơ sở làmgiảm pH của môi trường, phá vỡ tính thấm của màng, tích luỹ anion hay giảm pHnội bào bởi sự phân ly ion hydro từ axít Đặc biệt hơn, axít xitric đã được chấp nhận

sử dụng có hiệu quả trong việc làm giảm pH bề mặt của quả cắt như cam, táo đào,

mơ, kiwi, bơ và chuối [78] Hiệu quả ức chế vi sinh vật của các loại axít này rất yếu

và muốn đạt được hiệu quả cao thì cần phải dùng một lượng lớn, điều này lại ảnhhưởng đến vị của sản phẩm

Để đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng giảm tới mức tối thiểu sử dụng chấtbảo quản hóa học, thực phẩm được bảo quản bằng hóa chất “càng tự nhiên càngtốt”đang ngày càng được quan tâm chú trọng nhiều hơn và nhiều nỗ lực đã đượcthực hiện nhằm tìm ra những hợp chất tự nhiên thay thế chất hóa học có khả năngphòng trừ vi sinh vật gây hại trên rau quả chế biến tối thiểu [26] Bởi vậy, nhữnghợp chất tự nhiên có khả năng kháng vi sinh vật như các hợp chất phenol, chitosan,aldehit và axít hữu cơ đã được đánh giá và chứng minh hiệu quả của chúng đối vớisản phẩm thực phẩm [28] Gần đây, một số nghiên cứu đã bắt đầu thử nghiệm nisin

và pedioxin kết hợp với EDTA, axít xitric, natri lactat, kali sorbat và axít phytic để

xử lý rau quả cắt trong CBTT làm giảm đáng kể quần thể vi khuẩn Listeria monocytogenes [18] Bởi vậy, việc sử dụng axít phenyllactic trong kiểm soát vi sinh

vật trên rau quả chế biến tối thiểu sẽ là một hướng nghiên cứu mới trong thực tiễnhiện nay

µl hexanal/l) và β- cyclodextrin-acetaldehyde (0,12 µl acetaldehyde/l) có hiệu quảkháng Alternaria alternate, Colletotrichum acutatum và Botrytis cinerea [11] Năm

2009, một số tác giả đã nghiên cứu và ứng dụng loại túi chứa chất 2-nonanone ở cácnồng độ khác nhau (2,5; 5 và 10 µl), là hợp chất dễ bay hơi được tìm thấy trong quả

dâu tây, được thẩm thấu vào alumin như là chất rắn hấp phụ và tạo thành một phầncủa bao gói làm tăng thời gian bảo quản của sản phẩm [10] Bao gói có chứahexanal trong môi trường bảo quản với liều nhỏ hơn 100 ppm sử dụng để bảo quảntáo cắt lát đã có ảnh hưởng quan trọng đến chất lượng của táo như làm giảm tỷ lệsinh trưởng của quần thể vi sinh vật trong quá trình bảo quản ở 4 và 15ºC [52] Mộtloại bao gói kháng vi sinh vật khác, trong đó hợp chất kháng vi sinh vật được baotrong polymer dạng khối và nó phải thẩm thấu lên bề mặt để tương tác với vi sinhvật Một số loại polymer tổng hợp và tự nhiên được sử dụng như là chất mang cũngđược công bố trong thời gian gần đây [59] Những chất kháng vi sinh vật cố địnhgồm peptide, enzyme, polyamine và axít hữu cơ cũng được sử dụng [52] Một đặctính không tiện dụng của loại bao gói này là sự tiếp xúc trực tiếp của polymer vớisản phẩm rau quả tươi thì mới có thể ngăn ngừa được sự phát triển của vi sinh vật.

c. Sử dụng màng bao ăn được

Màng bao ăn được là một lớp màng mỏng chứa nguyên liệu ăn được(hydrocolloid hay chất béo) được áp dụng trên bề mặt của thực phẩm với mục đíchtạo ra màng bán thấm đối với khí, hơi nước và những hợp chất dễ bay hơi Màngbao này có khả năng kéo dài thời gian bảo quản của quả cắt thông qua việc làmgiảm quá trình hô hấp và già hóa, đồng thời giữ được hương thơm, cấu trúc và màusắc của sản phẩm Những hợp chất được sử dụng phổ biến nhất để tạo ra màng gồmchitosan, tinh bột, cellulose, alginate, carrageenan, zein, gluten, whey, carnauba, sápong và axít béo [55][67]

Trong nhiều trường hợp, một số phụ gia được bổ sung vào công thức màngbao với mục đích hỗ trợ bảo quản đảm bảo chất lượng sản phẩm rau quả cắt và cụthể là chức năng của một số loại màng được nâng cao khi kết hợp với những chấtkháng vi sinh vật Một số chất được sử dụng bao gồm lysozyme, nisin, axít hữu cơ,tinh dầu đã được chứng minh vừa đảm bảo chất lượng sản phẩm lại vừa an toàn[17] Hiệu quả bảo quản của màng alginate phối hợp cùng axít malic và tinh dầuquế, cọ và cỏ chanh cũng đã được khảo sát bởi Raybaudi-Massillia và cộng sự [79].Trong nghiên cứu khác, dưa hấu cắt (50 g) được bao màng trước khi đóng túi với

khay polypropylene và bảo quản ở 5ºC Dưa hấu cắt được cấy chủng Salmonella enteritidis (108 CFU/ml) trước khi phủ màng để đánh giá khả năng kháng khuẩn củamàng Kết quả cho thấy màng bao có hiệu quả nâng cao chất lượng vệ sinh của quả(lên tới 9,6 ngày) và chất lượng hoá lý (hơn 14 ngày) so với dưa hấu cắt không đượcphủ màng (3,6 ngày và ít hơn 14 ngày tương ứng) [7]

d. Bao gói khí điều biến (MAP)

MAP là một trong những kỹ thuật được sử dụng để đem đến độ an toàn củarau quả CBTT và kéo dài thời hạn bảo quản, thậm chí một số kỹ thuật thay thếkhác đang được sử dụng ngày càng nhiều Rau quả tươi sau thu hoạch vẫn tiếp tục

hô hấp, sử dụng ôxy và sản sinh ra cacbon dioxide và hơi nước Bởi tính đa dạngcủa các loại rau quả về thành phần cấu tạo, hệ vi sinh vật tự nhiên, độ pH, cấu trúc

và màu sắc nên mỗi loại rau quả đều cần sử dụng mỗi loại bao gói thích hợp riêng.Nhiều ứng dụng MAP đã thành công đối với nhiều loại rau quả như dứa cắt [66],táo [85], kiwi [83], chuối [103],… Nhìn chung, bảo quản rau quả cắt với khí cónồng độ O2 thấp có khả năng ức chế sự phát triển của hầu hết vi sinh vật gây hạihiếu khí trong khi sự phát triển của bệnh hại, đặc biệt là những loài vi khuẩnkhông phân giải protein ưa lạnh kị khí có thể phát triển hoặc thậm chí được kíchthích phát triển Nếu sử dụng khí có nồng độ O2 rất thấp thì có thể dẫn đến việctăng hiện tượng lên men Việc lựa chọn nguyên liệu bao gói khí điều biến chínhxác cung cấp môi trường khí có lượng O2 và CO2 thích hợp sẽ đem đến nhiều lợiích cho bảo quản rau quả CBTT [89] Thực tế, đã có rất nhiều loại polymer và hỗnhợp khí sử dụng tối ưu để bao gói mỗi loại sản phẩm rau quả cắt Lê cắt đượcđóng gói bằng túi thấm khí là 15 cm3 O2/m2/bar/24h với lượng khí ban đầu là 0kPa O2 và bảo quản ở nhiệt độ lạnh có tác dụng kéo dài thời gian bảo quản ít nhất

3 tuần [30] Dứa cắt có thể bảo quản được 4 ngày (ở 10ºC) cho tới hơn 2 tuần (ở0ºC) dưới điều kiện 10% CO2 và tối đa 8% O2 [66]

Lê cắt được cấy hai chủng vi khuẩn L monocytogenes và E.coli O157:H7

(105 CFU/g) rồi được bao gói bằng khí điều biến (65% N2, 30% CO2, 5% O2) vàđem bảo quản ở bốn điều kiện nhiệt độ khác nhau (4, 8, 12 và 20ºC) Kết quả cho

thấy L monocytogenes có khả năng phát triển trong quá trình bảo quản ở tất cả các điều kiện thí nghiệm, trong khi đó E.coli O157:H7 có thể phát triển ở 4 và 8ºC,

thậm chí dưới điều kiện MAP, nhưng bị ức chế hoàn toàn ở những nhiệt độ cao hơn[25]

Trong nhiều trường hợp để nâng cao hiệu quả kháng vi sinh vật ở rau quảCBTT, người ta có thể sử dụng kết hợp bao gói khí điều biến với các biện pháp xử

lý như xử lý hoá chất và nhiệt độ thấp Saxena và cộng sự đã khảo sát ảnh hưởngcủa xử lý MAP kết hợp với xử lý hoá chất đến chất lượng của mít CBTT khi bảoquản ở nhiệt độ thấp Trong nghiên cứu này, mít cắt được xử lý với canxi clorít, axítascorbic và benzoate natri trước khi bao gói khí điều biến với 3 kPa O2 và 5 kPa

CO2 Kết quả cho thấy hiệu quả của tiền xử lý bằng hoá chất kết hợp với MAP đãngăn chặn được sự phát triển của vi sinh vật gây hại sản phẩm Đặc biệt, những mẫu

được xử lý với CaCl2 (1% w/v), axít ascorbic (0,02% w/v), axít xitríc (1% w/v) vànatri benzoate (0,045% w/v) kết hợp với MAP có thời hạn bảo quản 20 ngày, dàihơn so với những mẫu chỉ xử lý với CaCl2 (1% w/v) và axít ascorbic (0,02% w/v).Đồng thời, bao gói khí điều biến đã có vai trò trong việc làm giảm đáng kể quần thể

vi sinh vật gây hại sản phẩm bảo quản [91]

e. Xử lý vật lý

Xử lý rau quả cắt bằng chiếu tia UV có một số ưu điểm như không để lạitồn dư, không hạn chế liều xử lý, dễ tiến hành, phổ kháng vi sinh vật rộng, khôngđòi hỏi đầu tư cao và có trang thiết bị an toàn [81] Chiếu tia UV-C ở bước sóng

254 nm có khả năng diệt khuẩn cao nhất, được sử dụng nhiều nhất trong việc sáttrùng bề mặt và kiểm soát sự phát triển của vi sinh vật ở những sản phẩm rau quảnguyên và cắt [65] UV hoạt động như là một nhân tố kháng vi sinh vật trực tiếpnhờ phá huỷ AND và gián tiếp bằng cách gây ra cơ chế kháng lại bệnh hại [9].Artes-Hernandez và cộng sự đã đánh giá ảnh hưởng của UV-C ở bốn liều chiếukhác nhau (1,6; 2,8; 4,8; và 7,2 kJ/m2) đến sự thay đổi về chất lượng của dưa hấucắt bảo quản ở 5°C trong thời gian 11 ngày UV-C đã làm giảm đáng kể quần thể

vi sinh vật trên quả gồm vi khuẩn đường ruột, vi khuẩn ưa lạnh và vi khuẩn ưanhiệt sau 11 ngày bảo quản ở 5ºC [16]

Xử lý nhiệt cũng được xem là một biện pháp hữu hiệu để xử lý rau quảCBTT Một số cách thức xử lý nhiệt bao gồm sử dụng nước nóng 85-100°C hoặchơi nước, vi sóng, tần số radio, bức xạ hồng ngoại [25] Biện pháp xử lý này mặc dùtiêu diệt được vi sinh vật nhưng lại gây ra một số biến đổi về chất lượng của rau quảcắt như làm tổn thất dinh dưỡng, biến đổi cấu trúc và màu sắc của sản phẩm Sốcnhiệt là một phương pháp thường được sử dụng như là một bước rửa ở nhiệt độ 45-70ºC trong vài phút, thông thường là ít hơn 5 phút [58]

Chiếu xạ đã được FDA chấp thuận cho phép sử dụng đối với rau và quả ởliều tối đa là 1,0 kGy Trong một số trường hợp, chất lượng của sản phẩm được đảmbảo nhưng cũng có trường hợp lại gây nên tổn thất về chất lượng [81] Nghiên cứuthử nghiệm trên dưa đỏ đã cho thấy những mẫu được chiếu xạ có tỷ lệ hô hấp thấphơn, ổn định hơn và có lượng vi sinh vật tổng số thấp hơn so với mẫu không đượcchiếu xạ sau 20 ngày bảo quản [22]

Xử lý áp suất cao trong khoảng 3000-8000 bar kết hợp với xử lý nhiệt thôngthường cũng mới bắt đầu được áp dụng trên một số thực phẩm nhằm bất hoạt visinh vật và enzyme mà không làm ảnh hưởng đến chất lượng dinh dưỡng và hương

vị của sản phẩm Tuy nhiên, vẫn còn một số bất lợi của biện pháp này đối với rauquả cắt bởi nó tác động đến tính nguyên vẹn của độ xốp của sản phẩm sau quá trìnhtăng và giảm áp suất của không khí gây ra sự nén ép và trương phồng lên [80].

1.2.2.4 Biện pháp ổn định màu và độ cứng sản phẩm cắt

Rau quả hấp dẫn và bắt mắt nhờ có chứa nhiều chất màu hấp dẫn Việc bảoquản màu xanh của diệp lục ở rau; màu đỏ, màu tím của anthocyanin; màu vàng,màu cam, màu đỏ của carotenoid ở cả rau và quả là những yếu tố quan trọng cần đểduy trì chất lượng Hiện tượng biến màu của rau quả CBTT được xác định bởinguyên nhân chính là do enzyme, ngoài ra cũng có một số nguyên nhân khác gâybiến màu như hiện tượng đốm trắng ở cà rốt CBTT

Nâu hoá do enzyme là một phản ứng màu diễn ra phổ biến ở rau và quả, cóliên quan đến sự tương tác của ôxy, hợp chất phenol và enzyme polyphenol oxidase(PPO) Nâu hoá do enzyme là yếu tố bất lợi trong quá trình bảo quản chất lượng củacông nghiệp rau quả cắt mặc dù nó có thể đem lại lợi ích cho việc phát triển màu vàhương vị của một số sản phẩm thực phẩm như chè, cà phê và cacao Một số loại rau

và quả như táo, lê, chuối, đào, rau diếp và khoai tây đặc biệt mẫn cảm với nâu hoá

do enzyme trong quá trình chế biến và bảo quản Nâu hoá không chỉ có ảnh hưởngxấu đến hình thức bên ngoài của chúng mà còn làm giảm sút những đặc tính cảmquan khác như mùi, vị và cấu trúc cũng như giá trị dinh dưỡng [32]

Biến màu do enzyme có thể được kiểm soát thông qua việc sử dụng các biệnpháp hoá học và vật lý, và trong hầu hết các trường hợp cả hai biện pháp cùng được

sử dụng

a. Sử dụng hoá chất

Các loại hoá chất sử dụng để kiểm soát nâu hoá gồm chất hoạt động trực tiếpnhư là những chất ức chế PPO, những chất tạo nên môi trường không thích hợp chophản ứng nâu hoá xảy ra, và những chất hoạt động bằng cách phản ứng với chất tạo

ra từ phản ứng của PPO trước khi chúng có thể hình thành nên những chất màukhông mong muốn

Hiện nay, việc sử dụng những hợp chất khử bao gồm axít ascorbic (AA) vàđồng phân của nó, cystein, glutathione và canxi ascorbate đạt hiệu quả cao trongkiểm soát biến màu ở rau quả cắt Những hợp chất khử này đóng vai trò quan trọngtrong việc kháng nâu thông qua quá trình khử o-quinone thành diphenol không màu

và phản ứng bất thuận nghịch với o-quinone để tạo ra những sản phẩm không màubền vững Axít ascorbic và đồng phân của nó được sử dụng trong nhiều nghiên cứu

kiểm soát sự biến màu rau quả cắt với dải nồng độ từ 0,5 đến 4% và được xếp vàonhóm chất kháng ôxi hóa an toàn (GRAS).Đánh giá khả năng kháng nâu của canxiascorbat trên táo cắt lát cho thấy nó có hiệu quả kháng nâu tốt đồng thời giữ đượccấu trúc của táo cắt lát trong suốt thời gian bảo quản 7 ngày ở 5ºC [6] Dong vàcộng sự chỉ ra rằng lê cắt được nhúng trong dung dịch chứa 2% AA, 1% canxi lactat

và 0,5% cystein kết hợp với xử lý MAP có thể hạn chế sự biến màu và giảm độcứng từ đó làm tăng thời hạn bảo quản [30] Xử lý khoai tây CBTT bằng L-cysteine0,5% kết hợp với axít xitric 2% rồi bảo quản bằng nitơ hóa lỏng sử dụng bao góibằng màng polyolefin nhiều lớp có tính thấm cao có thể giữ được màu sắc cũng nhưchất lượng của khoai tây trong thời gian 21 ngày ở nhiệt độ lạnh [42]

Ở hầu hết các loại rau quả, hoạt động tối ưu của PPO trong dải pH từ 6,0 đến6,5 và hoạt động kém đi khi pH dưới 4,5 Sử dụng những hợp chất axít hoá làmgiảm pH sản phẩm đã được ứng dụng rộng rãi trong việc kiểm soát hiện tượng nâuhoá do enzyme gây ra Những chất thuộc nhóm này bao gồm axít xitric, axít malic,axít phosphoric, trong đó axít xitric là chất được sử dụng nhiều nhất để kiểm soátnâu hoá trên rau quả CBTT với liều lượng từ 0,5 đến 2% Ngoài tác dụng làm giảm

pH, axít xitric cũng có ảnh hưởng ức chế PPO bằng cách tạo phức với phân tử đồng

ở vị trí hoạt động của enzyme [33]

Những chất tạo keo như axít sorbic, axít oxalic, axít succinic, polyphosphate(ATP và pyrophosphate), axít ethylene diamine tetra-acetic (EDTA) có thể ức chếenzyme PPO bằng cách tạo phức đồng tại vị trí hoạt động của enzyme PPO.Polyphosphate thường được sử dụng để kháng nâu trên rau quả cắt ở nồng độ tươngđối thấp (0,5-2%) Thông thường, để kháng nâu cho rau quả cắt người ta hay sửdụng kết hợp chất tạo keo với chất khử và chất axít hoá [96]

Một trong những chất kháng nâu có tiềm năng ứng dụng nhất đối với sảnphẩm cắt là 4-hexylresorcinol, là chất hóa học đã được sử dụng an toàn trong y

tế một thời gian dài, và đã được cấp chứng nhận GRAS cho phép sử dụng đểphòng chống biến màu tôm bởi nó đã được chứng minh là có hiệu quả hơnsulfit Hiện tượng nâu hoá trên táo CBTT bị ngăn chặn đáng kể khi táo cắt látđược nhúng vào dung dịch 4-hexylresorcinol ở nồng độ thấp 0,005% Màu sắccủa lê CBTT cũng được duy trì khi được bảo quản lạnh trong thời gian 30 ngàysau khi nhúng trong dung dịch chứa 0,01% 4-hexylresorcinol, 0,5% axítascorbic và 1,0% canxi lactate [30]

Nhìn chung, những hóa chất được sử dụng để phòng và chống nâu hóa doenzyme gây ra thường được sử dụng ở dạng dung dịch với công thức chứa một hay

nhiều chất và được xử lý bằng cách nhúng sản phẩm cắt vào dung dịch Việc sửdụng phối hợp của các xử lý thường đem lại hiệu quả bảo quản sản phẩm rau quảCBTT Thông thường, axít ascorbic và canxi clorua được sử dụng kết hợp trong xử

lý rau quả cắt

Canxi được cho là có liên quan đến việc duy trì chất lượng cấu trúc của nôngsản Ion canxi hình thành nên những liên kết chéo hay những cầu nối giữa nhữngnhóm carboxyl tự do của những chuỗi pectin giúp chắc khỏe thành tế bào Xử lýthông thường để tăng độ cứng của mô là ngâm rau quả cắt trong dung dịch canxi.Một xử lý kết hợp giữa chần ở nhiệt độ thấp để hoạt hóa enzyme pectinesterase (PE)rồi ngâm trong canxi đã giúp bảo quản được cấu trúc của quả PE khử quá trìnhester hóa của pectin nên làm tăng số vị trí cầu nối canxi Với cơ chế như vậy, độcứng của táo cắt lát đã được đảm bảo theo quy trình xử lý gồm: ban đầu táo đượcgiữ ở nhiệt độ 38ºC trong 6 ngày sau thu hoạch, và rồi được xử lý cắt lát và ngâmtrong dung dịch canxi và bảo quản lạnh trong 6 tháng Dưa cắt được ngâm trongdung dịch CaCl2 ở nhiệt độ khác nhau cho thấy cấu trúc của mẫu xử lý ở 60ºC cứngchắc hơn (tăng 77% về độ cứng) so với xử lý ở 40ºC (tăng 58%) và ở 20ºC (tăng45%) [51]

Thông thường, CaCl2 được sử dụng với vai trò là chất tăng độ cứng, tuynhiên nó có thể gây ra vị đắng không mong muốn cho sản phẩm sử dụng Dưa đỏcắt khối được ngâm trong dung dịch canxi lactate giúp cải thiện được cấu trúc tươngđương với CaCl2 mà lại cho chất lượng cảm quan tốt hơn ví dụ như vị đắng vàhương thơm chấp nhận được Dưa đỏ cắt được xử lý nhiệt (60ºC) kết hợp với ngâmtrong canxi lactate không có sự khác biệt đáng kể nào về vị đắng và độ cứng so vớimẫu được xử lý ở nhiệt độ 25ºC [30]

b. Bao gói khí điều biến (MAP)

Ngành công nghiệp rau quả cắt được mở rộng hơn nhờ sự phát triển của côngnghệ MAP Mục đích của bao gói khí điều biến là tạo ra một thành phần khí lýtưởng cho bao gói thông qua việc tạo ra một môi trường khí điều biến trong bao gói

và thiết lập được khí điều biến hoạt tính trong bao gói Với MAP, một sự cân bằng lítưởng của ôxy (O2) và cacbon dioxide (CO2) được tạo ra thông qua việc kiểm soát

sự chuyển hoá của O2 và CO2qua màng bao và tỷ lệ hô hấp của sản phẩm Nhiềunghiên cứu đã chỉ ra rằng không khí chứa lượng O2 thấp và CO2 cao có thể làmchậm phản ứng hoá nâu ở rau quả Tuy nhiên, vấn đề quan trọng là phải tránh được

sự phá hủy lượng ô xy thấp và lượng cacbon dioxit cao dẫn đến hô hấp yếm khí gâymất mùi và tăng thối hỏng Thành phần của khí điều biến được được xác lập đối với

mỗi sản phẩm riêng biệt Tian và cộng sự đã chỉ ra rằng sử dụng khí kiểm soát vớithành phần 5% O2+ 10% CO2có hiệu quả ức chế PPO và POD, làm giảm hàm lượngmalondialdehyt giúp ngăn chặn hữu hiệu nâu hóa thịt quả, làm hạn chế thối hỏngquả và kéo dài thời gian bảo quản dâu tây hơn những xử lý khác [98] Sử dụng khíkiểm soát với 5% O2 và 5% CO2có thể làm giảm chấn thương lạnh và làm chậmhoạt động khử của các enzyme superoxide dismutase (SOD), catalase và POD sovới đối chứng, từ đó ức chế quá trình nâu hoá thịt quả cắt [59]

c. Xử lý nhiệt độ

Gia nhiệt là phương pháp sử dụng nhiều nhất để ổn định thực phẩm nhờ khảnăng diệt vi sinh vật và bất hoạt enzym Nâu hóa do enzym gây ra ở những sảnphẩm rau quả đóng hộp và cấp đông có thể được kiểm soát hiệu quả sử dụng biệnpháp gia nhiệt bằng hơi hay nước nóng ở nhiệt độ từ 70-105°C Tuy nhiên,việc sử dụng nhiệt độ cao có nhiều khả năng gây nên những phá huỷ đặc tính chấtlượng của thực phẩm như cấu trúc và hương thơm dẫn đến làm giảm chất lượngdinh dưỡng của sản phẩm Bởi vậy, xử lý nhiệt không thích hợp cho vệc kiểm soátbiến màu ở rau quả CBTT Xử lý nhiệt vừa phải (từ 45 đến 60ºC) được sử dụng đểgây ra sự hình thành protein sốc nhiệt đem đến nhiều lợi ích cho rau quả cắt từ kiểmsoát nâu hóacho đến ngăn ngừa bệnh hại Xử lý sốc nhiệt được xem như là một cáchmới để kiểm soát nâu hóa ở sản phẩm cắt Loaiza-Velarde và cộng sự đã cho thấyhoạt tính của PAL ở cần tây CBTT bị giảm đi rõ rệt khi xử lý sốc nhiệt trong 90giây ở 50°C [58].Tổn thương cơ học kích thích quá trình tổng hợp của enzyme nhưenzyme phenylalanine ammonia lyase (PAL), tham gia vào quá trình trao đổi phenoldẫn đến tích lũy các hợp chất phenol là những cơ chất thuận lợi cho PPO Hoạtđộng của PAL tăng lên gấp 6 đến 12 lần ở rau diếp CBTT sau khi cắt 24 giờ Xử lýsốc nhiệt đối với rau diếp trong 90 giây ở 45ºC đã ngăn chặn được hiện tượng tănghoạt động của PAL Biện pháp này được coi như là biện pháp thay thế các biện phápkhác để kiểm soát nâu hóa của sản phẩm cắt [9]

Nhiệt độ bảo quản là thông số quan trọng để đạt được tuổi thọ cao nhất củasản phẩm Bảo quản lạnh trong suốt chuỗi sản xuất đến tiêu thụ sản phẩm là vấn đềquan trọng cơ bản để kéo dài tuổi thọ của sản phẩm cắt Nhiệt độ thấp có tác dụnglàm giảm hoạt động của các enzym có liên quan đến nâu hoá Tỷ lệ của những phảnứng được xúc tác bởi enzym được điều khiển bởi phạm vi rất lớn của nhiệt độ.Tương ứng với việc giảm đi 10ºC thì sẽ có sự giảm đi 2/3 tỷ lệ phản ứng do enzymexúc tác Một số sản phẩm rất mẫn cảm với tổn thương lạnh như chuối, xoài, bơ, càchua,… thì không nên bảo quản ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ giới hạn [80] Trong

khi đó, một số loại rau như xúp lơ xanh, rau cải bó xôi, đậu,… có thể được bảo quản

ở nhiệt độ lạnh Khâu chuẩn bị thông thường đối với sản phẩm cắt là ngâm vàotrong nước lạnh để hạ thấp nhiệt độ và loại bỏ dịch bào tiết ra trong quá trình gọt vỏhay cắt sản phẩm

Như vậy, mỗi phương pháp bảo quản rau quả CBTT áp dụng trên thế giớiđều có ưu và nhược điểm nhất định Nhìn chung, hầu hết các phương pháp vẫn chưađáp ứng hoàn toàn yêu cầu về tính an toàn của rau quả CBTT Thực tế, mỗi khâutrong quy trình chế biến tối thiểu đều có ảnh hưởng đến chất lượng và hệ vi sinh vậtcủa rau quả cắt Những kết quả nghiên cứu hiện tại cho thấy rằng bất kì một biệnpháp làm sạch và vệ sinh nào cũng không làm giảm quần thể vi sinh vật 90-99%[84] Chính vì vậy, cần phải có sự kết hợp của các phương pháp xử lý qua các khâutrong quy trình CBTT như bổ sung phụ gia, các phản ứng tương hỗ hay kết hợp các

kỹ thuật bảo quản khác nhau [80].Vì vậy, việc đưa ra được phương pháp bảo quảnrau quả CBTT sử dụng hợp chất sinh học an toàn hiệu quả phù hợp với điều kiệncủa Việt Nam là hết sức cần thiết

Trên cơ sở đó, việc ứng dụng chế phẩm axít phenyllactic trong quy trình chếbiến tối thiểu rau quả nhằm kiểm soát vi sinh vật gây hại,kéo dài thời gian bảo quản vàđảm bảo chất lượng an toàn sản phẩm rau quả cắt có ý nghĩa thực tiễn lớn

1.3 Cơ sở khoa học và thực tiễn lựa chọn đối tượng áp dụng trong đề tài

Việt Nam là nước nhiệt đới rất phong phú về rau quả Những năm gần đâythị trường về rau quả cắt ở Việt Nam cũng bắt đầu được chú ý phát triển Một số sảnphẩm quả cắt nhiệt đới trên thị trường gồm dưa hấu, mít, bưởi, sầu riêng, dứa vàhỗn hợp các loại quả Sản phẩm rau cắt trên thị trường gồm rau ăn sống (hỗn hợpsalát) và rau sử dụng cho nấu nướng (gồm cà rốt, xúp lơ xanh, xúp lơ trắng, khoaitây)

Nghiên cứu về chế biến tối thiểu ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện naychưa có nhiều Trước đây Trần Thị Mai và cộng sự tại Viện Cơ điện NN và Côngnghệ STH đã nghiên cứu thăm dò về chế biến tối thiểu khoai tây và cà rốt Kếtquảđã được triển khai sản xuất thử tại doanh nghiệp Tuy nhiên thời gian bảo quảncòn ngắn và còn nhiều vấn đề cần hoàn thiện thêm như bao gói MAP, các biện phápchống nâu hóa và kiểm soát vi sinh vật gây hại Nguyễn Duy Lâm và NguyễnQuang Đức đã công bố kết quả nghiên cứu biến đổi chất lượng của dứa và mít chếbiến tối thiểu (2008 và 2011) Kết quả cho thấy điều kiện bao gói và nhiệt độ có ảnhhưởng đến biến đổi chất lượng cũng như thời gian bảo quản mít CBTT Bao gói