Các phương pháp kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm biến đổi gen GMF

Báo cáo thực phẩm biến đổi genĐề tài: Các phương pháp kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm biến đổi gen GMF GVHD:PGS.TS Khuất Hữu Thanh... PP quang phổ Định tính DNA • Kỹ thuật PC

Báo cáo thực phẩm biến đổi gen

Đề tài: Các phương pháp kiểm định và truy xuất nguồn gốc

thực phẩm biến đổi gen GMF

GVHD:PGS.TS Khuất Hữu Thanh

Nội dung

Phần 1

phẩm biến đổi gen

biến đổi gen

Phần 1: Các phương pháp kiểm định

I Tại sao phải truy xuất GMF

Hiện nay có hai quan điểm khác nhau rõ rệt về GMF

• Lợi ích

Đảm bảo ANLT, hạ giá thành lương thực

Bảo tồn đa dạng sinh học

Giảm tác hại của các hoạt động nông nghiệp đến môi trường

Góp phần xóa đói giảm nghèo

Giảm thiểu tác hại của biến đổi khí hậu và giảm lượng khí gây hiệu ứng nhà kính

1 Tại sao phải truy xuất GMF

Tuy nhiên thì vẫn có những quan điểm nói GMF tồn tại nguy

cơ tiềm ẩn đối với sức khỏe con người:

Gây dị ứng

Nhờn thuốc kháng sinh

Tạo độc tố và gây độc lâu dài cho cơ thể

II Các phương pháp xác định

 Cơ sở phương pháp

• Dựa trên sự khác biệt giữa GMF và non-GMF:

- Sự khác biệt về mặt di truyền, AND ngoại lai được đưa vào

- Sự khác biệt về protein mã hóa bởi gen chuyển vào.

1 Nhận biết GMO bằng phương pháp DNA

• Đánh giá chất lượng và hàm lượng DNA

1 PP điện di

2 PP quang phổ

Định tính DNA

• Kỹ thuật PCR

- Thiết kế cặp mồi

- Chạy PCR

- Tách trên gel agarose

Định lượng DNA

• Kỹ thuật real time – PCR

- Dựng đường chuẩn DNA gen chuẩn

và gen đích

- Tiến hành real time - PCR

Thông tư quy định quy trình kỹ thuật và định mức kinh tế - kỹ thuật trong phát hiện sinh vật biến đổi gen bằng phương pháp phân tích định tính, định lượng axít deoxyribonucleic.

Số: 13/2013/TT-BTNMT 21/6/2013

Sơ đồ quy trình PCR xác định GMO theo Quy định của Bộ

TNMT 8.2012

Thu thập mẫu ( Nghi có GMO )

Tách chiết DNA

Phát hiện sản phẩm biến đổi gen ( GMO)

Định lượng sản phẩm biến đổi gen (GMO)

Dán nhãn GMO

• Bước 1: Lấy mẫu thực phẩm

- Mẫu lấy được đựng vào các bao đựng mẫu sạch, kín, ghi đầy đủ thông tin

- Niêm phong có chữ kí người lấy mẫu và đại diện cơ sở được lấy mẫu

- Lấy mẫu cần đại diện cho toàn bộ lô mẫu

- Phương pháp lấy mẫu với số lượng lớn:

+ Lấy ngẫu nhiên mẫu tại các điểm khác nhau

+ Trộn đều mẫu và rút 1 mẫu ra phân tích

• Bước 2: Tách chiết DNA

- Phương pháp tách chiết cơ bản gồm 4 bước sau:

Phá vỡ màng tề bào và

màng nhân

Loại bỏ thành phần không mong muốn

Tủa axit nucleic

Hòa tan cặn và thu

DNA

Bước 3: Phát hiện sản phẩm biến đổi gen

Các vùng DNA sử dụng:

+ Vùng A: sàng lọc để xác định

sản phẩm có chứa GMO hay không?

Dựa trên các trình tự phổ biến:

Promoter P 35S

Terminater T – nos

+ Vùng B: đặc trưng cấu trúc đoạn

DNA chuyển gen nhưng có ở nhiều loài

Þ định tính

+ Vùng C: đặc trưng cho sự kiện chuyển gen cụ thể => định tính và định lượng

• Bước 4: Định lượng sản phẩm biến đổi gen

- Căn cứ tỷ lệ mẫu phát hiện có GMF/ tổng khối lượng mẫu => tính % sản phẩm BĐG

• Bước 5: Dán nhãn sản phẩm BĐG

- Dán nhãn theo quy định quốc tế :

+ Loại chuyển gen

+ Tác dụng

+ Mức độ an toàn

+ Hàm lượng phần trăm

….

+ Biến tính: sử dụng nhiệt độ ( 90 - 95 C) biến tính DNA tách mạch⁰C) biến tính DNA tách mạch

+ Bắt cặp: nhiệt độ (50 - 65 C) gắn cặp mồi đặc trưng⁰C) biến tính DNA tách mạch

+ Kéo dài chuỗi: Nhiệt độ (70 -72 C) enzyme hoạt động tổng hợp chuỗi DNA mới⁰C) biến tính DNA tách mạch

 Mạch khuôn DNA: tinh sạch

 Ion Mg2+: là một cofactor đảm

bảo enzyme hoạt động

 Mồi: là một đoạn DNA mạch

đơn dài từ 15 – 30 Nu

 Dung dịch đệm: tạo lực ion ổn

định

Quy trình PCR

Kiểm tra sản phẩm

Kiểm tra bằng quá trình điện di và phân tích kết quả của PCR

Định lượng sản phẩm biến đổ gen

- Mục đích: định lượng để dán nhãn sản phẩm

- Định lượng tương đối =

- Đoạn DNA đặc trưng cho GMO nên là vùng tiếp giáp để đảm bảo độ chính xác khi định lượng

- Đoạn DNA đặc trưng cho non – GMO nên từ một gen thiết yếu nào đó hoạt động

ổn định trong mọi điều kiện, có mặt trong mọi giống

•

Phương pháp Real – time PCR

 Real – time PCR: là phản ứng PCR mà quá trình nhân bản DNA được theo dõi trực tiếp trên máy luân nhiệt theo từng chu kì nhiệt

- Hệ thống Real – time : máy luân nhiệt (PCR) nối với máy quang phổ huỳnh quang và máy vi tính

- Cơ chế phát huỳnh quang: sử dụng các phương án phát quang cường độ tỷ lệ thuận với sản phẩm nhân gen để theo dõi: TaqMan Probe; SYBR Green Eva Green, …

- Phát hiện và định lượng nồng độ sản phẩm sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên cường độ phát huỳnh quang

Phương pháp Real – time PCR

- Dựa trên các giá trị Ct ( chu kì

tại đó tín hiệu vượt ngưỡng) =>

tính toán được lượng DNA ban

đầu

Hoặc tính ra tỷ lệ DNA ứng với

GMO/ tổng DNA cùng loại nguyên

liệu

Ưu điểm chung của các phương pháp sử

dụng PCR

• Có thể sử dụng cho định tính => định lượng

• Có thể sử dụng cho sàng lọc GMO => xác định sự kiện cụ thể

• Có thể định lượng tương đối

• Độ nhạy cao

Nhược điểm chung của các phương pháp

sử dụng PCR

• Cần thời gian, kỹ năng

• DNA có thể bị biến đổi, phân giải sau quá trình chế biến sản phẩm

• Phản ứng PCR có thể bị ảnh hưởng từ bên ngoài

• Dễ bị ảnh hưởng của sự nhiễm tạp

• Yêu cầu về trình tự của DNA đích

2.Phương pháp dựa trên protein

• Nguyên tắc:

+ Dựa trên sản phẩm protein biểu hiện của gen chuyển

+ Dựa trên đặc tính kích thước, pH: chạy điện di SDS 1 chiều, 2 chiều để phân tách protein thành các băng riêng biệt, sau đó có thể xác định tiếp bằng các phương pháp khác nhau

+ Nhóm phương pháp sử dụng phản ứng miễn dịch kháng thể ( antibody): ELISA, Sắc kí miễn dịch, lai western blot

a ELISA

• ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật

sinh hóa được dùng chủ yếu trong miễn dịch học nhằm phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu cần phân tích

1 Nguyên lý chung

- Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một enzyme Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một chất có màu Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

Phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng vật chất như peptides, protein, antibodies, hormone,…

a.ELISA

4 Phân loại

⁻ ELISA trực tiếp ( Direct Elisa )

⁻ ELISA gián tiếp ( Indirect Elisa)

⁻ ELISA sandwich ( Sandwich Elisa)

⁻ ELISA cạnh tranh ( Competitive Elisa)

• Được coi là dạng ELISA đơn giản nhất Trong đó, kháng nguyên cần phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể (plate) và sẽ được phát hiện bằng một kháng thể duy nhất (đã được gắn enzyme).

• Phương pháp được ứng dụng trong phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm Ví dụ xác

• Là một dạng Elisa phổ biến trong thực tiễn do có phản ứng nhanh và nhạy Được gọi là

“sanwich” là do kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua sự kết hợp của 2 loại kháng thể là kháng thể bắt và kháng thể phát hiện.

SE

• Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai chất tham gia phản ứng cùng ái lực bắt cặp với chất thứ 3 Phản ứng cạnh tranh lành mạnh (đúng đắn) thì 2 chất cạnh tranh phải được đưa vào đồng thời.

CE

• Cơ chế của pp Sandwich ELISA

a.ELISA

a.ELISA

a.ELISA

Cường độ màu đo được ở quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc kháng nguyên không biết ở trong dung dịch thử nghiệm

Kết quả

b.Phương pháp sắc kí miễn dịch

Nguyên lý: phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu được phân bố đều trên bản giấy sắc ký Kháng nguyên (KN) đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại “vạch phản ứng” Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể (KT) lên bản sắc ký, nếu có kháng thể sẽ kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ lại tại vạch phán ứng

- Nếu trong huyết thanh không có KT đặc hiệu, ở vạch phản ứng KN

không thể giữ được KKT gắn màu nên không hiện màu

Ưu, nhược điểm của phương pháp

Ưu điểm

• Đơn giản, không cần đào tạo

• Chuẩn bị mẫu nhanh, đơn giản

• Mỗi que thử chỉ được 1 phép kiểm tra

• Chỉ phù hợp cho phép thử nhanh, trên các đối tượng chưa qua chế biến

3.Phương pháp DNA Microarray

1 Nguyên lí

• dựa trên cơ sở các đoạn DNA mạch đơn cần nghiên cứu có thể bắt cặp với các mẫu dò có trình tự tương đồng nhau theo nguyên lí Chargaff (A liên kết với T, G liên kết với C) tạo nên các phân tử lai

• Dựa vào kỹ thuật phát hiện huỳnh quang, với các máy quét scanner chuyên dụng

có thể xác định được vị trí của các phân tử lai, từ đó xác định trình tự của các đoạn DNA mạch đơn, hoặc trình tự gen

2 Tiến hành

3.Phương pháp DNA Microarray

Microarray là lam kính thủy tinh có rất nhiều mẫu dò: Các DNA mạch đơn đặc trưng cho GMO

Mẫu thực phẩm kiểm định được tách DNA rồi đánh dấu bằng huỳnh quang

Cho lai với mẫu dò: những cặp đặc hiệu sẽ bắt cặp mạnh mẽ

Rửa lai: những cặp DNA không bắt cặp sẽ bị loại bỏ

Kết quả lai được thể hiện thông qua màu và cường độ màu trên microarray Dùng phần mềm phân tích hình ảnh rồi đưa ra kết quả

3 VÍ DỤ

NHẬN DIỆN SẢN PHẨM CHUYỂN GEN TRONG THỨC ĂN

CHĂN NUÔI BẰNG KỸ THUẬT PCR

1 Vật liệu nghiên cứu

 10 mẫu thức ăn phối trộn, gồm : hạt đậu nành chuyển

gen, hạt đậu nành bình thường, hạt ngô, cám

 Mẫu đối chứng : hạt đậu nành chuyển gen chứa các trình

tự 35S promoter, Nos terminator, gen Bt

STT Hạt đậu nành chuyển

gen (gen Bt, 35S promoter)

Hạt đậu nành thường

Hạt bắp Cám

Tách DNA bằng phương pháp CTAB Điện di DNA

Định tính DNA

Phản ứng PCR được thực hiện theo

từng cặp mồi chuyên biệt

• Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TAE 1X bằng máy điện di OWL A2.

• gel được nhuộm với dung dịch ethidium bromide và chụp hình dưới đèn UV

2 TIẾN HÀNH

Cặp mồi Trình tự Sản phẩm

Nhận diệngen

Lectin F: 5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC A-3’R: 5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TT-3’ 118 bp

Nhận diện gen

Bt F: 5’-GAA CTC TAT TAC TAT CTA TAC CGA CGC TCA-3’

R: 5’-CTA GCG TAT CTC ACT CTA ACT CTA TAC CTG-3’

•Ở các mẫu đậu nành đều cho băng

DNA rõ rệt (kích thước 118 bp) Trong

khi đó hoàn toàn không nhận được sản

phẩm PCR ở mẫu bắp.

• có 8 mẫu (số 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10) cho

sản phẩm với cặp mồi nhận diện gen

Lectin Đây là các mẫu có chứa đậu

nành trong thành phần thức ăn

•Các mẫu cho kết quả âm tính (mẫu số 3

và 8 không thể hiện băng) có thể do

thành phần phối trộn không chứa đậu

nành hoặc thành phần đậu nành phối

trộn rất ít

3 KẾT QỦA

 Nhận diện gen Lectin

- kết quả điện di sản phẩm PCR của cặp mồi nhận

diện 35S promoter cho thấy 8 mẫu (số 1, 2, 4, 5,

6, 7, 9, 10) có chứa 35S promoter

- các mẫu không chứa nguyên liệu đậu nành (mẫu số 3, 8) đều cho kết quả âm tính

- Khi phân tích với cặp mồi nhận diện gen Bt trên 10 mẫu thức

ăn chăn nuôi thương phẩm, trừ mẫu đối chứng mang gen

chuyển Bt (mẫu số 12), tất cả các mẫu thương phẩm khác đều

cho kết quả âm tính (không có băng)

 Nhận diện gen Bt

 Nhận diện gen 35S promoter

- Đối với cặp mồi Nos Terminator,

việc nhận diện trên các mẫu thức

ăn thương phẩm cho thấy có 7/10

mẫu thức ăn (mẫu 1, 2, 4, 5, 6, 9,

10) cho kết quả có Nos terminator

trong thành phần đậu nành

 Nhận diện gen Nos terminator

Phần 2: Truy xuất nguồn gốc thực phẩm biến đổi gen

1 Truy xuất nguồn gốc là gì?

Là khả năng tìm ra nguồn gốc một loại thực phẩm, thức ăn gia súc, động vật sản xuất thực phẩm hoặc một hợp chất muốn bổ sung vào thực phẩm hoặc thức ăn gia súc, thông qua các giai đoạn sản xuất, chế biến và phân phối (ISO 22005:2007)

Tại sao phải truy xuất GMF

Yêu cầu truy xuất nguồn gốc và dán nhãn cho sản phẩm và thức ăn sản xuất từ GMOs theo Quy chế số 1829/2003

Truy xuất nguồn gốc

Dán nhãn

a.Truy xuất nguồn gốc

Nhà sản xuất cần nêu rõ:

- Chỉ số của mỗi thành phần

thực phẩm sản xuất từ GMOs

- Chỉ số của mỗi nguyên liệu

thức ăn hoặc phụ gia được

để cho phép giữ thông tin về

mã sản phẩm và xác nhận về sản phẩm có sinh vật biến đổi gen của người có và người mua trong thời gian 5 năm.

-Thức phẩm được các nhà hàng, khách sạn bán

-Thực phẩm không dóng gói

3.Mức ngưỡng -Áp dụng cho mỗi thành phần hay chỉ cho 3-5 thành phần chính -Mức độ dao động từ 0,9- 5%, ngoại trừ Trung Quốc không có mức ngưỡng.

3 Trình tự truy xuất nguồn gốc

3 Tiến hành truy xuất nguồn gốc

Truy xuât nội bộ Truy xuất ngoài

Truy xuất sản phẩm trong 1 công ty Truy xuất theo chuỗi cung ứng

Bao gồm các liên kết giữa nguyên liệu đầu

vào và thành phẩm Gồm các liên kết về sản phẩm và thông tin vận chuyển giữa các bên tham gia

Ở mỗi công đoạn phải được nhận diện

bằng mã số nhất định Tập trung vào các dữ liệu chuyển đi

Mối liên kết giữa bán thành phẩm và các

nguyên liệu phụ Số nhận diện duy nhất của từng lô và tư liệu hoá chính xác lần là điều cốt lõi

4.Các phương thức truy xuất nguồn gốc

Bằng tần số RFID

• Thẻ RFID thay thế cho các mã vạch trên các sản phẩm có bán tại các siêu thị bán lẻ Thay vì phải đưa thiết bị vào sát mã vạch để quét, RFID cho phép thông tin có thể được truyền qua những khoảng cách nhỏ mà

không cần một tiếp xúc vật lý nào cả.

4.Các phương thức truy xuất nguồn gốc

5.Khó khăn thực hiện truy xuất nguồn gốc GMF ở Việt Nam

• Văn bản pháp lý chưa đầy đủ, thiếu đồng bộ

• Thiếu kiến thức và kinh nghiệm

Phần 3: kết luận

• Thực phẩm biến đổi gen là thực phẩm được tạo thành từ nguyên liệu là sinh vật biến đổi gen

• Có 2 phương pháp chính kiểm định GMO: phân tích AND, phân tích protein

• Truy xuất nguồn gốc giúp truy tìm quá trình hình thành và lưu thông các sản

phẩm

• Hiện nay truy xuất nguồn gốc GMF ở Việt Nam vẫn chưa phát triển

Tài liệu tham khảo

• Bài giảng của PGS.TS Khuất Duy Thanh

• Bài giảng của TS Nguyễn Tiến Thành

• Giáo trình kiểm định và truy xuất nguồn gốc thực phẩm (Nguyễn Thị Minh Tú chủ biên)

• Nguồn internet