Nghiên cứu nồng độ nt probnp của bệnh nhân suy tim mạn tính tại bệnh viện đa khoa tỉnh hải dương từ tháng 4 2015 6 2015

Đôi khi bội nhiễm vi khuẩn kèm theo nấm tai gây viêm ở bề mặt niêm mạc ống tai ngoài tạo nên các khối chứa sợi nấm, rỉ tai xuất tiết nhiều, trong trường hợp nặng có thể chảy mủ ở liên tụ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG

NGUYỄN TIẾN LONG

THỰC TRẠNG NHIỄM NẤM VÀ MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN CỦA BỆNH NHÂN VIÊM ỐNG TAI NGOÀI ĐẾN KHÁM TẠI PHÒNG KHÁM TAI – MŨI – HỌNG BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THẬT Y TẾ HẢI DƯƠNG TỪ 4/2015 – 6/2015

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN XÉT NGHIỆM Y HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TH.S NGUYỄN THỊ THANH HẢI

HẢI DƯƠNG, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi thực hiện Các số liệu và kết quả trình bày trong khóa luận là trung thực, chưa được công bố ở bất kỳ tác giả nào hay ở bất kỳ công trình nào khác

Hải Dương, ngày…tháng…năm…

Sinh viên

Nguyễn Tiến Long

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Thanh Hải, đã tận tâm hướng dẫn trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

để hoàn thành đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới Ban giám hiệu nhà trường, phòng Đào tạo, khoa xét nghiệm trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương, cùng các thầy cô đã nhiệt tình giảng dạy, quan tâm, tạo điều kiện giúp em hoàn thành

đề tài nghiên cứu của mình

Em xin chân thành cảm ơn phòng khám Tai – Mũi – Họng Bệnh viện trường Đại học kỹ thuật y tế Hải Dương đã hướng dẫn và tạo điều kiện

thuận lợi cho em thực hiện đề tài này Đồng thời em xin cảm ơn các bệnh nhân đã đồng ý tham gia và giúp đỡ em thu thập số liệu thuận lợi

Em cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã giúp đỡ, động viên, cổ vũ tinh thần, luôn giúp đỡ em lúc khó khăn để hoàn thành đề tài này

Mặc dù em đã rất cố gắng hoàn thiện đề tài bằng sự nhiệt tình và năng lực của mình, tuy nhiên trong khuôn khổ hạn hẹp về thời gian và còn ít kinh nghiệm về nghề nghiệp chuyên môn nên không thể tránh được những thiếu sót, rất mong thầy cô và bạn bè góp ý để những đề tài sau của chúng tôi được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hải Dương, ngày…tháng…năm…

Sinh viên

Nguyễn Tiến Long

DANH MỤC VIẾT TẮT

AIDS : Acquired Immuno Deficiency Syndrome

(Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải)

HIV : Human Immunodeficiency Virus

(Virus gây suy giảm miễn dịch ở người) VOTN : Viêm ống tai ngoài

TƯ : Trung ương

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giải phẫu và sinh lý ống tai ngoài 3

1.1.1 Giải phẫu ống tai ngoài 3

1.1.2 Sinh lý tai ngoài 5

1.2 Bệnh học nấm ống tai ngoài 6

1.2.1 Đặc điểm chung của nấm gây bệnh ở người 6

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào nấm 6

1.2.3 Đặc điểm cấu trúc và sinh sản của nấm 8

1.2.4 Phân loại nấm và bệnh học nấm 9

1.2.5 Cơ chế gây bệnh của nấm 11

1.2.6 Dịch tễ học 12

1.2.7 Biểu hiện lâm sàng 13

1.2.8 Biến chứng 15

1.2.9 Phòng ngừa viêm tai ngoài 15

1.2.10.Điều trị 16

1.3 Một số đề tài nghiên cứu liên quan 17

1.3.1 Những nghiên cứu tai Việt Nam 17

1.3.2 Những nghiên cứu trên thế giới 17

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân 19

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 19

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 20

2.3.2 Cỡ mẫu 20

2.3.3 Phương tiện nghiên cứu 20

2.3.4 Các nội dung nghiên cứu 20

2.3.5 Kỹ thuật thu thập thông tin 26

2.4 Phương pháp sử lý số liệu 27

2.5 Biện pháp hạn chế sai số 27

2.6 Các biến số nghiên cứu 27

2.7 Đạo đức nghiên cứu 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 29

3.1 Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 29

3.1.1 Tuổi của đối tượng nghiên cứu 29

3.1.2 Giới tính của đối tượng nghiên cứu 29

3.1.3 Nơi ở của đối tượng nghiên cứu 30

3.1.4 Nghề nghiệp của đối tượng nghiên cứu 30

3.2 Tỷ lệ nhiễm nấm của bệnh nhân viêm ống tai ngoài 31

3.3 Một số yếu tố liên quan đến tình trạng viêm ống tai ngoài do nấm 34

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 40

4.1 Một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 40

4.2 Tỷ lệ nhiễm nấm của đối tượng nghiên cứu 41

4.3 Một số yếu tố liên quan đến tình trạng viêm ống tai ngoài do nấm 42

KẾT LUẬN 46

KHUYẾN NGHỊ 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1: Cấu tạo của tai 3

Hình 2 Giải phẫu loa tai và ống tai ngoài 4

Hình 3 Giải phẫu ống tai ngoài 5

Hình 4: Hình ảnh sợi nấm Candida 22

Hình 5: Hình ảnh nấm Aspergillus 22

Hình 6: Ống mầm của tế bào nấm men 25

Hình 7: Khuẩn lạc nấm Aspergillus 25

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Tỷ lệ phát hiện nấm bằng kỹ thuật soi tươi trên bệnh nhân VOTN

do nấm 32

Bảng 3.2 Tỷ lệ phát hiện nấm bằng phương pháp nuôi cấy trên bệnh nhân VOTN do nấm 32

Bảng 3.3 Thành phần các loại nấm phát hiện được ở bệnh nhân VOTN do nấm 33

Bảng 3.4 Tỷ lệ nhiễm nấm của bệnh nhân theo giới 34

Bảng 3.5 Tỷ lệ nhiễm nấm của bệnh nhân theo tuổi 34

Bảng 3.6 Tỷ lệ nhiễm nấm của bệnh nhân theo nơi ở 36

Bảng 3.7 Thói quen vệ sinh tai của bệnh nhân 37

Bảng 3.8 Tiền sử mắc bệnh của bệnh nhân 38

Bảng 3.9 Tiền sử sử dụng thuốc của bệnh nhân 39

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ phân bố nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứu 29

Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ phân bố giới tính của đối tượng nghiên cứu 29

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ phân bố nơi ở của đối tượng nghiên cứu 30

Biểu đồ 3.4 Tỷ lệ phân bố nghề nghiệp của đối tượng nghiên cứu 30

Biểu đồ 3.5 Tỷ lệ viêm ống tai ngoài do nấm 31

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ nhiễm nấm theo nghề nghiệp 35

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thuật ngữ nấm ống tai ngoài được chỉ tình trạng viêm bề mặt niêm mạc ống tai ngoài do nấm, đôi khi tổn thương viêm gây thủng màng nhĩ lan vào tai giữa Bệnh có thể gặp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, hoặc có thể trên nền một tổn thương của tai giữa có thủng màng nhĩ Về dịch tễ học, nấm ống tai ngoài có thể gặp trên toàn thế giới nhưng điều kiện thuận lợi để bệnh phát triển là ở khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới nóng ẩm và điều kiện môi trường có nhiều bụi [10] Biểu hiện của nấm tai có thể cấp, bán cấp hoặc mạn tính và thường biểu hiện với triệu chứng ngứa tai, đau tai, nghe kém và ù tai Đôi khi bội nhiễm vi khuẩn kèm theo nấm tai gây viêm ở bề mặt niêm mạc ống tai ngoài tạo nên các khối chứa sợi nấm, rỉ tai xuất tiết nhiều, trong trường hợp nặng có thể chảy mủ ở liên tục từ ổ viêm Những trường hợp nhiễm nấm nặng thường kèm theo rách màng nhĩ, viêm tai giữa hoặc toàn bộ xương thái dương, những trường hợp này thường gặp ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch Các yếu tố liên quan đến nhiễm nấm tai bao gồm: sử dụng kháng sinh phổ rộng kéo dài, chấn thương, chảy tai kéo dài, bơi lội ở nguồn nước ô nhiễm và thói quen lấy dáy tai với dụng cụ không sạch [14]

Có nhiều chủng nấm gây bệnh ở tai: thường gặp nhất là nấm

Aspegillus, Candida và Mucor Những loại nấm khác ít gặp hơn gồm Penicillium, Rhizopus [13] Nghiên cứu tại Nigeria năm 2001 trên 142 bệnh nhân bị nấm ống tai ngoài có chủng nấm Aspergillus (63,2%), Candida (35,5%), Mucor (0,7%) trong đó Chủng nấm Candida gồm: Candida albicans (18,4%), Candida tropicalis (10,5%), Candida pseudotropicalis (6,6%) Chủng nấm Aspegillus gồm: A fumigatus (39,5%), A.niger (23,7%) Bệnh

nhân gặp ở nhiều lứa tuổi tuy nhiên khoảng 79% trên 21 tuổi, 9% bệnh nhân nhiễm nấm hai tai, 38% nhiễm nấm ống tai ngoài trái, 53% nhiễm nấm tai phải [16] Ở Việt Nam, một nghiên cứu của bệnh viện Việt Nam - Cu Ba năm

2007 thấy có hai chủng nấm là Aspegillus và Candida với tỷ lệ gặp 62,8% và

2

37,2% [2]

Nhiễm nấm ống tai ngoài khá phổ biến ở nước ta do đặc điểm khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là môi trường lý tưởng cho nấm phát triển Trên thế giới các nghiên cứu về nấm ống tai ngoài không nhiều, chỉ thấy một số nghiên cứu

ở châu Phi và châu Mỹ La tinh Nghiên cứu về nấm tai ở nước ta cũng chưa nhiều mặc dù loại bệnh này thường gặp Do đó chúng tôi tiến hành nghiên

cứu đề tài: “Thực trạng nhiễm nấm và một số yếu tố liên quan của bệnh nhân viêm ống tai ngoài đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương từ 4/2015 – 6/2015” với 2 mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ nhiễm nấm của bệnh nhân viêm ống tai ngoài đến khám tại phòng khám Tai – Mũi – Họng bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương từ tháng 4/2015 – 6/2015

2 Mô tả một số yếu tố liên quan đến tình trạng viêm ống tai ngoài của bệnh nhân đến khám tại phòng khám Tai – Mũi - Họng Bệnh viện trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương từ tháng 4/2015 – 6/2015

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giải phẫu và sinh lý ống tai ngoài

1.1.1 Giải phẫu ống tai ngoài

Tai ngoài là một trong ba thành phần giải phẫu của tai cùng với tai giữa

và tai trong Tai ngoài ngăn cách với tai giữa qua màng nhĩ Về mặt phôi thai học, tai ngoài và tai giữa xuất phát từ khe mang thứ nhất rãnh trong của khe mang sinh ra hòm nhĩ và vòi Eustache, rãnh ngoài của khe mang sinh ra ống tai ngoài và vành tai Màng nhĩ hình thành do sự hàn dính của đáy rãnh trong

và rãnh ngoài Mê nhĩ được phát triển từ túi thính giác tức là một bộ phận thoát vị của trục thần kinh phôi thai Cuống của túi này sẽ trở thành dây thần kinh số VIII [1]

Hình 1: Cấu tạo của tai

Tai ngoài gồm có vành tai và ống tai ngoài:

Vành tai: Vành tai là một cái loa bằng sụn, ngoài có da bao bọc Vành

tai có những chỗ lồi và chỗ lõm Những chỗ lồi, tính từ chu vi về trung tâm, là: luân nhĩ (hélix), gờ đối luân (anthélix), đôi bình tai (antitragus) và bình tai hay nắp tai (tragus) Những chỗ lõm là hố thuyền (fossette Naviculaire), rãnh luân nhĩ (scapha), loa tai (conque) và cửa tai (méal) Phần dưới của vành tai không có sụn; chỉ có da và mỡ, được gọi là dái tai (lobule) (hình 2)

4

Hình 2 Giải phẫu loa tai và ống tai ngoài [5]

Ống tai ngoài: Ống tai ngoài là một cái ống tịt bắt đầu từ lỗ tai và tận

cùng ở màng nhĩ Ống này gồm có hai đoạn: đoạn ngoài bằng sụn, đoạn trong bằng xương Trong tư thế bình thường giữa đoạn sụn và đoạn xương có một cái khuỷu hơi cong hướng xuống dưới và ra trước Thiết diện ngang của ống tai hình bầu dục, dẹp theo chiều trước sau tạo thành hình phễu, qua đó sóng

âm đi qua ống tai ngoài sẽ được khuếch đại trước khi đập vào màng nhĩ Các liên quan của ống tai ngoài: Thành trước liên quan với khớp thái dương hàm Thành sau liên quan với đường dây thần kinh số VII và với xương chũm Thành trên với hố não giữa Thành dưới với tuyến mang tai Do những mối liên quan đó nên tổn thương viêm ống tai ngoài ảnh hưởng đến chức năng nhai, hoặc ảnh hưởng của tuyến mang tai đối với ống tai khi tuyến này bị viêm [1]

5

Hình 3 Giải phẫu ống tai ngoài [5]

1 Phần xương; 2 Phần sụn của ống tai ngoài 3 Loa tai;

4 Tuyến nước bọt mang tai; 5 Hố thái dương

1.1.2 Sinh lý tai ngoài

Tai có hai chức năng nghe và thăng bằng, trong đó chức năng thăng bằng thuộc các cơ quan của tai trong Tai ngoài liên quan trực tiếp đến chức năng nghe [8]

Sinh lý truyền âm:

 Tai ngoài: Vành tai thu và định h ớng sóng âm, ống tai truyền sóng âm

tới màng tai

 Tai giữa: Dẫn truyền và khuyếch đại c ường độ âm thanh (vòi nhĩ, màng nhĩ, chuỗi xương con)

Sinh lý tiếp âm

 Điện thế liên tục: Do có sự khác biệt về thành phần của Na+ và K+ trong nội và ngoại dịch

 Điện thế hoạt động: Do sự di chuyển của nội dịch, sự rung động của các tế bào lông

 Luồng thần kinh: Luồng thần kinh tập hợp các điện thế chuyển theo dây VIII lên vỏ não

6

1.2 Bệnh học nấm ống tai ngoài

1.2.1 Đặc điểm chung của nấm gây bệnh ở người

Nấm thuộc về giới thực vật, có cấu tạo đơn bào hoặc đa bào, không có chất diệp lục nên cần sống trên các chất huỷ hoại của các sinh vật khác., chiếm chất dinh dưỡng của sinh vật đó Nấm có đặc điểm chung sau:

- Phát triển không cần ánh sáng mặt trời nên nấm có thể sống ở mọi nơi, mọi chỗ Trong thiên nhiên nấm có ở khắp nơi và trong cơ thể vật chủ nấm có thể xâm nhập vào tất cả các cơ quan, các mô ở sâu trong cơ thể

- Để phát triển nấm cần hai điều kiện rất quan trọng không thể thiếu không thể tách rời nhau là nhiệt độ và độ ẩm thích hợp

- Nấm dễ dàng phát triển trong mọi môi trường ngay cả môi trường rất nghèo dinh dưỡng, vì vậy vấn đề phòng chống nấm rất khó khăn

- Nấm có thể sinh sản nhanh, nhiều và dễ dàng vì chỉ cần một phần tử sinh sản là bào tử nấm có thể phát triển thành một quần thể rất nhiều nấm gọi

là khóm nấm (colonie), vì vậy phải điều trị triệt để tận gốc để loại trừ các bào

tử nấm còn sót lại

- Nấm có khả năng gây rất nhiều bệnh tật cho người và động vật Đặc biệt với người, nấm có thể gây nhiều bệnh nguy hiểm khó điều trị, có thể xâm nhập vào tất cả các cơ quan, các mô bên trong cơ thể [3, 6]

1.2.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào nấm

Một số loại nấm có cấu tạo đơn bào (nấm men), nhưng phần đông các chủng nấm có cấu tạo đa bào (nấm sợi) Nấm dạng sợi có những vách ngăn chia bào tương thành từng ngăn hay đốt, có loại nấm có sợi nhưng không chia đốt Trong mỗi ngăn có một hay nhiều nhân

Về phương diện sinh lý học, chúng là cộng bào (coenocyte) vì các vách ngăn đều có lỗ thông đủ rộng để không chỉ nguyên sinh chất mà còn cho cả nhân có thể di chuyển qua suốt trong lòng sợi nấm.Tế bào nấm có rất nhiều điểm giống tế bào của sinh vật bậc cao Chúng có kích thước thay đổi từ một

7

vài μm tới hàng trăm μm tuỳ thuộc vào từng chủng nấm hoặc môi trường thay đổi khác nhau

Đặc điểm nổi bật của tế bào nấm là có vỏ (màng) rất dày, bên trong vỏ

là nguyên sinh chất, bào tương Mỗi tế bào nấm chứa một hoặc nhiều nhân Trong tế bào nấm còn có nguyên sinh chất, mạng lưới nội chất, các kho dự trữ (không bào), ty thể và một số yếu tố khác

Vỏ tế bào nấm là màng bảo vệ dày và rất chắc, được cấu tạo chủ yếu bằng chitin (bản chất là polysarcharid được cấu tạo từ các phân tử N.acetyl-glucosamine nhờ các liên kết β-osid) hoặc glycan (chất trùng hợp mạch nhánh của glucoapyranoza) Các enzym ở người không có khả năng thuỷ phân các liên kết này Do đó với những vật chủ khi bị nấm xâm nhập và gây bệnh, quá trình thực bào gặp nhiều khó khăn

Màng nguyên sinh chất: ở ngay dưới lớp vỏ, ngăn cách giữa màng tế bào và nguyên sinh chất, cấu tạo chủ yếu bởi các phân tử lipid và protein Màng này thường tách khỏi tế bào ở vài chỗ, nếu có chứa các chất dạng bọng gọi là Lomasom, có liên quan tới sự tạo thành tế bào của sợi nấm

Nguyên sinh chất (bào tương): là một chất lỏng nhớt, có các thành phần chủ yếu là protein, ribonucleoprotein, lipid, glucid và nước Ở tế bào nấm còn non thì bào tương tương đối thuần nhất, nhưng nếu tế bào càng già thì càng có nhiều không bào dự trữ

Ty thể: khác với vi khuẩn, tế bào nấm có ty thể giống như ở tế bào sinh vật bậc cao, đó là cơ quan sinh năng lượng của tế bào Ty thể cấu tạo bởi hai lớp màng, cấu trúc của hai lớp màng này giống như cấu trúc màng nguyên sinh chất Trên mặt màng có những hạt nhỏ hình cầu (oxyxom) Các hạt này thực hiện chức năng sinh năng lượng (tổng hợp ATP) và giải phóng năng lượng cung cấp cho các hoạt động sống của tế bào, ty thể còn tham gia vào các quá trình tổng hợp protein, phospholipid, một số enzym

8

Nhân: nhân của tế bào nấm là nhân điển hình tương tự như nhân tế bào của động vật có vú, gồm có màng nhân,bên trong là chất dịch nhân có chứa hạch nhân Nhân tế bào hình cầu hoặc hình bầu dục, đặc Số lượng nhân là một đối với nấm men, nhưng ở những tế bào lớn thường có nhiều nhân như các loại nấm sợi Ngoài thành phần DNA, nhân của tế bào còn có protein và nhiều loại enzym khác Trong hạch nhân của tế bào nấm không chỉ gồm có DNA như ở vi khuẩn) mà nó đã được tổ chức thành nhiễm sắc thể điển hình

và có quá trình phân bào nguyên nhiễm (mitosis) Số lượng nhiễm sắc thể trong tế bào khác nhau tuỳ thuộc từng loại nấm

Những yếu tố còn lại bên trong tế bào (không bào và các thể ẩn nhập khác) chứa các chất như lipid, protein, glucid, enzym, muối vô cơ, các chất điện phân và chất hữu cơ hoà tan

Phần lớn các chủng nấm khi nuôi cấy sẽ phát triển thành các quần thể nấm được gọi là khóm nấm (có tác giả gọi là khúm nấm hay vè nấm) Mỗi khóm nấm thường có đặc tính riêng và dựa vào đó người ta phân biệt các chủng nấm với nhau Trong mỗi khóm nấm có các sợi nấm ăn sâu trong môi trường nuôi cấy để hút chất dinh dưỡng, gọi là thân nấm dinh dưỡng, có những sợi nấm bò lan trên

bề mặt để sinh ra các bộ phận sinh sản, gọi là thân nấm phát triển Thân nấm có thể hình thành các cơ quan sinh sản hữu tính hay vô tính, chính nhờ hình thái các

cơ quan này để định loại các giống nấm [3, 5]

1.2.3 Đặc điểm cấu trúc và sinh sản của nấm

Nhìn chung gồm hai bộ phận: bộ phận dinh dưỡng và bộ phận sinh sản

1.1.1.1 Bộ phận dinh dưỡng của nấm

Có thể là sợi nấm đối với nấm sợi hoặc là tế bào nấm đối với nấm men Sợi nấm chia nhánh chằng chịt, ken với nhau thành từng khóm nấm Nấm men cũng ken với nhau thành một khóm nấm Sợi nấm có thể rất mảnh, chiều ngang không dày quá 1 μm đặc và bắt màu đều như lớp Actinomycetes; hoặc

 Phương thức sinh sản hữu tính:

Là sự phân chia có sự phối hợp nhân gồm các loại bào tử hữu tính như

là bào tử nang (ascospore), bào tử tiếp hợp (zygospore), bào tử noãn (oospore), bào tử đảm (basidiospore)

 Phương thức sinh sản vô tính:

- Là sự phân chia không có sự phối hợp nhân, đó là các loại bào tử vô tính, thường do sợi nấm sinh ra, làm nhiệm vụ phát triển hoặc dự trữ Cũng có khi một bào tử làm cả hai nhiệm vụ trên

- Bào tử dự trữ thường có bào tương đặc và giầu chất dinh dưỡng Bào

tử dự trữ gồm: bào tử màng dày, bào tử phấn, bào tử hình thoi

- Bào tử phát triển có hai loại:

+ Sinh ra chính từ thân nấm (thalic) gồm các bào tử mầm (blastoconidium), bào tử đốt (arthroconidium), bào tử phấn (aleurioconidium)

Là bào tử dự trữ nhưng cũng có khi làm nhiệm vụ phát triển

+ Sinh từ một thân nấm thành những tế bào riêng nhưng vẫn dính liền với thân nấm gọi là bào tử dính (conidium) Bào tử loại này cũng khác nhau nhiều về kích thước, hình dạng và màu sắc, chúng có thể tạo thành khối hoặc chuỗi có hình chai, hình chổi hoặc hình hoa cúc [6]

1.2.4 Phân loại nấm và bệnh học nấm

1.1.1.3 Phân loại nấm

Nấm được biết đến có hàng ngàn loài, trong đó có hàng trăm loài có thể gây bệnh, nấm gây bệnh là các vi nấm

10

Vi nấm gây bệnh được chia ra làm hai loại chính là nấm sợi (mould) và nấm men (yeast), cũng có một số loại nấm lưỡng hình (dimorphic) là nấm men gây bệnh ở người và nấm sợi trong môi trường nuôi cấy

Các nấm gây bệnh được chia theo lớp, bộ, họ, giống và chủng Hiện nay được chia ra 5 lớp, có rất nhiều bộ, họ, giống và chủng

Nấm tồn tại trong tự nhiên ở khắp nơi trên thế giới và hầu hết mọi người đều tiếp xúc với chúng Xảy ra nhiễm nấm thường phụ thuộc vào số lượng bào tử nấm bị nhiễm và sức đề kháng của cơ thể vật chủ

Tỷ lệ nhiễm nấm gần đây tăng lên nhanh chóng do sự gia tăng tỷ lệ các đối tượng cảm thụ bệnh, như bệnh nhân bị suy giảm miễn dịch HIV/AIDS, bệnh nhân điều trị các thuốc ức chế miễn dịch, điều trị kháng sinh phổ rộng, corticoid kéo dài, sử dụng những thủ thuật chẩn đoán xâm lấn và điều trị ngoại khoa (prosthetic implanr) cấy ghép tạng

11

Nhiễm nấm kinh điển được chia làm hai loại:

- Nhiễm nấm sâu (deep mycoses) nấm xâm nhập vào các mô của cơ thể như các loại nấm nội tạng, nấm tim, nấm não, nhiễm nấm máu

- Nhiễm nấm nông (superficial mycoses) gồm các loại nấm da và niêm mạc Nhiễm nấm niêm mạc là những tổn thương do nấm gây ra ở các vùng niêm mạc trong cơ thể Có thể do căn nguyên nội sinh, thường là nấm Candida sống hoại sinh trên đường tiêu hoá và âm đạo, do sức đề kháng cơ thể giảm sút hoặc thay đổi điều kiện sống tại chỗ ( mất cân bằng vi khuẩn chí)

mà trở nên gây bệnh ở các vùng này Có thể do căn nguyên ngoại sinh do hít phải các bào tử nấm trong không khí hoặc do ăn phải các thức ăn có nhiễm nấm, thường hay gặp các bệnh nấm đường hô hấp như nấm phổi, nấm xoang, nấm mũi, nấm tai, nấm họng…

1.2.5 Cơ chế gây bệnh của nấm

Bệnh nấm hiếm khi gặp ở người khoẻ mạnh, hầu hết các loại nấm thường sống hoại sinh và phát triển trên thực vật hoặc trong đất mà ít khi thích ứng trên cơ thể người Cơ chế đề kháng của cơ thể vật chủ đóng vai trò sống còn trong việc bảo vệ các cơ quan của cơ thể chống lại sự xâm nhập của nấm Khi xâm nhập vào cơ thể, nấm gây ra một sự thách thức với hệ thống miễn dịch cơ thể vật chủ Một quá trỉnh điển hình như sau: Khi một bào tử nấm bị nhiễm vào cơ thể, ở trạng thái nghỉ không có hoạt động chuyển hoá trong cơ thể vật chủ, sau đó bào tử nảy mầm lớn lên, dinh ra thể sợi xâm nhập vào mô Sợi nấm, bào tử, bào tử đính hoặc tế bào nấm men mỗi loại có một đặc trung kháng nguyên khác nhau và mỗi lại được cơ thể vật chủ xác định một kiểu đáp ứng miễn dịch khác nhau

Vi nấm là một loại vi sinh phát triển nhanh và thường quá lớn nên tế bào cơ thể vật chủ khó có thể nuốt được, do đó cơ chế đề kháng ngoài tế bào đóng vai trò quan trọng Mỗi giống nấm gây bệnh hay mỗi chủng của cùng một giống nấm sẽ dẫn đến một cơ chế miễn dịch khác nhau Hai hàng rào sinh

12

lý chủ yếu đối với sự phát triển của nấm trong cơ thể người là nhiệt độ và khả năng oxy hoá khử Hầu hết các loại vi nấm không có khả năng phát triển ở

nhiệt độ 37°C Tương tự hầu hết các vi nấm có khả năng oxy hoá khử ở chất

nền không sống hiệu quả hơn là ở các tổ chức sống Bình thường cơ thể người

có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập và gây bệnh của nấm nhờ vào:

- Khả năng đề kháng nấm không đặc hiệu bao gồm:

 Tính kháng nấm tự nhiên của các dịch tiết bề mặt như nước bọt và

mồ hôi

 Hiệu lực bảo vệ của các chất nội tiết (thuộc hệ thực vật) của da và niêm mạc trong việc cạnh tranh không gian và chất dinh dưỡng, do đó giới hạn được khả năng gây bệnh của nấm

 Da và niêm mạc đóng vai trò như một hàng rào cơ học để phòng ngừa sự xâm nhập của nấm

- Trong cơ thể người cũng có hàng loạt tế bào phòng ngự hoạt động với hiệu quả cao để chống lại sự tăng sinh của nấm

 Hệ thống viêm không đặc hiệu là sự chống đỡ đầu tiên của người chưa được miễn dịch Hoạt động viêm này nhờ vào bạch cầu đa nhân trung tính, thực bào đơn nhân và các bạch cầu hạt khác

 Miễn dịch đặc hiệu: bao gồm trước hết là miễn dịch trung gian tế bào được điều chỉnh bởi tế bào lympho T Nhưng miễn dịch trung giân tế bào chỉ xuất hiện sau khi cơ thể đã có sự tiếp xúc đáng kể với nấm

Do đó cơ chế cơ bản của bệnh sinh nấm là:

- Khả năng thích ứng của nấm đối với môi trường và tổ chức của vật chủ

- Sức chịu đựng của nấm chống lại hoạt động phân giải của hệ thống

đề kháng của vật chủ

1.2.6 Dịch tễ học

Bệnh lý nấm ống tai ngoài có thể thấy ở tất cả các nước trên thế giới

13

nhưng thường gặp ở khu vực nhiệt đới, cận nhiệt đới nóng ẩm [6]

Các chủng loại nấm: chủng nấm thường gặp nhất là Aspergillus, đặc biệt là Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans và Aspergillus flavus Nấm Candida là chủng nấm thứ hai đứng sau Aspergillus thường gặp họ nấm Candida albicans, Candida parapsillosis và Candida tropicalis Các loại nấm khác ít gặp hơn gồm Penicillium và Rhizopus Nhiễm

vi khuẩn phối hợp với nấm thường gặp trong khoảng 50% số trường hợp viêm ống tai ngoài do nấm

Môi trường sống của các loại nấm tai có thể trong không khí cả trong nhà lẫn ngoài trời, trong đất và bụi ở nhiều điều kiện khí hậu khác nhau nhưng môi trường nấm dễ phát triển hơn cả là độ ẩm cao và nhiệt độ ấm Với điều kiện đó thì ống tai ngoài là môi trường lý tưởng để nấm phát triển Ở những nước nhiệt đới, nấm thấy ở ống tai ngoài trong 30% bệnh nhân bị bệnh

về tai trong khi con số này ở những nước ôn đới thấp hơn nhiều, khoảng 9% các bệnh nhân bệnh tai ở Anh [9]

Nấm ống tai ngoài thường phát triển ở những cá nhân có bệnh lý về da của ống tai ngoài trước đó như viêm da, bệnh vảy nến Bội nhiễm vi khuẩn cũng thường gặp trong các trường hợp này Sử dụng kháng sinh và thuốc chống viêm kéo dài cũng là một yếu tố nguy cơ nhiễm nấm tai Tỷ lệ nhiễm nấm ống tai ngoài ở trẻ tăng lên ở nhóm trẻ sử dụng kháng sinh quinolone mới (fluoroquinolone) để điều trị viêm tai giữa hoặc tai ngoài cấp

1.2.7 Biểu hiện lâm sàng

Biểu hiện đầu tiên của nấm ống tai ngoài là cảm giác ngứa trong ống tai, ngứa tăng dần Sau đó bệnh nhân bắt đầu thấy đau tai, cảm giác đầy tức trong tai Triệu chứng ban đầu của nhiễm khuẩn và nấm thường khó phân biệt

vì cả hai loại đều có triệu chứng tiết dịch và đau Tiếp theo đó có thể xuất hiện nghe kém, cảm giác căng ở tai và ù tai Hơn 90% các trường hợp viêm ống tai ngoài do nấm biểu hiện ở một bên

14

Ngày nay nhờ có phương tiện nội soi với độ phóng đại lên tới 40 lần chúng ta dễ dàng phát hiện được các loại nấm theo từng tổn thương và hình thể của chúng có ba dạng tổn thương thường gặp là:

- Với nấm Aspergilus: cho thấy hình ảnh khối nấm màu đen, màu nâu

với các sợi nấm dài có đầu như một nụ hoa

- Với nấm Mucoracae: cho thấy hình ảnh khối nấm màu nâu, các sợi

nấm không dài mà như hình ảnh các sợi bông quấn vào nhau

- Với nấm Candida Albicans: thấy tổn thương dạng vẩy màu trắng

thành các mảng do thoái hóa biểu bì ống tai tạo thành

Nếu nhiễm nấm A niger có thể thấy được mảng tổn thương có chứa

bào tử nấm màu đen Những mảng này lát ở bề mặt ống tai đôi khi bít tắc ống tai ngoài tạo thành hình ảnh giống nút giấy thấm màu xám bít tắc ống tai ngoài Nấm ống tai ít gây biến chứng nhưng nếu xảy ra thường là viêm tai giữa nặng, rách màng nhĩ

Ở trẻ nhỏ viêm ống tai có thể điều trị hết các triệu chứng nhờ kháng sinh thông thường trong hầu hết các trường hợp, tuy nhiên nếu triệu chứng chảy dịch tai còn dai dẳng sau khi điều trị kháng sinh phải nghĩ đến viêm tai

do nấm

Ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch, bệnh lý về máu hoặc bệnh nhân HIV giai đoạn cuối, nhiễm nấm ống tai ngoài có thể tiến triển thành viêm hoại tử ống tai ngoài Bệnh nhân thường thấy đau, xuất hiện những vết loét và hồng ban bề mặt niêm mạc ống tai cùng với chảy máu và dịch Tình trạng viêm có thể lan vào tai giữa và xương chũm Màng nhĩ thường dày lên và xuất hiện những chấm hoại tử

15

1.2.8 Biến chứng

Đa số những trường hợp viêm tai ngoài sẽ thuyên giảm với chữa trị, thỉnh thoảng có trường hợp bệnh nặng hơn, gây biến chứng khiến da chung quanh tai cũng bị nhiễm trùng lây (periauricular cellulitis), hoặc gây viêm tai ngoài ác tính (necrotizing or malignant otitis externa)

Viêm tai ngoài ác tính là một tình trạng nguy hiểm, đe dọa mạng sống,

do nhiễm trùng từ tai lan ra xương "mastoid" đằng sau tai, xương "temporal" phía trước, hoặc xương sàn sọ bên trong Viêm tai ngoài ác tính hay do vi

trùng P.aeruginosa, thường tấn công những vị cao tuổi mang bệnh tiểu

đường, và người có sức đề kháng cơ thể suy giảm vì bệnh (như bệnh AIDS) hoặc thuốc dùng (thuốc Prednisone, thuốc chống ung thư, …)

Viêm tai ngoài ác tính khó chữa, gây tử vong cao Ta nên nghi ngờ tình trạng này khi đã dùng thuốc nhỏ tai đúng để chữa, tai vẫn đau dữ quá và tiếp tục chảy mủ, lúc khám thì lại không thấy trong tai có gì nặng cho lắm, hoặc khám thấy có mô hạt (granulation tissue) xuất hiện trong lòng ống tai

1.2.9 Phòng ngừa viêm tai ngoài

Viêm tai ngoài, xảy ra một lần đã khổ, nếu cứ tái phát, thực phiền vô cùng, có khi còn nguy hiểm Việc phòng ngừa để tránh tái phát rất cần thiết cho những người có ráy tai dẻo đặc, có ống tai nhỏ hẹp, nhất là ở những người

có sức đề kháng cơ thể suy giảm Phòng ngừa cũng quan trọng cho người chảy mồ hôi nhiều, hoặc người lấy bơi lội làm thú vui, lẽ sống

Sau khi tắm hay bơi, nên dùng máy sấy tóc thổi nhẹ để nếu nước vào tai sẽ mau khô (dùng độ thổi nhẹ nhất của máy) Sau đó, nhỏ vào tai thuốc có chứa chất acid, chẳng hạn như Star-Otic Bạn tránh dùng que đầu quấn bông gòn (Q-tip) cố ngoáy lau ống tai; làm vậy dễ gây tổn thương cho lòng ống tai, đồng thời đẩy sâu vào trong các mảnh ráy đang di chuyển dần từ trong ra ngoài (theo lộ trình bình thường của chúng để được tống xuất khỏi tai) Bạn

Trước lúc súc rửa, nhắm thấy ráy có vẻ khô đặc, khó lấy, ta dùng thuốc tan ráy như Cerumenex, hoặc nước baking soda 4% cũng được, nhỏ vào tai, giúp ráy mềm đi dễ lấy hơn

Với những người thích bơi lội, tốt nhất, nên đội một mũ bơi hoặc mang

đồ bịt tai vừa vặn để che và bảo vệ tai Dụng cụ chống nước dùng nhét vào tai tạm được, song nên nhớ, dụng cụ này cũng có thể kích thích lòng ống tai khiến nhiễm trùng dễ xảy ra

Người đang viêm tai ngoài cấp tính, trong lúc chữa trị, nên tránh bơi lội

ít nhất 7 đến 10 ngày, mặc dầu cũng có bác sĩ để các vận động viên bơi lội được bơi trở lại sớm, sau 2-3 ngày trị liệu, khi đã hết đau

1.2.10 Điều trị

Nói chung, hầu hết bệnh nhân nấm ống tai ngoài đáp ứng với điều trị Tất cả các bệnh nhân đều được điều trị gồm điều trị tại chỗ làm thuốc tai dưới nội soi trong 5-7 ngày: loại bỏ bào tử nấm, rửa tai bằng dung dịch Betadin, lấy bỏ tổn thương, sau đó dùng thuốc kháng sinh chống nấm tại chỗ ketoconazol (nizoral) Hầu hết bệnh nhân đáp ứng với một liều thuốc kem chống nấm ketoconazole trong vòng dưới 2 tuần

Liều điều trị thứ hai dùng đến khi còn nhiễm nấm Các thuốc khác có thể dùng chống nấm như nhóm Azol (Imidazol và Triazol ), Imidazol và Triazol đều thuộc nhóm azol chống nấm, có cùng cơ chế và cùng phổ tác

17

dụng, tuy nhiên Triazol dùng đường toàn thân chậm bị chuyển hoá và ít tác dụng tổng hợp steroid của người hỏn Imidazol

Sporal 100mg x 2v/ ngày x 5-7 ngày

Hoặc Nizoral 200mg x 2v/ngày x 5-7 ngày

Có thể phối hợp với kháng sinh, giảm viêm, giảm phù nề, vitamin nhóm B, C

Tuy nhiên có nhiều dạng tổn thương mạn tính hoặc do cơ địa của bệnh nhân do tác dụng của nấm và các bội nhiễm khác gây thành dạng sừng hóa hoặc ezema sẽ rất khó điều trị, những bệnh nhân này phải kiên trì điều trị cả đường toàn thân và tại chỗ bằng các thuốc kháng sinh và chống nấm, thậm chí kết hợp cả corticoid dạng bôi tại chỗ

1.3 Một số đề tài nghiên cứu liên quan

1.3.1 Những nghiên cứu tạii Việt Nam

Nghiên cứu của Chử Ngọc Bình tại cơ sở y tế bệnh viện Việt Nam - Cu

Ba năm 2007 thấy có hai chủng nấm là Aspegillus và Candida với tỷ lệ gặp

62,8% và 37,2% [2]

Nguyễn Tiến Hải nghiên cứu trên 50 bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng nghi nhiễm nấm tai và có kết quả soi tươi hoặc cấy nấm dương tính tại bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương kết quả cho thấy 88% bệnh nhân nhiễm

chủng nấm Aspergillus, trong đó bệnh nhân nhiễm nấm Aspergiluss Terreus chiếm 48%, bệnh nhân nhiễm nấm Aspergillus Niger chiếm 34%, bệnh nhân nhiễm nấm Aspergillus Flavus chiếm 4%, bệnh nhân nhiễm nấm Aspergillus Fumigatus chiếm 2%, bệnh nhân nhiễm nấm Aspergillus Menagrophyte chiếm 2% và bệnh nhân nhiễm chủng nấm Candida chiếm 8% trong đó bệnh nhân nhiễm nấm Candida albican chiếm 100% [4]

1.3.2 Những nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu của Hueso Gutierrez, P et al (2005) cho thấy triệu chứng nấm tai rất đa dạng, có thể phối hợp nhiều triệu chứng như là ngứa tai, đau tai,

18

ù tai, cảm giác đầy tai, chảy tai, nghe kém; trong đó ngứa tai bao giờ cũng

biểu hiện và chủng nấm hay gặp nhiều nhất là Aspergillus trong đó Aspergillus Niger gặp chủ yếu ngoài ra các chủng khác ít gặp như Cryptococcus, Fusarium…[22]

Nghiên cứu tại Nigeria năm 2001 trên 142 bệnh nhân bị nấm ống tai

ngoài có chủng nấm Aspergillus (63,2%), Candida (35,5%), Mucor (0,7%) trong đó Chủng nấm Candida gồm: Candida albicans (18,4%), Candida tropicalis (10,5%), Candida pseudotropicalis (6,6%) Chủng nấm Aspergillus gồm: A fumigatus (39,5%), A.niger (23,7%) Bệnh nhân gặp ở nhiều lứa tuổi

tuy nhiên khoảng 79% trên 21 tuổi, 9% bệnh nhân nhiễm nấm hai tai, 38% nhiễm nấm ống tai ngoài trái, 53% nhiễm nấm tai phải [16]

19

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

105 bệnh nhân vào khám và điều trị tại phòng khám Tai Mũi Họng Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương được chẩn đoán là viêm ống tai ngoài từ 4/2015 – 6/2015

* Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm ống tai ngoài: Chẩn đoán viêm ống tai

ngoài dựa vào các triệu chứng lâm sàng và kết quả nội soi

- Lâm sàng: Có những triệu chứng như cảm giác ngứa trong ống tai, ngứa tăng dần Sau đó bắt đầu thấy đau tai, cảm giác đầy tức trong tai Tiếp theo đó có thể xuất hiện nghe kém, cảm giác căng ở tai và ù tai

- Nội soi: Kết quả nội soi có thể có giả mạc, chảy mủ hoặc viêm nề, màng nhĩ có thể có những lỗ thủng nhỏ khoặc không có tổn thương

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân

 Bệnh nhân được chẩn đoán là viêm ống tai ngoài tại phòng khám Tai – Mũi – Họng Bệnh viện trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương

 Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

 Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

 Các bệnh nhân dùng kháng sinh chống nấm trong thời gian hai tuần

20

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu ngang cắt ngang có phân tích

2.3.2 Cỡ mẫu

Toàn bộ bệnh nhân đến khám tại khoa Tai – Mũi – Họng Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương được chẩn đoán là viêm ống tai ngoài, từ 4/2015 – 6/2015

2.3.3 Phương tiện nghiên cứu

- Thói quen vệ sinh tai

- Tiền sử mắc bệnh : viêm tai giữa chảy mủ, nấm ống tai ngoài cùng bên…

- Tiền sử sử dụng thuốc

2.2.4.2 Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm

Trong công tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ và không khí xung quanh ở nơi làm xét nghiệm, vì trong không khí các bào tử và

+ Hóa chất: Dung dịch KOH 10-20%

+ Bệnh phẩm: Chọn tổn thương điển hình để lấy bệnh phẩm trong ống

vô khuẩn

+ Quy trình kỹ thuật:

 Bước 1: Đánh dấu tiêu bản

 Bước 2: Lấy một ít bệnh phẩm lên lam kính

 Bước 3: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 10 – 20% lên bệnh phẩm, đậy lamen hơ lam kính trên đèn cồn cho nóng, chú ý không để dung dịch KOH không bị sôi, hay có thể để bệnh phẩm trong nhiệt độ phòng từ 2-4 giờ

 Bước 4: Soi dưới kính hiển vi quang học với vật kính 10x, 40x

- Nhận định kết quả:

+ Nếu là nấm Candida trên vi trường soi trực tiếp sẽ thấy: Các tế bào nấm men nhỏ kích thước từ 2-4 μm hình trái xoan, có thể có chồi, thành mỏng Có thể thấy các sợi nấm, các sợi nấm có độ dài khác nhau, đầu tận cùng tròn đường kính khoảng 3-5 μm Các sợi nấm có khoảng 1-2 đốt, ở chỗ nối giữa hai đốt có thể thấy một vài chồi Cũng có khi thấy một đám tế bào nấm men nảy chồi và có các sợi nấm (sợi nấm giả) Khi thấy được các tế bào

sẽ thấy sợi nấm không có màu, nếu nhuộm Grocott sợi nấm sẽ có màu đen Đầu nấm bao gồm có cuống của đính bào tử (conidiophore) và túi nấm (vesicle) Có thể có các tế bào hàng rào hình cung(metulae) và các đính bào đài(phialides) và các đính bào tử (conidia)

Hình 5: Hình ảnh nấm Aspergillus

23

* Nuôi cấy

Nuôi cấy nấm là kỹ thuật phức tạp nhằm mục đích phân lập và định loại nấm Hầu hết các giống nấm gây bệnh đều có khả năng mọc trên môi trường thạch Sabouraud đường có kháng sinh

Nuôi cấy bệnh phẩm nhằm mục tiêu xác định nấm gây bệnh, định danh nấm gây bệnh, dựa vào đó để lựa chọn thuốc kháng sinh kháng nấm điều trị

 Streptomycin: 40 đơn vị/ 1ml môi trường

 Penicillin: 20 đơn vị/ 1ml môi trường

Các thành phần của từng môi trường được đun nóng để hòa tan các chất, sau đó cho thêm kháng sinh, hấp ở 115oC trong 10-15 phút đổ đĩa

+ Quy trình kỹ thuật:

 Bước 1: Để môi trường từ tủ lạnh vào tủ ấm 30 phút

 Bước 2: Đánh dấu môi trường: Tên, tuổi, ngày tháng…

 Bước 3: Dùng ngón cái và ngón trỏ tay trái hé mở nắp môi trường

 Bước 4: Cấy 5 điểm trên môi trường mỗi điểm cách nhau 2cm