Nghiên cứu của Hueso Gutierrez, P. et al. (2005) cho thấy triệu chứng nấm tai rất đa dạng, có thể phối hợp nhiều triệu chứng như là ngứa tai, đau tai,
18
ù tai, cảm giác đầy tai, chảy tai, nghe kém; trong đó ngứa tai bao giờ cũng biểu hiện và chủng nấm hay gặp nhiều nhất là Aspergillus trong đó Aspergillus Niger gặp chủ yếu ngoài ra các chủng khác ít gặp như Cryptococcus, Fusarium…[22].
Nghiên cứu tại Nigeria năm 2001 trên 142 bệnh nhân bị nấm ống tai ngoài có chủng nấm Aspergillus (63,2%), Candida (35,5%), Mucor (0,7%)
trong đó Chủng nấm Candida gồm: Candida albicans (18,4%), Candida tropicalis (10,5%), Candida pseudotropicalis (6,6%). Chủng nấm Aspergillus
gồm: A. fumigatus (39,5%), A.niger (23,7%). Bệnh nhân gặp ở nhiều lứa tuổi tuy nhiên khoảng 79% trên 21 tuổi, 9% bệnh nhân nhiễm nấm hai tai, 38% nhiễm nấm ống tai ngoài trái, 53% nhiễm nấm tai phải [16].
19
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu.
105 bệnh nhân vào khám và điều trị tại phòng khám Tai Mũi Họng Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương được chẩn đoán là viêm ống tai ngoài từ 4/2015 – 6/2015.
* Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm ống tai ngoài: Chẩn đoán viêm ống tai
ngoài dựa vào các triệu chứng lâm sàng và kết quả nội soi
- Lâm sàng: Có những triệu chứng như cảm giác ngứa trong ống tai, ngứa tăng dần. Sau đó bắt đầu thấy đau tai, cảm giác đầy tức trong tai. Tiếp theo đó có thể xuất hiện nghe kém, cảm giác căng ở tai và ù tai.
- Nội soi: Kết quả nội soi có thể có giả mạc, chảy mủ hoặc viêm nề, màng nhĩ có thể có những lỗ thủng nhỏ khoặc không có tổn thương.
2.1.1. Tiêu chuẩn chọn bệnh nhân.
Bệnh nhân được chẩn đoán là viêm ống tai ngoài tại phòng khám Tai – Mũi – Họng Bệnh viện trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương.
Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ.
Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu.
Các bệnh nhân dùng kháng sinh chống nấm trong thời gian hai tuần gần đây.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Thời gian: từ 4/2015 – 6/2015.
- Địa điểm: Phòng khám Tai – Mũi – Họng Bệnh viên trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương và phòng thực hành ký sinh trùng.
20
2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu. 2.3.1. Thiết kế nghiên cứu.
Nghiên cứu ngang cắt ngang có phân tích
2.3.2. Cỡ mẫu.
Toàn bộ bệnh nhân đến khám tại khoa Tai – Mũi – Họng Bệnh viện Trường Đại học Kỹ thuật Y tế Hải Dương được chẩn đoán là viêm ống tai ngoài, từ 4/2015 – 6/2015
2.3.3. Phương tiện nghiên cứu
- Kính hiển vi quang học
- Tăm bông và ống đựng vô khuẩn - Lam kính, lamen
- Dung dịch KOH 20%
- Môi trường nuôi cấy: Sabouraud có Chloramphenicol - Tủ ấm
- Đèn cồn
2.3.4. Các nội dung nghiên cứu
2.2.4.1. Hỏi bệnh
- Tuổi - Giới - Nơi ở
- Nghề nghiệp
- Thói quen vệ sinh tai
- Tiền sử mắc bệnh : viêm tai giữa chảy mủ, nấm ống tai ngoài cùng bên….
- Tiền sử sử dụng thuốc
2.2.4.2. Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm
Trong công tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ và không khí xung quanh ở nơi làm xét nghiệm, vì trong không khí các bào tử và
21
sợi nấm tạp thường xuất hiện. Nếu không chú ý vệ sinh sạch sẽ dễ lây nhiễm ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
* Soi trực tiếp. - Kỹ thuật: + Chuẩn bị dụng cụ: Lam kính, lamen sạch. Pipet nhỏ giọt. Que cấy, đèn cồn. Bút ghi kính
+ Hóa chất: Dung dịch KOH 10-20%
+ Bệnh phẩm: Chọn tổn thương điển hình để lấy bệnh phẩm trong ống vô khuẩn.
+ Quy trình kỹ thuật:
Bước 1: Đánh dấu tiêu bản
Bước 2: Lấy một ít bệnh phẩm lên lam kính.
Bước 3: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 10 – 20% lên bệnh phẩm, đậy lamen hơ lam kính trên đèn cồn cho nóng, chú ý không để dung dịch KOH không bị sôi, hay có thể để bệnh phẩm trong nhiệt độ phòng từ 2-4 giờ.
Bước 4: Soi dưới kính hiển vi quang học với vật kính 10x, 40x.
- Nhận định kết quả:
+ Nếu là nấm Candida trên vi trường soi trực tiếp sẽ thấy: Các tế bào nấm men nhỏ kích thước từ 2-4 μm hình trái xoan, có thể có chồi, thành mỏng. Có thể thấy các sợi nấm, các sợi nấm có độ dài khác nhau, đầu tận cùng tròn đường kính khoảng 3-5 μm. Các sợi nấm có khoảng 1-2 đốt, ở chỗ nối giữa hai đốt có thể thấy một vài chồi. Cũng có khi thấy một đám tế bào nấm men nảy chồi và có các sợi nấm (sợi nấm giả). Khi thấy được các tế bào
22
nấm men nảy chồi cùng với các sợi nấm và các sợi nấm giả thì có thể xác định đó là nấm gây bệnh, thuộc giống nấm Candida.
Hình 4: Hình ảnh sợi nấm Candida
+ Nếu là nấm Aspergillus trên vi trường soi trực tiếp sẽ thấy: Các sợi nấm có vách ngăn, có các nhánh, các nhánh tách ra hợp với thân một góc nhọn 45°, có đường kính dưới 5 μm. Nếu nhuộm Gram và PSA, soi trực tiếp sẽ thấy sợi nấm không có màu, nếu nhuộm Grocott sợi nấm sẽ có màu đen. Đầu nấm bao gồm có cuống của đính bào tử (conidiophore) và túi nấm (vesicle). Có thể có các tế bào hàng rào hình cung(metulae) và các đính bào đài(phialides) và các đính bào tử (conidia).
23
* Nuôi cấy
Nuôi cấy nấm là kỹ thuật phức tạp nhằm mục đích phân lập và định loại nấm. Hầu hết các giống nấm gây bệnh đều có khả năng mọc trên môi trường thạch Sabouraud đường có kháng sinh.
Nuôi cấy bệnh phẩm nhằm mục tiêu xác định nấm gây bệnh, định danh nấm gây bệnh, dựa vào đó để lựa chọn thuốc kháng sinh kháng nấm điều trị.
- Kỹ thuật
+ Chuẩn bị dụng cụ: Que cấy, đèn cồn. Đĩa petri vô khuẩn Tủ ấm, tủ sấy.
+ Môi trường: Môi trường Sabouraud có kháng sinh: Pepton: 10g. Glucose: 20g. Chloramphenicol: 50mg. Thạch sợi: 20g. Nước cất: 1000ml. Có thể thay thế Chloramphenicol bằng:
Streptomycin: 40 đơn vị/ 1ml môi trường. Penicillin: 20 đơn vị/ 1ml môi trường.
Các thành phần của từng môi trường được đun nóng để hòa tan các chất, sau đó cho thêm kháng sinh, hấp ở 115oC trong 10-15 phút đổ đĩa.
+ Quy trình kỹ thuật:
Bước 1: Để môi trường từ tủ lạnh vào tủ ấm 30 phút. Bước 2: Đánh dấu môi trường: Tên, tuổi, ngày tháng…
Bước 3: Dùng ngón cái và ngón trỏ tay trái hé mở nắp môi trường. Bước 4: Cấy 5 điểm trên môi trường mỗi điểm cách nhau 2cm.
24
Bước 5: Để tủ ấm 37oC hoặc để ở nhiệt độ phòng, theo dõi 3-5 ngày hoặc có thể lâu hơn.
- Nhận định kết quả:
+ Giống nấm Candida:
Trên môi trường nuôi cấy, nấm men Candida mọc sau 24-48h các khóm nấm thường nhỏ đường kính 1-3mm. Lấy khóm nấm này soi trên kính hiển vi (sau nuôi cấy 24-48h) chỉ nhìn thấy các tế bào nấm men chưa có khả năng định danh nấm, chỉ sau nuôi cấy nhiều ngày các khóm nấm mới sinh ra các sợi nấm ở trong môi trường nuôi cấy, khi đó mới có khả năng định danh được các giống nấm Candida.
Định danh chủng nấm Candida albicans cần làm xét nghiệm sau:
Sinh bào tử áo còn gọi là bào tử màng dày (chlamydoconidium). Lấy một phần khóm nấm đã mọc cấy vào môi trường PCB (pomme carotte bile- khoai tây cà rốt và mật) hoặc môi trường RAT (rice cream agar tween thạch bột gạo) ở 25°C sẽ thấy sự phát triển nhanh của sợi nấm men. Nếu thấy có hiện tượng bào tử màng dầy sau ủ 24h đó là đặc trưng của chủng nấm Candida albicans là nấm có khả năng gây bệnh.
Sinh ra sợi nấm trong huyết thanh
Cho một hoặc hai giọt dịch treo của nấm men vào trong ống nghiệm chứa 0,5ml huyết thanh người hoặc động vật ( ngựa, thỏ, chuột) hoặc huyết thanh tươi đã bất hoạt, ủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 2-4h, trong tất cả các chủng của giống nấm Candida, chỉ có chủng Candida albicans và Candida stellatoidea sinh ra sợi nấm trong huyết thanh.
25
Cấy phần khóm nấm men vào 0,5ml huyết thanh có chứa 0,5% đường, ủ ấm ở 37°C từ 2-3h. Sau đó lấy một phần soi trên kính hiển vi thấy có sự sinh ra ống mầm của tế bào nấm men, đó là đặc trưng của chủng Candida albicans.
Hình 6: Ống mầm của tế bào nấm men.
Phản ứng lên men đường. Candida albicans có khả năng lên men đường glucose, mantose.
+ Giống nấm Aspergillus:
Trên môi trường nuôi cấy Aspergillus có thể mọc ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, thậm chí có thể mọc ở nhiệt độ 57 °C. Sợi nấm Aspergillus có thể mọc trên môi trường Sabouraud đường có kháng sinh sau 24-48h, nhưng đầu nấm Aspergillus chỉ được sinh ra sau 3-5 ngày nuôi cấy.
Khóm nấm Aspergillus có thể màu trắng, màu vàng, màu vàng nâu, màu xanh hoặc đen. Dựa vào màu sắc của các khóm nấm cũng có thể sơ bộ định dạng được chủng loại nấm gây bệnh.
26
Để định dạng chính xác các chủng loại nấm Aspergillus phải dựa vào phân tích các chi tiết về hình thái học, đặc biệt là đặc điểm của đầu nấm và các thể sinh sản.
Đặc điểm vi thể của các thể sinh sản vô tính: giống nấm Aspergillus có hai đặc điểm cơ bản:
Có một cuống nấm (stipe) sinh ra từ tế bào chân (foot cell) được tận cùng bởi túi mầm mang trực tiếp hoặc gián tiếp các đính bào đài.
Tất cả các giống Aspergillus đều sinh ra đính bào tử một tế bào. Các đính bào tử có thể phát tán khắp nơi trong không khí và là yếu tố duy trì chủng loại.
Đầu nấm : là sự hợp thành của túi nấm, các tế bào hình cung (nếu có), các đính bào đài và các đính bào tử. Đầu nấm có kích thước khác nhau tuỳ theo các chủng của giống nấm Aspergillus.
Đặc điểm vi thể của các thể sinh sản hữu tính:
Có một vài chủng hình thành cơ quan giới tính gồm có những tế bào khởi đầu, những túi và bào tử túi, Cleistothecium.
Có tới 175 chủng Aspergillus nhưng chỉ có một số chủng có khả
năng gây bệnh ở người như Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Aspergillus terreurs.
2.3.5. Kỹ thuật thu thập thông tin
* Thông tin chung của đối tượng nghiên cứu và một số yếu tố liên quan
Xây dựng theo phiếu phỏng vấn (như phụ lục):
- Giải thích cho bệnh nhân về bệnh, các xét nghiệm cần làm và quá trình điều trị để bệnh nhân yên tâm và hợp tác tốt với bác sĩ.
- Phần hành chính: ghi nhận tên, năm sinh, giới tính, nghề nghiệp, địa chỉ và ngày giờ khám bệnh
27
+ Tiền sử: Đã bị bệnh nấm ống tai, tiền sử bệnh khác; thói quen vệ sinh tai của bệnh nhân
+ Các yếu tố liên quan: tiền sử sử dụng corticoid kéo dài…
* Trình trạng nhiễm nấm của bệnh nhân: Lấy mẫu và xét nghiệm
- Bước 1: Lấy bệnh phẩm gửi về phòng thực hành ký sinh trùng: Dùng tăm bông vô trùng lấy bệnh phẩm. Sau đó chuyển ống vô khuẩn đựng bệnh phẩm về ngay phòng thực hành ký sinh trùng.
- Bước 2: Soi tươi trực tiếp tìm nấm: Có sợi nấm có vách ngăn hoặc không có vách ngăn hoặc có tế bào nấm men nảy chồi.
- Bước 3: Nuôi cấy trên môi trường Sabouraud có Chloramphenicol: có khóm nấm sợi hoặc khóm nấm men thuần nhất mọc.
2.4. Phương pháp sử lý số liệu
Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê y học với sự giúp đỡ của phần mềm STATA 11 và Excel 2013
Thống kê được kiểm định bằng các phép kiểm định sau: Đánh giá mức độ ý nghĩa của sự khác biệt giữa các tỷ lệ hoặc tần suất sử dụng test χ2, các kiểm định được thực hiện ở khoảng tin cậy 95% và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
2.5. Biện pháp hạn chế sai số
Trang bị kiến thức tập huấn kỹ năng thu thập số liệu cho người thu thập số liệu.
2.6. Các biến số nghiên cứu
* Các đặc điểm cá nhân của đối tượng nghiên cứu
- Tuổi - Giới
- Nghề nghiệp - Nơi ở
28
* Tình trạng viêm ống tai ngoài do nấm
- Tỷ lệ nhiễm nấm
- Tỷ lệ nhiễm theo các chủng nấm
- Tỷ lệ độ chính xác của soi tươi và nuôi cấy nấm
* Các yếu tố liên quan
- Tuổi. - Giới. - Nơi ở.
- Nghề nghiệp.
- Thói quen vệ sinh tai.
- Tiền sử sử dụng thuốc của bệnh nhân. - Tiền sử bệnh của bệnh nhân.
2.7. Đạo đức nghiên cứu.
Các đối tượng tham gia trong nghiên cứu hoàn toàn tự nguyện. Các đối tượng được giải thích rõ ràng về mục đích, ý nghĩa, các thông tin cần thu thập của nghiên cứu. Các kết quả nghiên cứu sẽ được giữ bí mật. Các đối tượng có toàn quyền lựa chọn tham gia hay không tham gia vào nghiên cứu.
Nội dung nghiên cứu phù hợp.
Mọi thông tin cá nhân đối tượng sẽ được giữ kín. Các số liệu, thông tin thu thập được chỉ phục vụ cho mục đích nghiên cứu, không phục vụ cho mục đích nào khác.
29
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Một số đặc điểm đối tượng nghiên cứu
3.1.1. Tuổi của đối tượng nghiên cứu
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ phân bố nhóm tuổi của đối tượng nghiên cứu Nhận xét: Tỷ lệ nhóm tuổi >15 tuổi (77,33%)cao hơn tỷ lệ nhóm tuổi từ 0 –
15 tuổi (26,67%)
3.1.2. Giới tính của đối tượng nghiên cứu
Biểu đồ 3.2. Tỷ lệ phân bố giới tính của đối tượng nghiên cứu
Nhận xét: Số bệnh nhân nam giới cao hơn 18,10% so với bệnh nhân nữ giới,
30
3.1.3. Nơi ở của đối tượng nghiên cứu
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ phân bố nơi ở của đối tượng nghiên cứu
Nhận xét: Bệnh nhân sống ở nông thôn cao gấp 1,5 lần bệnh nhân sống ở khu
vực thành phố (bệnh nhân ở nông thôn chiếm 60% còn thành thị chiếm 40%).
3.1.4. Nghề nghiệp của đối tượng nghiên cứu
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ phân bố nghề nghiệp của đối tượng nghiên cứu Nhận xét: Đa số bệnh nhân có nghề nghiệp khác chiếm tỷ lệ cao nhất là 43,81%, cán bộ viên chức chiếm tỷ lệ thấp nhất là 6,67%.
31
3.2. Tỷ lệ nhiễm nấm của bệnh nhân viêm ống tai ngoài
20,95%
79,05%
Nhiễm nấm Không nhiễm nấm
Biểu đồ 3.5. Tỷ lệ viêm ống tai ngoài do nấm Nhận xét:
Qua biểu đồ 3.5 cho thấy tỷ lệ bệnh nhân nhiễm nấm chiếm 20,95%, tỷ lệ bệnh nhân không nhiễm nấm chiếm 79,05%.
32
Bảng 3.1. Tỷ lệ phát hiện nấm bằng kỹ thuật soi tươi trên bệnh nhân VOTN do nấm. Kết quả Kết quả soi tươi Số bệnh nhân (n) Tỷ lệ (%) Dương tính Bào tử nấm và sợi nấm 21 95,45 Âm tính 1 4,55 Tổng 22 100
Nhận xét: Trong số 22 bệnh nhân bị nhiễn nấm có 21/22 bệnh nhân (95,45%)
có kết quả soi tươi thấy bào tử nấm và sợi nấm và 1/22 bệnh nhân (4,55%) có kết quả soi tươi âm tính.
Bảng 3.2. Tỷ lệ phát hiện nấm bằng phương pháp nuôi cấy trên bệnh nhân VOTN do nấm
Kết quả nuôi cấy Số bệnh nhân (n) Tỷ lệ (%)
Dương tính 21 95,45
Âm tính 1 4,45
Tổng 22 100
Nhận xét: Trong số 22 bệnh nnhân bị nhiễm nấm có 21/22 bệnh nhân (95,45%) có kết quả nuôi cấy dương tính và 1/22 bệnh nhân (4,55%) có kết quả nuôi cấy âm tính.
33
Bảng 3.3. Thành phần các loại nấm phát hiện được ở bệnh nhân VOTN do nấm Kết quả Chủng nấm Số bệnh nhân (n) Tỷ lệ (%) Aspegillus Fumigatus 12 54,55 Niger 2 9,09 Terreus 7 31,82 Âm tính 1 4,55 Tổng 22 100 Nhận xét:
- Kết quả nghiên cứu cho thấy giống nấm gây bệnh đó là giống
Aspergillus, trong đó có 12/22 bệnh nhân (54,55%) nhiễm nấm Aspergillus Fumigatus, 2/22 bệnh nhân (9,09%) nhiễm nấm Aspergillus Niger và 7/22