2.2.4.1. Hỏi bệnh
- Tuổi - Giới - Nơi ở
- Nghề nghiệp
- Thói quen vệ sinh tai
- Tiền sử mắc bệnh : viêm tai giữa chảy mủ, nấm ống tai ngoài cùng bên….
- Tiền sử sử dụng thuốc
2.2.4.2. Kỹ thuật xét nghiệm tìm nấm
Trong công tác xét nghiệm nấm cần lưu ý điều kiện vệ sinh dụng cụ và không khí xung quanh ở nơi làm xét nghiệm, vì trong không khí các bào tử và
21
sợi nấm tạp thường xuất hiện. Nếu không chú ý vệ sinh sạch sẽ dễ lây nhiễm ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm.
* Soi trực tiếp. - Kỹ thuật: + Chuẩn bị dụng cụ: Lam kính, lamen sạch. Pipet nhỏ giọt. Que cấy, đèn cồn. Bút ghi kính
+ Hóa chất: Dung dịch KOH 10-20%
+ Bệnh phẩm: Chọn tổn thương điển hình để lấy bệnh phẩm trong ống vô khuẩn.
+ Quy trình kỹ thuật:
Bước 1: Đánh dấu tiêu bản
Bước 2: Lấy một ít bệnh phẩm lên lam kính.
Bước 3: Nhỏ 1-2 giọt dung dịch KOH 10 – 20% lên bệnh phẩm, đậy lamen hơ lam kính trên đèn cồn cho nóng, chú ý không để dung dịch KOH không bị sôi, hay có thể để bệnh phẩm trong nhiệt độ phòng từ 2-4 giờ.
Bước 4: Soi dưới kính hiển vi quang học với vật kính 10x, 40x.
- Nhận định kết quả:
+ Nếu là nấm Candida trên vi trường soi trực tiếp sẽ thấy: Các tế bào nấm men nhỏ kích thước từ 2-4 μm hình trái xoan, có thể có chồi, thành mỏng. Có thể thấy các sợi nấm, các sợi nấm có độ dài khác nhau, đầu tận cùng tròn đường kính khoảng 3-5 μm. Các sợi nấm có khoảng 1-2 đốt, ở chỗ nối giữa hai đốt có thể thấy một vài chồi. Cũng có khi thấy một đám tế bào nấm men nảy chồi và có các sợi nấm (sợi nấm giả). Khi thấy được các tế bào
22
nấm men nảy chồi cùng với các sợi nấm và các sợi nấm giả thì có thể xác định đó là nấm gây bệnh, thuộc giống nấm Candida.
Hình 4: Hình ảnh sợi nấm Candida
+ Nếu là nấm Aspergillus trên vi trường soi trực tiếp sẽ thấy: Các sợi nấm có vách ngăn, có các nhánh, các nhánh tách ra hợp với thân một góc nhọn 45°, có đường kính dưới 5 μm. Nếu nhuộm Gram và PSA, soi trực tiếp sẽ thấy sợi nấm không có màu, nếu nhuộm Grocott sợi nấm sẽ có màu đen. Đầu nấm bao gồm có cuống của đính bào tử (conidiophore) và túi nấm (vesicle). Có thể có các tế bào hàng rào hình cung(metulae) và các đính bào đài(phialides) và các đính bào tử (conidia).
23
* Nuôi cấy
Nuôi cấy nấm là kỹ thuật phức tạp nhằm mục đích phân lập và định loại nấm. Hầu hết các giống nấm gây bệnh đều có khả năng mọc trên môi trường thạch Sabouraud đường có kháng sinh.
Nuôi cấy bệnh phẩm nhằm mục tiêu xác định nấm gây bệnh, định danh nấm gây bệnh, dựa vào đó để lựa chọn thuốc kháng sinh kháng nấm điều trị.
- Kỹ thuật
+ Chuẩn bị dụng cụ: Que cấy, đèn cồn. Đĩa petri vô khuẩn Tủ ấm, tủ sấy.
+ Môi trường: Môi trường Sabouraud có kháng sinh: Pepton: 10g. Glucose: 20g. Chloramphenicol: 50mg. Thạch sợi: 20g. Nước cất: 1000ml. Có thể thay thế Chloramphenicol bằng:
Streptomycin: 40 đơn vị/ 1ml môi trường. Penicillin: 20 đơn vị/ 1ml môi trường.
Các thành phần của từng môi trường được đun nóng để hòa tan các chất, sau đó cho thêm kháng sinh, hấp ở 115oC trong 10-15 phút đổ đĩa.
+ Quy trình kỹ thuật:
Bước 1: Để môi trường từ tủ lạnh vào tủ ấm 30 phút. Bước 2: Đánh dấu môi trường: Tên, tuổi, ngày tháng…
Bước 3: Dùng ngón cái và ngón trỏ tay trái hé mở nắp môi trường. Bước 4: Cấy 5 điểm trên môi trường mỗi điểm cách nhau 2cm.
24
Bước 5: Để tủ ấm 37oC hoặc để ở nhiệt độ phòng, theo dõi 3-5 ngày hoặc có thể lâu hơn.
- Nhận định kết quả:
+ Giống nấm Candida:
Trên môi trường nuôi cấy, nấm men Candida mọc sau 24-48h các khóm nấm thường nhỏ đường kính 1-3mm. Lấy khóm nấm này soi trên kính hiển vi (sau nuôi cấy 24-48h) chỉ nhìn thấy các tế bào nấm men chưa có khả năng định danh nấm, chỉ sau nuôi cấy nhiều ngày các khóm nấm mới sinh ra các sợi nấm ở trong môi trường nuôi cấy, khi đó mới có khả năng định danh được các giống nấm Candida.
Định danh chủng nấm Candida albicans cần làm xét nghiệm sau:
Sinh bào tử áo còn gọi là bào tử màng dày (chlamydoconidium). Lấy một phần khóm nấm đã mọc cấy vào môi trường PCB (pomme carotte bile- khoai tây cà rốt và mật) hoặc môi trường RAT (rice cream agar tween thạch bột gạo) ở 25°C sẽ thấy sự phát triển nhanh của sợi nấm men. Nếu thấy có hiện tượng bào tử màng dầy sau ủ 24h đó là đặc trưng của chủng nấm Candida albicans là nấm có khả năng gây bệnh.
Sinh ra sợi nấm trong huyết thanh
Cho một hoặc hai giọt dịch treo của nấm men vào trong ống nghiệm chứa 0,5ml huyết thanh người hoặc động vật ( ngựa, thỏ, chuột) hoặc huyết thanh tươi đã bất hoạt, ủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 2-4h, trong tất cả các chủng của giống nấm Candida, chỉ có chủng Candida albicans và Candida stellatoidea sinh ra sợi nấm trong huyết thanh.
25
Cấy phần khóm nấm men vào 0,5ml huyết thanh có chứa 0,5% đường, ủ ấm ở 37°C từ 2-3h. Sau đó lấy một phần soi trên kính hiển vi thấy có sự sinh ra ống mầm của tế bào nấm men, đó là đặc trưng của chủng Candida albicans.
Hình 6: Ống mầm của tế bào nấm men.
Phản ứng lên men đường. Candida albicans có khả năng lên men đường glucose, mantose.
+ Giống nấm Aspergillus:
Trên môi trường nuôi cấy Aspergillus có thể mọc ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, thậm chí có thể mọc ở nhiệt độ 57 °C. Sợi nấm Aspergillus có thể mọc trên môi trường Sabouraud đường có kháng sinh sau 24-48h, nhưng đầu nấm Aspergillus chỉ được sinh ra sau 3-5 ngày nuôi cấy.
Khóm nấm Aspergillus có thể màu trắng, màu vàng, màu vàng nâu, màu xanh hoặc đen. Dựa vào màu sắc của các khóm nấm cũng có thể sơ bộ định dạng được chủng loại nấm gây bệnh.
26
Để định dạng chính xác các chủng loại nấm Aspergillus phải dựa vào phân tích các chi tiết về hình thái học, đặc biệt là đặc điểm của đầu nấm và các thể sinh sản.
Đặc điểm vi thể của các thể sinh sản vô tính: giống nấm Aspergillus có hai đặc điểm cơ bản:
Có một cuống nấm (stipe) sinh ra từ tế bào chân (foot cell) được tận cùng bởi túi mầm mang trực tiếp hoặc gián tiếp các đính bào đài.
Tất cả các giống Aspergillus đều sinh ra đính bào tử một tế bào. Các đính bào tử có thể phát tán khắp nơi trong không khí và là yếu tố duy trì chủng loại.
Đầu nấm : là sự hợp thành của túi nấm, các tế bào hình cung (nếu có), các đính bào đài và các đính bào tử. Đầu nấm có kích thước khác nhau tuỳ theo các chủng của giống nấm Aspergillus.
Đặc điểm vi thể của các thể sinh sản hữu tính:
Có một vài chủng hình thành cơ quan giới tính gồm có những tế bào khởi đầu, những túi và bào tử túi, Cleistothecium.
Có tới 175 chủng Aspergillus nhưng chỉ có một số chủng có khả
năng gây bệnh ở người như Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus versicolor, Aspergillus terreurs.