ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

ENZYME LINKED IMMUNO-SORBENT ASSAY (ELISA) MỤC TIÊU HỌC TẬP Phát diện HBsAg, HCV huyết người phương pháp SANDWICH ELISA LÝ THUYẾT I.1 Tổng quan Kỹ thuật ELISA sử dụng rộng rãi y học ngành khoa học nghiên cứu sống khác, phương pháp tin cậy nhằm phát định lượng protein hòa tan hỗn hợp huyết dịch nuôi cấy tế bào Thí nghiệm dựa đặc hiệu kháng thể để phát thành phần hỗn hợp protein Có hai loại ELISA: ELISA trực tiếp: sử dụng để phát định lượng kháng thể kháng nguyên biết diện mẫu ELISA SANDWICH: sử dụng phát định lượng kháng nguyên diện mẫu Nói chung hai loại thí nghiệm sử dụng giếng nơi xảy phản ứng Hai loại men sử dụng rộng rãi ELISA PO (Peroxidase) Alkaline Phosphatase I I.2 Quy trình chuẩn ELISA sandwich - Bao phủ giếng với kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên Kháng thể cho vào giếng đĩa nhựa ủ 37 oC 90 phút để qua đêm nhiệt độ 2- o C Kháng thể không gắn kết bị loại qua trình rửa giếng vài lần (thường từ 4- lần) với chất rửa, thường sử dụng PBS (phosphat buffer saline) chứa số chất tẩy rửa nhẹ Tween - Bão hòa giếng Là trình khóa chổ bề mặt giếng không gắn kháng thể để tránh tạo kết dương tính giả Đĩa ủ với chất khác feal bovine serum (FBS), sữa không béo, gelatine 37 oC 90 phút, chất không gắn kết loại hoàn toàn với vài lần rửa PBS- Tween - Ủ mẫu cần kiểm tra Mẫu (huyết hanh cần kiểm tra) thêm vào giếng ủ khoảng 60 phút 37 C Loại bỏ protein không kết hợp với kháng thể ban đầu cách rửa giếng với PBS- Tween - Ủ kháng thể thứ có gắn men Thêm vào giếng kháng thể thứ có gắn men Giếng ủ 45-50 phút 37 oC rửa nhiều lần với PBS-Tween - Ủ với chất Thêm chất vào giếng ủ giếng nhiệt độ phòng 30 phút Cơ chất phản ứng với men sinh màu Kết thức phản ứng: chất ngưng phản ứng H2SO4 1N - Đo độ quang học máy đo để định lượng Để xác định nồng độ kháng nguyên kháng thể mẫu chưa biết, cần có vài mẫu với nồng độ kháng nguyên, kháng thể biết, mẫu chuẩn Pha loãng hàng loạt mẫu chuẩn mẫu thử Đường chuẩn xây dựng với nồng độ mẫu chuẩn vẽ trục hoành mật độ quang học đo đường chuẩn thiết lập Trong phần thực tập sử dụng kỹ thuật sandwich ELISA để phát kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg) viêm gan C (Anti-HCV) II Thực hành II.1 Phát kháng nguyên bề mặt viêm gan B (HBsAg) Sử dụng phương pháp ELISA Sandwich để phát kháng nguyên bề mặt a Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - Đĩa ELISA 96 giếng bao phủ HBsAg - Micro pipet - Pipette tips - Khăn giấy - Ống thử ml - Mẫu huyết - Chất chống đông (heparin, natri citrate) - Bộ kit test gồm có: + Chất rửa (20X): tris HCl buffer pH 7,4 + Chứng âm: tris HCL buffer chứa BSA + Chứng dương: tris HCl buffer chứa BSA có chứa HBsAg + Chất pha loãng: Tris HCl buffer pH 7,4 chứa BSA, Tween 20 + Hợp chất kháng thể anti HBs + Chất đệm: acid citric sodium acetate pH 4,0 chứa H 2O2(0,015%) DMSO (4%) + Chất bắt màu nhiễm sắc thể màu hồng : Tetramethyl benzidine (TMB) + Chất ngừng phản ứng: H2SO4 1N b Thực o 1,5 ml Máu + 0,15 ml heparin ( natri citrate) Ly tâm Huyết 2500 vòng, 10 phút Giếng ELISA 100μl Huyết thanh, 100 μl chứng âm, 100ml chứng dương (đã gắn kháng thể anti HBsAg) Bổ sung 50 μl kháng thể anti HBsAg Ủ 1h, 37 oC Rửa giếng lần với dung dịch rửa Ủ 10- 30 phút Bổ sung 100μl TMB vào giếng Ngưng phản ứng 100μl H2SO4 Đọc kết bước sóng 450nm c Kết Ghi lại đổi màu thí nghiệm, màu dương tính, màu âm tính Tính toán giá trị OD ngưỡng nhầm xác định mẫu âm tính hay dương tính với kháng nguyên HBs virus viêm gan B Nếu OD mẫu thí nghiệm lớn OD ngưỡng mẫu dương, ngược lại âm tính OD ngưỡng = M.OD R3 + 0,050 (R3 chứng âm cung cấp nhà sản xuất) Nếu kết đo OD R3 thấp 0,01 hủy bỏ kết làm lại phản II.2 Phát kháng nguyên bề mặt virus viêm gan C (HCV) a Thiết bị, dụng cụ, hóa chất - Đĩa ELISA 96 giếng bao phủ HCV Ag - Micro pipet Pipette tips Khăn giấy Ống thử ml Mẫu huyết Chất chống đông (heparin, natri citrate) Bộ kit test gồm có: + Chất rửa mẫu (20X): tris HCl buffer pH 7,4 (R2) + Chứng âm: Huyết người kháng nguyên HBs kháng thể antiHIV1, anti- HIV2 (R3) + Chứng dương: Huyết người chứa HCV, kháng nguyên HBs kháng thể anti- HIV1 kháng thể anti- HIV2 bất hoạt tác dụng hóa quang học (R4) + Pha loãng mẫu: PBS buffer (R6) + Enzyme trực tiếp chống lại kháng thể IgG người.(R7) + Chất đệm Peroxidase (R8) + Chất nhiễm sắc: dung dịch chứa TMB (tetramethyl benzidine) (R9) + Chất dừng phản ứng: dung dịch H2SO4 1N (R10) b Thực - Thêm vào giếng 80μl dung dịch pha loãng - 20μl đối chứng âm vào giếng - 20 μl đối chứng dương vào giếng - 20 μl mẫu vào giếng Cũng cho vào giếng 100 μl vào giếng phải pha loãng mẫu tỷ lệ 1:5 trước cho vào giếng Nếu mẫu phân phối 10 giây phân phối đối chứng vào giếng sau phân phối hết mẫu vào giếng Sau mẫu phân phối vào giếng màu tía chất pha loãng chuyển sang màu xanh - Bọc giếng lại nhựa chắn - Ủ giếng điều kiện sau: + Phương pháp 1: 60± phút, nhiệt độ 37± độ C + Phương pháp 2: 60± phút, nhiệt độ 40 ± độ C - Sau bỏ che - Rửa giếng lần máy rửa ELISA - Hút nhanh 100 μl hỗn hợp kháng thể cho vào giếng Lọ kháng thể phải lắc trước sử dụng Đậy giếng lại đem ủ 38 0C khoảng 30 phút - Loại bỏ rửa dung dịch giếng - Rửa giếng lần Đập giếng lên bề giấy thấm nước - Pha hỗn hợp enzym - Hút nhanh 100 μl hỗn hợp vừa pha vào giếng.Ủ tối 30 phút nhiệt độ phòng Không đậy trình ủ - Dừng phản ứng lại H2SO4 1N Sau trình dừng phản ứng lại màu mẫu quan sát thấy rõ Ghi nhận đổi màu - Làm đáy strip để đo OD xác hơn, sau phút dừng phản ứng - Đọc mẫu bước sóng 450/620-700nm - Ghi nhận tính toán kết c Kết Tính toán giá trị dương tính M.OD4= Tổng OD R4/ Giá trị ngưỡng (CO)= M.OD4/5 Chú ý: Khi giá trị chứng âm cao 0.15 không chấp nhận kết Khi giá trị chứng dương khoảng 1.000- 2,400 chấp nhận Kết luận dương tính- âm tính: Khi mẫu thấp giá trị ngưỡng gọi âm tính với test Kết âm tính chấp nhận: CO – 10% < OD< CO - ... HIV1 kháng thể anti- HIV2 bất hoạt tác dụng hóa quang học (R4) + Pha loãng mẫu: PBS buffer (R6) + Enzyme trực tiếp chống lại kháng thể IgG người.(R7) + Chất đệm Peroxidase (R8) + Chất nhiễm sắc: