Nghiên cứu bào chế hỗn dịch nhỏ mắt nano mangiferin

lipid hoặc một số chất có thể trộn lẫn với tiểu phân nhưng không thân với môi trường sẽ ngăn được quá trình kết tụ Oswald, ví dụ miglyol và 1 - decanol có tác dụng bảo vệ tiểu phân của c

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐÀO VĂN NAM

MÃ SỐ: 60720402

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Ngọc Bùng

LỜI CẢM ƠN

Sau quá trình thực nghiệm, tôi đã hoàn thành các nội dung của Luận văn

tốt nghiệp Thạc sĩ Dược học Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS Phạm

Ngọc Bùng, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, gợi mở nhiều ý tưởng để

tôi hoàn thành công việc Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Th.S Võ Quốc Ánh đã quan

tâm sát sao, giúp tôi làm sáng tỏ nhiều vấn đề và luôn động viên tôi trong lúc tôi gặp khó khăn

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô, anh chị trong tổ Hóa lý và Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi để tôi có đủ thời gian, phương tiện hoàn thành chương trình đào tạo

Tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu và Nhà trường đã đồng ý, hỗ trợ để tôi tham

dự khóa học; xin cảm ơn các thầy cô giáo, anh chị đồng nghiệp tại Bộ môn Bào chế,

Bộ môn Công nghiệp Dược, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Phòng Sau Đại học, Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương đã giúp đỡ tôi để tôi tiến hành thực nghiệm và hoàn thành khóa học

Trong suốt khóa học Thạc sĩ tại trường Đại học Dược Hà Nội, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm về nhân lực, vật chất và thời gian của các thế hệ thầy cô, đồng nghiệp, bạn bè, các bạn sinh viên; sự động viên, nuôi dưỡng và tình cảm của gia đình Tôi xin trân trọng cảm ơn tất cả sự chân tình và lòng nhiệt thành ấy

Hà Nội, tháng 10 năm 2015

Học viên

Đào Văn Nam

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 MANGIFERIN 2

1.1.1 Nguồn gốc 2

1.1.2 Cấu tạo hóa học, tính chất lý hóa 2

1.1.3 Tác dụng kháng virus 2

1.1.4 Một số tác dụng sinh học khác 4

1.1.5 Một số nghiên cứu về mangiferin 5

1.2 HỖN DỊCH NHỎ MẮT NANO 6

1.2.1 Đặc điểm, thành phần 6

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng và biện pháp đảm bảo độ ổn định 6

1.3 PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA DO THAY ĐỔI DUNG MÔI 11

1.3.1 Động học quá trình kết tủa 11

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới kích thước tiểu phân 11

1.3.3 Một số kĩ thuật kết tủa để bào chế tiểu phân nano 13

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ 16

2.1.1 Hóa chất, nguyên liệu 16

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.2.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano MGF bằng cách thay đổi dung môi 18

2.2.2 Phương pháp xây dựng công thức và phương pháp bào chế tiểu phân

nano MGF 18

2.2.3 Phương pháp xây dựng công thức hỗn dịch nhỏ mắt nano MGF 18

2.2.4 Phương pháp đông khô 19

2.2.5 Phương pháp định lượng mangiferin 19

2.2.6 Phương pháp xác định độ tan của MGF 20

2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng nước bằng chuẩn độ Karl Fisher 20

2.2.8 Phương pháp xác định phân bố KTTP, thế zeta 21

2.2.9 Phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X 21

2.2.10 Phương pháp quét nhiệt lượng vi sai 21

2.2.11 Phương pháp đo độ nhớt 22

2.2.12 Phương pháp đánh giá kích ứng trên mắt thỏ 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25

3.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN 25

3.1.1 Phương pháp quang phổ UV 25

3.1.2 Phương pháp HPLC 26

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO MANGIFERIN 27

3.2.1 Xác định độ tan của mangiferin trong một số dung môi 27

3.2.2 Xây dựng phương pháp kết tủa MGF do thay đổi dung môi 28

3.2.3 Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano mangiferin 34

3.3 XÂY DỰNG CÔNG THỨC HỖN DỊCH NHỎ MẮT NANO 38

3.3.1 Lựa chọn nồng độ 38

3.3.2 Khảo sát kĩ thuật đông khô 38

3.3.3 Lựa chọn môi trường phân tán 42

3.4 ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH BÀO CHẾ 49

3.4.1 Quy trình bào chế 49

3.4.2 Mô tả quy trình 50

3.5 ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH HỖN DỊCH NHỎ MẮT NANO MANGIFERIN 51

3.5.1 Dạng thù hình của tiểu phân nano MGF 51

3.5.2 Độ tan của tiểu phân MGF 55

3.5.3 Độ nhớt hỗn dịch 55

3.5.4 Đặc điểm, độ ổn định của bột đông khô 56

3.5.5 Đặc tính của hỗn dịch sau khi pha lại 57

3.5.6 Đánh giá đặc tính kích ứng của hỗn dịch bào chế được 57

Chương 4 BÀN LUẬN 59

4.1 VỀ PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA DO THAY ĐỔI DUNG MÔI 59

4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ 59

4.1.2 Ảnh hưởng của dung môi DMSO 59

4.1.3 Ảnh hưởng của yếu tố khác 60

4.2 VỀ ẢNH HƯỞNG CỦA THÀNH PHẦN TRONG CÔNG THỨC ĐẾN ĐỘ BỀN CỦA HỖN DỊCH 60

4.3 VỀ TÍNH KÍCH ỨNG MẮT CỦA HỖN DỊCH BÀO CHẾ ĐƯỢC 62

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

KẾT LUẬN 63

KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

PEG Polyethylen glycol

SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation)

SFCO2 CO2 siêu tới hạn (Supercritical Fluids CO2)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 3.1: Độ hấp thụ của các dung dịch MGF nồng độ khác nhau 25

2 Bảng 3.2: Diện tích píc ở các mẫu có nồng độ MGF khác nhau 27

3 Bảng 3.3 Độ tan của MGF trong một số dung môi 28

4 Bảng 3.4: Đặc điểm hỗn dịch khi bào chế với nồng độ MGF khác

9 Bảng 3.9: Ảnh hưởng các chất diện hoạt đến tiểu phân MGF 35

10 Bảng 3.10: KTTP hỗn dịch với công thức bào chế khác nhau 36

11 Bảng 3.11: Kết quả đánh giá độ lặp lại của phương pháp bào chế 38

12 Bảng 3.12: Đặc tính bánh đông khô với cách thức làm lạnh trong

giai đoạn tiền đông khác nhau

17 Bảng 3.17: Sự phân hủy của MGF ở pH khác nhau 46

18 Bảng 3.18: Đặc tính hỗn dịch khi thay đổi cách điều chỉnh pH 47

19 Bảng 3.19: Kết quả đo độ nhớt hỗn dịch (nhiệt độ 20±0,1o

20 Bảng 3.20: Đặc tính bánh đông khô khi bảo quản 1 tháng (n = 3) 56

21 Bảng 3.21: Đặc tính của hỗn dịch sau khi pha lại (n = 3) 57

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1 Hình 1.1: Cấu trúc không gian của chất ổn định khi tương tác với

bề mặt tiểu phân (a) trải dài, (b) tạo thành cuộn, (c) tương tác tạo

3 Hình 1.3: (a) Thiết bị vi hóa lỏng, (b) thiết bị ly tâm cao tốc 14

4 Hình 3.1: Tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ MGF trong

dung dịch

25

5 Hình 3.2: Sắc kí đồ của (a) mẫu chuẩn, (b) mẫu thử 26

6 Hình 3.3: Tương quan giữa diện tích píc và nồng độ MGF trong

dung dịch

27

7 Hình 3.4: a Nguyên liệu MGF quan sát trên kính hiển vi quang

học vật kính 40; b Tủa bông MGF quan sát trên kính hiển vi

13 Hình 3.10: Giản đồ phân tích nhiệt lượng vi sai của (a) mẫu

nguyên liệu MGF; (b) mẫu tiểu phân nano MGF

53

14 Hình 3.11: Phổ nhiễu xạ tia X của (a) mẫu nguyên liệu MGF, (b)

mẫu tiểu phân nano MGF

54

ĐẶT VẤN ĐỀ

Herpes simplex là virus thuộc nhóm có nhân ADN, có thể gây các bệnh ngoài da hoặc gây viêm các tổ chức như mắt, miệng, cơ quan sinh dục Herpes mắt thường biểu hiện bởi các triệu chứng: nhìn không rõ, sợ ánh sáng, chảy nước mắt,

đỏ mắt Nếu không chữa trị kịp thời, bệnh nhân có thể bị biến chứng nặng, dẫn tới

mù mắt Để điều trị herpes mắt, y học thường dùng các dẫn chất guanin (acyclovir, ganciclovir) hoặc dẫn chất kiểu nucleosid (idoxuridin, trifluridin) dùng tại chỗ, có thể kết hợp với đường toàn thân Tuy nhiên các chế phẩm này có đặc tính chung là nhiều tác dụng phụ, sinh khả dụng thấp, gây bất tiện khi sử dụng [58]

Mangiferin là một flavonoid được chiết xuất từ nhiều loài thực vật, trong đó

có cây xoài Mangifera indica L., Anacardiaceae được trồng phổ biến ở Việt Nam

Các công trình nghiên cứu cho thấy mangiferin có nhiều tác dụng sinh học nổi bật như kháng virus, chống oxy hóa, hạ đường huyết, hạ lipid máu Hiện nay mangiferin đã được chiết xuất thành nguyên liệu làm thuốc, các dạng bào chế đang lưu hành và nghiên cứu ở Việt Nam là viên nang, kem bôi da, mỡ tra mắt, hỗn dịch tra mắt [6] Tuy nhiên trong quá trình sử dụng và bảo quản, dạng kem không ổn định, mangiferin dễ bị oxy hóa làm thuốc biến màu và giảm nhanh hàm lượng Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy hỗn dịch gây kích ứng khi thử nghiệm trên mắt thỏ [6]

Nhằm đảm bảo độ ổn định của mangiferin trong chế phẩm và tăng sinh khả dụng của thuốc, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế hỗn dịch nhỏ mắt nano mangiferin” với mục tiêu:

1 Xây dựng được công thức và phương pháp bào chế hỗn dịch nhỏ mắt nano mangiferin

2 Đánh giá được một số đặc tính của hỗn dịch bào chế được

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 MANGIFERIN

1.1.1 Nguồn gốc

Mangiferin được phát hiện có nhiều trong các loài như Mangifera indica L.,

Anacardiaceae; Mangifera sylvatica, Anacardiaceae; Curcuma amada, Zingiberaceae [28],[47] Dược liệu sau khi thu hái và xử lý được chiết trong bình

soxhlet, dịch chiết thu được đem bay hơi và sử dụng sắc ký hấp phụ để tinh chế hoặc dùng các hệ dung môi khác để kết tinh [38],[40]

1.1.2 Cấu tạo hóa học, tính chất lý hóa

1.1.2.1 Công thức, tên khoa học

CTPT: C19H18O11 Khối lượng phân tử: 422,34

Tên khoa học: 2-C-β-D-glucopyranozido-1,3,6,7-tetrahydroxyxanthon [4]

1.1.2.2 Tính chất

- Trạng thái tồn tại: bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, gần như không mùi

- Độ tan: hơi tan trong hỗn hợp aceton - nước (1:1), thực tế không tan trong nước, ethanol 96% và cloroform [4]

- Mangiferin là một đa acid yếu, giá trị pKa là 6,52; 7,97; 9,44; 12,10 [23]

1.1.3 Tác dụng kháng virus

Tác dụng ức chế sự phát triển HSV týp 1 và 2 của MGF đã được nghiên cứu trên lâm sàng vào cuối những năm 90 của thế kỷ trước Khi bệnh nhân sử dụng MGF dưới dạng thuốc uống và/ hoặc thuốc mỡ bôi ngoài da ở nồng độ 2% và 5%,

các bệnh do HSV gây ra như herpes sinh dục, herpes ngoài da, herpes miệng, herpes đường hô hấp trên thuyên giảm đáng kể Bệnh nhân dung nạp tốt, không có hoặc ít

có tác dụng phụ, tỉ lệ kháng thuốc thấp Theo các tác giả, cơ chế là do MGF có khả năng ức chế quá trình sao chép ngược của HSV, bên cạnh đó còn có tác dụng kích thích sinh interferon γ [66],[67]

Ngoài HSV, MGF ức chế được sự phát triển của một số loài virus khác như Zoster virus, HIV Theo Wang R.R và cộng sự [56], MGF có 4 trung tâm tạo được liên kết hydro với HIV - 1 protease, giúp MGF có khả năng ức chế enzym này của HIV Tác giả cũng nhận định, MGF có thể có tác dụng khác biệt khi so sánh với các thuốc đang lưu hành thuộc nhóm ức chế protease

Năm 2002, Công ty Dược Trung ương Huế đã thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ “Nghiên cứu kỹ thuật bào chế mỡ tra mắt và kem bôi da chứa hoạt chất Mangiferin để điều trị các bệnh do virus Herpes simplex gây ra ở mắt và da” và

đã sản xuất thành công thuốc mỡ tra mắt 2% [6] Mặc dù đã được đưa vào điều trị song thuốc mỡ tra mắt gây nhiều bất tiện cho người dùng, do vậy các dạng bào chế khác vẫn tiếp tục được nghiên cứu để sử dụng trong trường hợp herpes mắt

Dược động học

Khi cho chuột cống uống 1 liều duy nhất ở nồng độ 50 - 1000 mg/ kg, MGF được phát hiện với nồng độ thấp trong huyết tương Các thông số dược động học thay đổi theo tình trạng cơ thể và dạng thuốc đưa vào cơ thể Ở mức liều 400 mg/

kg, Cmax tăng từ 715,04 ng/ ml trên chuột khỏe mạnh lên 1995,52 ng/ ml trên chuột tiểu đường do streptozotocin [32] Nồng độ Cmax trong huyết tương có thể đạt ở mức 24,75; 56,77; 200,77 µg/ ml khi tiêm tĩnh mạch dung dịch MGF trong DMSO với nồng độ 10; 25 và 50 mg/ kg tương ứng Đặc biệt, ở liều tiêm tĩnh mạch 50 mg/ kg, MGF có thể qua được hàng rào máu mắt đạt nồng độ 5,69 µg/ ml ở võng mạc [26] MGF phân bố ở nhiều mô trong cơ thể, qua được hàng rào máu não, gan, tinh hoàn, lách [30]

Fe2+, Fe3+, làm mất vai trò xúc tác của Fe2+ với phản ứng peroxid hóa lipid [13],[55] Nghiên cứu của Pal P.B và đồng nghiệp [40] cho thấy, MGF có tác dụng phục hồi tổn thương gan khi cho chuột uống chì (II) nitrat

Tác dụng điều trị ung thư

MGF thể hiện rõ tác dụng kháng tế bào ung thư trên các mô hình thử nghiệm

như ung thư bạch cầu in vitro [62], ung thư ruột kết in vivo [64] Nhiều nghiên cứu

cho rằng, cơ chế tác dụng là do MGF làm giảm sự vận chuyển electron qua một số kênh protein, quá trình này vốn xảy ra rất mạnh ở các tế bào ung thư [45] hoặc do

sự ức chế pha G2/ M trong quá trình phát triển của tế bào [62]

Tác dụng hạ đường huyết, tác dụng hạ lipid máu

Các kết quả nghiên cứu đã công bố cho thấy MGF làm giảm đường huyết trên chuột bị tiểu đường do streptozotocin [25],[38] Theo các tác giả, MGF có khả năng ức chế một số enzym hoạt hóa thoái phân đường như sucrase, isomaltase, maltase [63] hoặc enzym tham gia cơ chế bệnh sinh tiểu đường như protein tyrosin phosphatase 1B (PTP1B) [44]

Trên cùng mô hình động vật nghiên cứu [38], nhóm tác giả Muruganandan S

và đồng nghiệp công bố MGF làm giảm nồng độ lipid máu và tăng nồng độ cholesterol Cơ chế có thể do MGF làm giảm sự tổng hợp acid béo tự do và triglycerid ở gan thông qua con đường AMPK [39], hoặc do thay đổi biểu hiện của

HDL-các ARN thông tin mã hóa cho HDL-các enzym tham gia tổng hợp và chuyển hóa lipid ở gan và cơ, dẫn đến tác dụng hạ lipid máu [24]

Ngoài các tác dụng kể trên, MGF còn có nhiều tác dụng sinh học khác như tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, tác dụng trên hệ miễn dịch, chống phóng xạ, bảo

vệ tuần hoàn,…[22],[47],[50]

1.1.5 Một số nghiên cứu về mangiferin

Mặc dù có nhiều tác dụng sinh học nổi trội, MGF có nhược điểm là độ tan thấp và tính thấm kém, do vậy các nghiên cứu được tiến hành theo hướng thay đổi dạng bào chế, sử dụng tá dược phù hợp làm thay đổi đặc tính, tăng sinh khả dụng

Năm 2012, Liu R và cộng sự [34] đã bào chế hệ nano lipid rắn chứa MGF bằng phương pháp siêu âm, thu được tiểu phân có KTTB dưới 100 nm, thế zeta khoảng -30 mV Đặc biệt, tính thấm qua giác mạc của MGF được tăng lên 4,31 lần

Tá dược lipid được sử dụng là glyceryl monostearat, Gelucire 44/ 14, Miglyol 812; các chất diện hoạt thân nước gồm Tween 80 và Labrasol Khi đem đông khô với mannitol, hệ lipid rắn có thể ổn định trong 3 tháng

β-cyclodextrin và các dẫn chất được biết đến là những tá dược có tác dụng

tăng độ tan mạnh do khả năng tạo phức lồng với tiểu phân dược chất Theo hướng này, tác giả Yang X [61] đã tạo ra được các phức hợp với MGF có độ tan, tính thấm qua hàng rào sinh học và sinh khả dụng tăng lên nhiều lần so với nguyên liệu Sau đó, năm 2013, Wang X và cộng sự [57] nhận thấy natri deoxycholat hoặc carbopol 974P đều làm tăng sinh khả dụng đường uống của MGF trên chuột lên 4

và 7 lần tương ứng Các kết quả nghiên cứu đối với chất gây thấm khác như Labrasol và Solutol HS 15 ở nồng độ phù hợp đều làm tăng hệ số thấm của mangiferin [33]

Biện pháp tạo muối với anion hoặc cation vô cơ cũng có tác dụng cải thiện

độ tan cho MGF Muối canxi mangiferin bào chế được làm tăng sinh khả dụng của mangiferin khi thử nghiệm trên chuột, bên cạnh đó các muối chứa gốc sulfat, đặc biệt là mangiferin heptasulfat có độ ổn định cao, khả năng hòa tan tốt [18],[52]

- Dược chất ở dạng rắn hoặc tan một phần trong môi trường phân tán

- Dung môi: thường dùng là nước pha tiêm, có thể có đồng dung môi

- Các chất gây thấm, chất tạo độ nhớt, chất tăng thế zeta

- Chất điều chỉnh đẳng trương, pH, chất bảo quản [3],[7]

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng và biện pháp đảm bảo độ ổn định

1.2.2.1 Độ ổn định vật lý

a Sự sa lắng và kết tụ

Theo phương trình Stokes, hiện tượng hỗn dịch sa lắng xảy ra khi tỉ trọng của tiểu phân lớn hơn tỉ trọng môi trường phân tán Có 2 kiểu sa lắng gồm: (1) sa lắng chậm, trong đó tiểu phân sẽ tạo thành “bánh” ở đáy chai lọ, và (2) kết bông, trạng thái các tiểu phân kết tụ thành đám và sa lắng rất nhanh, hệ dễ phân tán lại nhưng KTTP khó duy trì như ban đầu Kết tụ là hiện tượng các tiểu phân trong hỗn dịch tương tác hấp dẫn với nhau, làm tăng kích thước Ngoài ra, các tiểu phân còn tăng kích thước do sự kết tụ Oswald hoặc do quá trình kết tinh Sự chênh lệch về nồng độ dược chất bão hòa ở lớp khuếch tán của các tiểu phân có kích thước khác nhau khiến tiểu phân nhỏ hơn dần bị hòa tan, tiểu phân lớn sẽ tăng thêm KT Hai hiện tượng kết tụ và sa lắng thường xảy ra đồng thời [14],[49]

Để giảm hiện tượng trên, có thể sử dụng các chất ổn định gồm polyme và chất diện hoạt Khi phối hợp, chất ổn định làm giảm sức căng bề mặt, tạo cấu trúc không gian cồng kềnh quanh tiểu phân, thay đổi điện thế zeta của tiểu phân và tăng

độ nhớt của hệ, kết quả là giảm tương tác giữa các tiểu phân [54] Ngoài ra, tá dược

lipid hoặc một số chất có thể trộn lẫn với tiểu phân nhưng không thân với môi trường sẽ ngăn được quá trình kết tụ Oswald, ví dụ miglyol và 1 - decanol có tác dụng bảo vệ tiểu phân của các dược chất felodipin, nifedipin, bicalutamid [31]

Vai trò của chất ổn định đến việc tạo cấu trúc không gian bảo vệ tiểu phân được thể hiện qua hình 1.1 [41] Hỗn dịch bền nhất ở trường hợp (c), chất ổn định liên kết với tiểu phân tại một số vùng tương tác đủ mạnh, phần còn lại hướng ra môi trường, tạo cấu trúc không gian cồng kềnh bảo vệ tiểu phân

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của chất ổn định khi tương tác với bề mặt tiểu phân

(a) trải dài, (b) tạo thành cuộn, (c) tương tác tạo vòng

Trong các tá dược ổn định HPC, PVP K30, Pluronic F127 và F68, PEG, natri lauryl sulfat và benzethoinum clorid [29], Pluronic F68 thể hiện vai trò tốt nhất

do phân tử có những nhóm thân dầu polypropylen glycol có khả năng hấp phụ mạnh lên bề mặt tiểu phân dược chất Trong 2 loại Pluronic kể trên, khối lượng phân tử của F127 lớn hơn khiến khả năng hấp phụ lên cùng một diện tích bề mặt tiểu phân giảm đi so với F68, dẫn đến tác dụng ổn định hỗn dịch kém hơn Sự khác nhau về

số đơn vị monome giữa PVP K17 và PVP K12 dẫn tới vai trò ổn định khác nhau cũng được ghi nhận trong nghiên cứu của Pongpeerapat và đồng nghiệp [43] Hiện nay các polyme ổn định đều có cấu trúc hỗn tạp nhằm tăng tương tác với cả tiểu phân và môi trường phân tán [42] Một số cặp phối hợp polyme và dược chất cho tác dụng tốt, không phụ thuộc nhiều vào chất diện hoạt là HPC/ ibuprofen, PEG/ glimepirid, HPC/ hydrocortison acetat, HPC/ paclitaxel, PVP/ nifedipin, PVP/ hydrocortison acetat, và F127/ hydrocortison acetat [29]

Để thay đổi lực đẩy tĩnh điện giữa các tiểu phân, có thể sử dụng các chất ổn định có độ phân ly cao hoặc có khả năng solvat hóa Khi phối hợp các chất diện hoạt hoặc polyme anion làm tăng độ lớn điện thế zeta, qua đó làm tăng độ bền của tiểu phân [1],[11],[17] Tuy nhiên, việc tạo điện tích dương cho hệ nano tinh thể đa

phần ít gặp, các tá dược benzethonium clorid hay benzalkonium clorid không tăng tác dụng bảo vệ hệ nano so với trước khi phối hợp [59] Ngoài ra, các polyme ion phân ly mạnh do đó độ tan trong nước lớn, có thể giảm hấp phụ lên tiểu phân [21]

Trong thực tế, các nhà nghiên cứu thường sử dụng nhiều chất ổn định để kết hợp cả 2 cơ chế độ bền tĩnh điện hoặc cấu trúc không gian [11] Tuy nhiên sự có mặt của chất diện hoạt ở nồng độ cao có thể làm tăng quá trình phản hấp phụ polyme khiến cấu trúc không gian bảo vệ tiểu phân bị phá vỡ, hệ kém bền [29] Ngoài ra, nếu polyme hấp phụ quá mạnh lên bề mặt hoặc độ nhớt của hệ lớn có thể làm giảm điện thế zeta đo được, nhưng tùy từng trường hợp hệ có thể vẫn duy trì được trạng thái bền về động học [35]

Bên cạnh việc dùng các tá dược ổn định, thay đổi tỉ trọng tiểu phân có thể duy trì khá hiệu quả độ bền hỗn dịch trong quá trình bảo quản Sử dụng phương pháp thích hợp, nhóm tác giả Tam J M và cộng sự [51] đã bào chế được hỗn dịch xông hít định liều itraconazol có độ ổn định KTTP trong 2 năm Các thanh nano (nanorods) được tạo ra có độ xốp lớn, tỉ trọng thấp, khi có mặt HFA (hydrofluoroalkan), tương tác Van der Waals giữa các tiểu phân rất mạnh khiến các tiểu phân không có sự sa lắng hay kết tụ lại Tác giả Dellamary L.A cũng đạt được kết quả tương tự cho việc chế tạo hỗn dịch thuốc xông hít có độ bền động học cao bằng cách thay đổi tỉ trọng tiểu phân phân tán [20] Tuy nhiên phương pháp này khá hạn chế ứng dụng cho hỗn dịch nano tinh thể do để tạo cấu trúc có độ xốp cao thường phải có điều kiện đặc biệt về dược chất và môi trường phân tán

b Sự chuyển dạng thù hình

Tùy thuộc vào công thức và kĩ thuật bào chế mà các tiểu phân trong hỗn dịch nano tồn tại ở dạng cấu trúc khác nhau Thông thường, phương pháp phân tán sử dụng năng lượng lớn sẽ tạo ra một phần tiểu phân ở dạng đa hình hoặc vô định hình; phương pháp kết tụ cho sản phẩm có cấu trúc phụ thuộc vào tốc độ kết tủa và sự có mặt của tinh thể trong hệ Các dạng vô định hình hay đa hình có năng lượng lớn, thường chuyển dần thành dạng tinh thể có mức năng lượng thấp, khiến cho hệ không ổn định về mặt động học [59]

Việc kiểm soát các thông số kĩ thuật và công thức bào chế, đặc biệt là những chất ổn định ở nồng độ tạo micell, giúp kiểm soát cấu trúc tiểu phân tạo ra từ đó hạn chế sự chuyển dạng thù hình [48] Theo Lindfors L và đồng nghiệp, một số tá dược không tan trong nước có thể làm giảm hiện tượng kết tụ Oswald dẫn tới giảm hiện tượng chuyển dạng cấu trúc [31] Ngoài ra, điều kiện bảo quản thích hợp có thể hạn chế quá trình trên, ví dụ hỗn dịch acid all - trans retinoic ở dạng vô định hình ổn định trên 6 tháng ở nhiệt độ 4o

C [65]

c Sự ổn định trong trạng thái hóa rắn

Độ bền của hỗn dịch có thể được cải thiện nếu hỗn dịch được loại nước sau khi bào chế Có thể dùng biện pháp đông khô, phun sấy, tạo pellet hoặc vi nang nhằm đạt được mục đích trên [53] Một số sản phẩm rắn hóa từ hỗn dịch nano đang được lưu hành như Danazol, Loviride (đông khô), Nifedipine (phun sấy)

Đông khô

Đông khô là biện pháp hay được dùng để ổn định KTTP của các hệ tiểu phân nano nói chung Do sự khác nhau về bản chất hệ phân tán, quá trình đông khô hỗn dịch có những điều kiện khác với đông khô dung dịch

Ở quá trình đông lạnh, trong mẫu xảy ra sự tách pha giữa tinh thể nước đá với pha chứa tiểu phân, mật độ tiểu phân tăng lên khiến hiện tượng kết tụ dễ xảy ra

Do vậy nồng độ tiểu phân, tá dược tạo khung và các thành phần khác ảnh hưởng trực tiếp đến sự tăng KTTP Nhìn chung, công thức với nồng độ dược chất nhỏ và nồng độ tá dược đông khô lớn sẽ ổn định tốt KTTP [9] Bên cạnh đó, điều kiện làm lạnh cũng có tác động mạnh đến sự kết tụ tiểu phân Ở đa số các hệ nano, nếu làm lạnh ở tốc độ nhanh sẽ tạo ra các tinh thể nước đá nhỏ, quá trình thăng hoa sẽ giảm đáng kể lực tác động lên tiểu phân, giảm kết tụ [10]

Trong quá trình làm khô mẫu, nước có thể tái hòa tan làm tăng hiện tượng kết tụ, do đó cần sử dụng thêm tá dược bảo vệ nhằm tạo nhiều liên kết hydro với tiểu phân, giúp ổn định tiểu phân Tiểu phân có cấu trúc vô định hình có khả năng liên kết với chất bảo vệ tốt hơn [9] Các chất bảo vệ được dùng là polyme và chất diện hoạt, trong đó PVA và Poloxamer được dùng nhiều hơn cả Tuy nhiên, một số

công thức không cần sử dụng thêm tá dược tạo khung cũng như tá dược bảo vệ, như hỗn dịch nano tinh thể naproxen có arginin hydroclorid và HPC, KTTP sau đông khô ở khoảng 300 - 600 nm ít thay đổi so với ban đầu [11]

Nhiệt độ sấy sơ cấp và sấy thứ cấp đều ảnh hưởng đến độ bền của hệ thông qua ảnh hưởng đến cấu trúc của bánh và lượng nước hấp phụ Thông số này được điều chỉnh tương tự như việc đông khô dung dịch, trong đó nhiệt độ mẫu ở giai đoạn sấy sơ cấp phải nhỏ hơn nhiệt độ phá vỡ (Tcollapse) hoặc nhiệt độ eutecti (Teutecti) của hệ Thời gian và nhiệt độ sấy thứ cấp đủ để giảm tối đa hàm ẩm trong sản phẩm

1.2.2.2 Độ ổn định hóa học

Độ bền hóa học gồm có độ ổn định của dược chất và tương kị hóa học giữa các thành phần trong công thức Các dược chất không ổn định hóa học thường phải dùng các biện pháp khác nhau, tùy thuộc vào phản ứng phân hủy của dược chất khi bảo quản [3]

Sự phân hủy dược chất trong hỗn dịch

Thông thường, quá trình phân hủy dược chất trong hỗn dịch là động học giả

bậc không, diễn ra chủ yếu ở pha dung dịch Lượng dược chất M còn lại ở thời điểm

t được biểu thị bởi phương trình: M M0k VC t1 S

Trong đó, k1: hằng số tốc độ phân hủy dược chất trong dung dịch, M0: lượng

dược chất ban đầu, C S : độ tan của dược chất, V: thể tích của hỗn dịch [2]

Trong thực tế, nếu dược chất có độ tan kém (< 1 mg/ ml) hoặc nồng độ thuốc đưa vào hỗn dịch đủ lớn thì sự phân hủy trong hỗn dịch xảy ra chậm Dung dịch trong methanol của paclitaxel phân hủy chỉ sau 48 giờ, tuy nhiên hỗn dịch nano sử dụng Pluronic F68 bền về mặt hóa học trong 4 năm khi bảo quản ở 4o

C - 8oC [36] Đối với các hỗn dịch đã được loại nước thì độ ổn định được duy trì tốt trong thời gian bảo quản ở dạng rắn [59]

1.3 PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA DO THAY ĐỔI DUNG MÔI

1.3.1 Động học quá trình kết tủa

Quá trình kết tủa chất tan từ dung dịch quá bão hòa được mô tả gồm các bước: tạo mầm, khuếch tán chất tan và phát triển mầm Tốc độ các quá trình được tính như sau [15]:

độ và hằng số tốc độ các quá trình tạo mầm, khuếch tán và phát triển mầm; C i , C * , C

là nồng độ chất tan trên bề mặt tiểu phân, nồng độ chất tan bão hòa và nồng độ chất

tan trong hệ tương ứng a và b là các hệ số với khoảng dao động tương ứng là 5 - 18

và 1 - 3, giá trị b tăng khi tăng nhiệt độ

Đối với quá trình kết tinh, khi dung dịch ở trạng thái quá bão hòa, các phân

tử chất tan dần kết tụ tạo mầm, tới khi đạt được kích thước nhất định cân bằng với

sự hòa tan thì dừng lại Tốc độ tạo mầm B có thể được tính bởi công thức sau:

 G cr kT

e K

B 1  /

 2 2

2

2 3

)ln(

3

16

r cr

S T k



Trong đó: K 1 là hằng số, k là hằng số Bonzman, T là nhiệt độ tuyệt đối, ΔG cr

là năng lượng tự do tới hạn của quá trình tạo mầm, υ là thể tích phân tử trong mầm,

γ là năng lượng liên bề mặt tiểu phân - dung dịch, Sr là mức độ quá bão hòa được tính bằng tỉ số giữa nồng độ dược chất với độ tan của dược chất trong hệ [19]

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới kích thước tiểu phân

Để có kích thước tiểu phân đủ nhỏ, cần tăng tốc độ tạo mầm và giảm tốc độ phát triển mầm Các yếu tố thuộc về công thức, kĩ thuật bào chế đều ảnh hưởng tới

2 quá trình trên, do đó tác động tới KTTP tạo ra [8],[48],[60] Hình 1.2 minh họa ảnh hưởng của các yếu tố trong các giai đoạn khác nhau

Hình 1.2: Sơ đồ các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình kết tủa và KTTP

Phương pháp kết tủa do thay đổi dung môi thường được tiến hành với pha phân tán là dung dịch dược chất trong dung môi (solvent), môi trường phân tán là

nước (antisolvent) Để giảm KTTP tạo ra, có thể sử dụng các biện pháp sau:

Tăng độ quá bão hòa

- Giảm độ tan trong hệ bằng cách: tăng tỉ lệ pha nước/ pha dung môi, giảm

độ phân cực của dược chất (tạo tiền thuốc, phức hoặc cặp ion), giảm nhiệt độ pha nước Nếu hạ nhiệt độ quá thấp, độ nhớt của hệ thay đổi mạnh làm giảm linh độ của tiểu phân chất tan, tốc độ tạo mầm giảm

- Tăng nồng độ dược chất trong hệ bằng cách: tăng nồng độ dược chất trong dung môi hoặc tăng thể tích pha dung môi Tuy nhiên khi số lượng mầm đủ lớn, sự

có mặt của nhiều chất tan sẽ làm tăng tốc độ phát triển mầm, KTTP tăng

- Tạo độ quá bão hòa đồng nhất trong hệ bằng cách: phối hợp 2 pha với tốc

độ nhanh, sử dụng thiết bị làm tăng khuấy trộn ở mức micro Cần chú ý tốc độ khuấy trộn cao quá ngưỡng có thể gây tăng KTTP

- Thay đổi tốc độ khuếch tán chất tan bằng cách: thay đổi tốc độ khuấy trộn hoặc thay đổi độ phân cực của dung môi

- Sử dụng thiết bị năng lượng cao, ví dụ máy siêu âm cầm tay tạo nhiệt độ và

áp suất cục bộ tới 5000 K và 500 atm, làm thay đổi độ quá bão hòa cục bộ, tăng tốc

độ tạo mầm, tăng khuấy trộn

1.3.3 Một số kĩ thuật kết tủa để bào chế tiểu phân nano

1.3.3.1 Phương pháp thay đổi dung môi

Đây là kĩ thuật kết tủa đơn giản nhất, trong đó pha dung môi chứa dược chất được phối hợp vào môi trường phân tán, sử dụng thiết bị khuấy trộn phù hợp Dung môi có thể được loại đi bằng nhiều cách như khuấy từ, nâng nhiệt độ pha nước khi phối hợp hoặc bay hơi trong chân không

Siêu âm

Lực siêu âm giúp phân tán đều 2 pha, tăng tốc độ tạo mầm Có thể sử dụng thiết bị siêu âm đầu dò hoặc siêu âm bể phối hợp với khuấy trộn

Một số thiết bị cải tiến

Các thiết bị này tạo ra sự tiếp xúc giữa pha dung môi và pha nước ở mức micro, tiểu phân sinh ra có kích thước nhỏ

Thiết bị vi hóa lỏng (hình 1.3a) 2 pha chất lỏng được đưa vào qua 2 nhánh

của thiết bị, có thể điều chỉnh được góc tạo bởi 2 nhánh, đường kính lòng nhánh và

tốc độ phối hợp của từng pha Tiểu phân hình thành ở lớp khuếch tán giữa 2 chất lỏng trong lòng thiết bị Với phương pháp này, tác giả Ali H.S.M và cộng sự [12] đã bào chế được hỗn dịch hydrocortison với KTTP khoảng 300 nm

Hình 1.3: (a) Thiết bị vi hóa lỏng, (b) thiết bị ly tâm cao tốc

Thiết bị ly tâm cao tốc (hình 1.3b): pha nước và pha dung môi được đưa vào

thiết bị theo 2 đường dẫn khác nhau và được đẩy qua các vòi phun Dịch phun dưới tác động của lực ly tâm sẽ tạo ra lớp màng mỏng, tại đó xảy ra quá trình kết tủa Tốc

độ quay lớn làm tiểu phân sinh ra có kích thước nhỏ và ly tâm ra xa Thiết bị này đã được dùng để bào chế acid benzoic kích thước dưới 50 nm từ natri benzoat và acid hydro cloric

Thiết bị vòi phun có cấu tạo gồm 2 vòi chảy ngược hướng, dòng chất lỏng

bắn trực tiếp vào nhau Tốc độ phun dịch, thể tích phun đều ảnh hưởng đến KTTP tạo ra [15]

1.3.3.2 Phương pháp kết tủa với dung môi siêu tới hạn

Chất lỏng CO2 siêu tới hạn (supercritical fluid CO2 - SFCO2) được sử dụng với vai trò là dung môi hòa tan hay môi trường phân tán phụ thuộc vào độ tan của dược chất trong SFCO2 Nếu dược chất tan trong SFCO2 (có thể thêm đồng dung môi), thay đổi áp suất khi đưa dung dịch qua vòi phun sẽ tạo được tiểu phân kết tủa

Nếu dược chất không tan trong SFCO2, hòa tan dược chất trong dung môi khác và phối hợp 2 pha Phương pháp này có thể tạo được tiểu phân có kích thước rất nhỏ như amoxicilin (118 nm), ampicillin (45 nm), rifampicin (60 - 100 nm) [15],[48]

1.3.3.3 Phương pháp bốc hơi dung môi

a Phun sấy

Trong kĩ thuật phun sấy, pha dung môi được đẩy qua vòi phun tạo thành giọt chất lỏng với kích thước nhỏ, khi vào vùng nhiệt độ cao dung môi sẽ bay hơi tạo thành tiểu phân nano Bộ phận vòi phun được cải tiến với nhiều dạng, có thể rung hoặc siêu âm để kích thước giọt tạo ra đủ nhỏ Khu vực thu hồi tiểu phân có thể thay đổi bằng cơ chế tích điện để tăng hiệu suất với những tiểu phân có kích thước nhỏ [15]

b Phun tĩnh điện

Khi cho pha dung môi đi qua vùng điện trường với điện tích đủ để thắng được sức căng bề mặt sẽ tạo thành các giọt chất lỏng Dung môi bay hơi để lại tiểu phân nano với phân bố kích thước rất nhỏ Phương pháp có thể tạo ra tiểu phân insulin có kích thước 88 - 117 nm và đảm bảo hoạt tính sinh học [16]

c Phun đông lạnh

Pha dung môi được phun vào nitơ lỏng, chất tan nhanh chóng kết tủa tạo ra các tiểu phân có cấu trúc vô định hình với độ xốp cao và kích thước nhỏ Sử dụng phương pháp này, nhóm tác giả Hu J và đồng nghiệp [27] đã tạo được tiểu phân nano danazol với chất bảo vệ PVP K‐15 có KTTP khoảng 100 nm, diện tích bề mặt 89,8 m2/ g

Chương 2 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ

2.1.1 Hóa chất, nguyên liệu

30 Natri hydroxid Phân tích Trung Quốc

CAT - Đức

Europe

Mỹ

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp bào chế tiểu phân nano MGF bằng cách thay đổi dung môi

- Hòa tan dược chất vào DMSO

- Ngâm trương nở polyme trong 24 giờ và hòa tan chất diện hoạt vào nước

- Phối hợp nhanh pha dung môi vào pha nước đã làm lạnh ở 5 - 10oC, duy trì nhiệt độ của hệ 5 - 10oC bằng nước đá Sử dụng lực phân tán phù hợp

- Khi hệ trở nên mờ đục, tiếp tục duy trì lực phân tán để thu tủa bông, tủa thu được chứa tiểu phân nano MGF

2.2.2 Phương pháp xây dựng công thức và phương pháp bào chế tiểu phân nano MGF

2.2.2.1 Lựa chọn thiết bị và thông số kĩ thuật

- Đánh giá ảnh hưởng của thiết bị phân tán, thời gian phân tán, thứ tự phối hợp, tốc độ phối hợp 2 pha, cách thức thu hồi tủa đến đặc điểm tiểu phân MGF

- Tiêu chí lựa chọn: KTTP MGF khi bào chế và sau khi thu hồi nhỏ (< 500 nm), quá trình bào chế thuận lợi

2.2.2.2 Xây dựng công thức bào chế tiểu phân nano MGF

a Lựa chọn dung môi

- Đánh giá ảnh hưởng của loại dung môi, nồng độ MGF trong dung môi, tỉ lệ dung môi đến KTTP hỗn dịch và quá trình bào chế

- Tiêu chí lựa chọn: KTTP MGF nhỏ (< 500 nm), quá trình bào chế thuận lợi

b Lựa chọn chất diện hoạt, polyme

- Đánh giá ảnh hưởng của loại tá dược và tỉ lệ tá dược đến đặc điểm hỗn dịch khi bào chế, KTTP và thế zeta của tiểu phân MGF tạo ra

- Tiêu chí lựa chọn: KTTP MGF nhỏ (< 500 nm), tủa MGF dễ phân tán, hiệu suất cao

2.2.3 Phương pháp xây dựng công thức hỗn dịch nhỏ mắt nano MGF

2.2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới độ bền động học của hỗn dịch

- Yếu tố khảo sát: nồng độ MGF, loại và nồng độ polyme, loại và nồng độ chất diện hoạt, chất điện ly, tá dược đông khô

- Tiêu chí đánh giá: phân bố KTTP, thế zeta, khả năng phân tán lại của hỗn dịch sau khi bảo quản trong thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng

2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới độ bền hóa học của hỗn dịch

- Yếu tố khảo sát: giá trị pH, chất chỉnh pH, chất chống oxy hóa, nhiệt độ

- Tiêu chí đánh giá: hàm lượng MGF còn lại tại các thời điểm khác nhau sau khi bảo quản mẫu trong thời gian ngắn, xác định bằng phương pháp HPLC

2.2.4 Phương pháp đông khô

- Thiết bị: Christ Alpha 1 - LD, Labconco Triad

- Chuẩn bị mẫu: hút 3ml mẫu cho vào lọ thủy tinh, đậy hờ bằng nắp cao su

xẻ rãnh (tá dược tạo khung sử dụng: mannitol)

- Chương trình chạy:

+ Nhiệt độ tiền đông: -70oC, lưu 8 giờ

+ Nhiệt độ sấy sơ cấp: -15oC, tốc độ gia nhiệt: 0,25oC/ phút, lưu 24 giờ

+ Nhiệt độ sấy thứ cấp: 30oC, tốc độ gia nhiệt: 0,25oC/ phút, lưu 8 giờ

- Điều kiện sắc ký

+ Thiết bị: hệ thống HPLC Agilent 1200, detector UV - VIS

+ Cột: Inertsil ODS3 - C18 4,6 x 250 mm, hạt nhồi 5 μm + Pha động: acetonitril : dung dịch acid acetic 3% (16 : 84) + Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút

+ Bước sóng: 254 nm + Thể tích tiêm: 10 µl

- Tính toán kết quả: dựa vào đường chuẩn và diện tích pic trên sắc ký đồ

2.2.6 Phương pháp xác định độ tan của MGF

- Khuấy từ liên tục một lượng dư MGF trong 25 ml môi trường thử ở nhiệt

độ 25 - 30oC

- Sau các khoảng thời gian khác nhau 24 giờ, 48 giờ ly tâm hỗn hợp với tốc

độ 6.000 vòng/ phút trong 10 phút, hút phần dịch trong lọc qua màng PTFE 0,2 µm rồi định lượng bằng phương pháp quang phổ UV - VIS, pha loãng nếu cần Tiến hành tới khi nồng độ của MGF trong dịch sau lọc gần như không đổi

2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng nước bằng chuẩn độ Karl Fisher

- Thiết bị: máy chuẩn độ đo thế Metrohm

- Thuốc thử: Titrant 5 + Solvent - Merck

- Tiến hành :

+ Xác định đương lượng nước của thuốc thử: dựa trên thể tích thuốc thử phản ứng với lượng chất gốc natri tartrat dihydrat tương ứng Tiến hành

3 lần, lấy kết quả trung bình

+ Xác định hàm lượng nước của mẫu thử: cân chính xác một lượng mẫu thử, hòa tan rồi chuẩn độ nhanh bằng thuốc thử Dựa vào đương lượng nước và thể tích thuốc thử tính được hàm lượng nước của mẫu thử Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình

2.2.8 Phương pháp xác định phân bố KTTP, thế zeta

- Thiết bị: hệ thống đo KTTP và thế zeta Zetasizer ZS90

- Chuẩn bị mẫu: pha loãng mẫu cần đo với nước cất 2 lần, độ pha loãng phù hợp sao cho hệ số count rate từ 200 - 400 kps

- Xác định phân bố kích thước tiểu phân:

+ Phương pháp đo: tán xạ ánh sáng động

+ Kết quả đo là phân bố KTTP theo thể tích, gồm: KTTP trung bình (theo đường kính, nm), chỉ số đa phân tán PDI Tỉ lệ tiểu phân có kích thước trên 1106 nm được xác định bằng tổng phần trăm tiểu phân có kích thước lớn hơn hoặc bằng 1106 nm trên đồ thị phân bố kích thước theo thể tích

- Đo thế zeta :

+ Phương pháp đo: điện di tán xạ ánh sáng

+ Kết quả đo là thế zeta (mV), lấy giá trị thế zeta trung bình

2.2.9 Phương pháp phân tích nhiễu xạ tia X

- Thiết bị: hệ thống phân tích nhiễu xạ tia X D8 Advance Bruker

- Mẫu đo: bột nguyên liệu hoặc mẫu bào chế đã được làm khô

- Quét phổ nhiễu xạ tia X với các thông số:

+ Nhiệt độ: 25oC

+ Khoảng đo: góc đo 2 từ 10o đến 50o+ Độ phân giải: 0,030o

+ Tốc độ quét góc 2: 0,030o/ giây Kết quả thu được là cường độ nhiễu xạ theo góc 2

2.2.10 Phương pháp quét nhiệt lượng vi sai

- Thiết bị: hệ thống DSC 1 StarSystem - Metler Toledo

- Mẫu đo: bột nguyên liệu hoặc mẫu bào chế đã được làm khô

Cân chính xác khoảng 3 - 6 mg mẫu cho vào đĩa phân tích

- Chương trình:

+ Khoảng quét nhiệt: 30oC - 320oC + Tốc độ gia nhiệt: 10oK/ phút + Tốc độ khí nitơ: 50,0 ml/ phút

Kết quả thu được là giản đồ biểu thị sự phụ thuộc nhiệt lượng cung cấp cho mẫu theo nhiệt độ

2.2.11 Phương pháp đo độ nhớt

- Thiết bị: nhớt kế Oswald GA125S 5816

- Mẫu đo: hỗn dịch bào chế được; nước cất 2 lần

- Điều kiện: nhiệt độ 20±0,1oC

- Tiến hành: dùng pipet dài cho khoảng 10 ml mẫu đo vào nhớt kế Dùng quả bóp cao su đẩy chất lỏng lên bầu chứa, rồi để chảy tự do Ghi thời gian chảy của chất lỏng giữa 2 vạch đo của nhớt kế Tiến hành 5 lần, lấy giá trị trung bình

- Kết quả đo:

O H

O H t

2 2

2.2.12 Phương pháp đánh giá kích ứng trên mắt thỏ

- Nơi tiến hành: Khoa Dược lý - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương

- Mẫu thử và mẫu chứng:

+ Mẫu chứng: dung dịch tiêm truyền NaCl 0,9%

+ Mẫu thử: hỗn dịch MGF bào chế được

2.2.12.1 Động vật thí nghiệm

- Thỏ khỏe mạnh, cả 2 giống, cân nặng khoảng 2,0 - 3,0 kg Số lượng: 3 con

- Thỏ được nuôi ổn định 1 tuần theo điều kiện phòng thí nghiệm trước khi tiến hành nghiên cứu Thỏ được cho ăn và uống nước đầy đủ trong suốt quá trình thử nghiệm Trước thử nghiệm 24 giờ, kiểm tra bằng mắt thường 2 mắt của các thỏ thử nghiệm để đảm bảo không có các dấu hiệu bất thường

2.2.12.2 Phương pháp thử nghiệm

a Thử nghiệm sơ bộ

Thăm dò ở mức liều tối đa: dùng 01 thỏ, nhỏ vào mắt chứng (trái) 0,1 ml dung dịch tiêm truyền NaCl 0,9%, song song nhỏ vào mắt thử (phải) 0,1 ml mẫu thử Quan sát ngay sau khi nhỏ mắt và ở các thời điểm khác nhau sau khi nhỏ thuốc, đánh giá mức độ tổn thương, các phản ứng kích ứng nghiêm trọng, sự khác biệt giữa mắt nhỏ mẫu thử và mắt chứng ở mức liều tối đa Trên cơ sở kết quả thu được xác định liều thử nghiệm chính thức

b Thử nghiệm chính thức

- Mức liều thử nghiệm: xác định từ thử nghiệm sơ bộ

- Tiến hành thử nghiệm trên 3 thỏ: đánh dấu mắt thử và mắt chứng, nhỏ cùng một liều mẫu thử hoặc mẫu chứng vào mỗi bên mắt Giữ hai mí mắt thỏ trong khoảng 1 giây để mẫu thử không bị chảy ra ngoài

- Lịch theo dõi: quan sát cả hai bên mắt thỏ sau 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

và sau 7 ngày từ khi nhỏ mẫu thử Nếu có tổn thương nghiêm trọng có thể kéo dài thêm thời gian quan sát đến 21 ngày

- Tại các thời điểm, quan sát các biểu hiện bất thường trên giác mạc, kết mạc, mống mắt, phản ứng của mắt với ánh sáng, so sánh giữa mắt thử với mắt chứng

- Chấm điểm và phân loại những dấu hiệu quan sát được theo bảng phân loại

hệ thống tổn thương mắt (theo OECD 405, được trình bày ở phụ lục 3) Nếu có bất

kì mục nào ở các thời điểm nghiên cứu được đánh giá điểm (≥1 điểm), mắt được coi

là có kích ứng

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CHUẨN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG MANGIFERIN

3.1.1 Phương pháp quang phổ UV

Ghi phổ hấp thụ của dung dịch chuẩn MGF có nồng độ khoảng 20 µg/ ml, dung môi HCl 1% : aceton (1 : 1), dải sóng 200 - 400 nm Trên phổ đồ thu được chúng tôi nhận thấy có 4 cực đại trùng với 4 cực đại được mô tả trong Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận mangiferin

Pha một dãy dung dịch chuẩn chứa MGF ở các nồng độ khác nhau trong khoảng 2,00 - 40,00 µg/ ml, sử dụng dung môi HCl 1% : aceton (1 : 1) Đo độ hấp thụ của các dung dịch thu được tại bước sóng 368 nm, mẫu trắng là hỗn hợp HCl 1% : aceton (1 : 1) Kết quả được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1

Bảng 3.1: Độ hấp thụ của các dung dịch MGF nồng độ khác nhau

Hình 3.1: Tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ MGF trong dung dịch

Kết quả thực nghiệm cho thấy giữa độ hấp thụ và nồng độ có mối quan hệ tuyến tính theo phương trình y = 0,0302x - 0,0006 với hệ số tương quan R2 = 0,9998 Quét phổ của mẫu hỗn hợp tá dược trong cùng điều kiện với mẫu chuẩn ở

y = 0,0302x - 0,0006 R² = 0,9998

0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000

0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00

Nồng độ (µg/ ml)

Độ hấp thụ

trên, chúng tôi nhận thấy mẫu tá dược không hấp thụ tại bước sóng 368 nm Như vậy có thể dùng phương pháp UV - VIS để xác định hàm lượng MGF trong mẫu chế phẩm bào chế được cũng như xác định nồng độ MGF ở các mẫu định lượng có nồng độ MGF cao

3.1.2 Phương pháp HPLC

3.1.2.1 Độ chọn lọc

Tạo mẫu định lượng gồm mẫu chuẩn và mẫu thử (chế phẩm bào chế được), phân tích theo phương pháp HPLC đã nêu ở mục 2.2.5 Trên sắc kí đồ của mẫu thử (hình 3.2b), tại thời gian lưu khoảng 7,5 phút có 1 píc duy nhất và cân đối, trùng thời gian lưu với píc trong mẫu chuẩn (hình 3.2a) Như vậy, phương pháp định lượng chọn lọc với MGF

Dựa vào kết quả thu được, chúng ta có thể nhận thấy giữa diện tích píc và nồng độ có mối tương quan tuyến tính theo phương trình hồi quy là y = 36,045x + 0,4001 với hệ số R2 = 1 Vì vậy, phương pháp này có thể sử dụng để định lượng

nồng độ MGF trong các mẫu bào chế, các mẫu có nồng độ nhỏ ( > 1,0 µg/ ml), ngoài

ra còn dùng để kiểm tra sự phân hủy của MGF trong các mẫu nghiên cứu

Bảng 3.2: Diện tích píc ở các mẫu có nồng độ MGF khác nhau

Diện tích píc

Hình 3.3: Tương quan giữa diện tích píc và nồng độ MGF trong dung dịch

3.2 XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP BÀO CHẾ TIỂU PHÂN NANO MANGIFERIN

Với mục tiêu bào chế được hỗn dịch nhỏ mắt nano chứa mangiferin, chúng tôi định hướng sử dụng phương pháp thay đổi dung môi nhằm kết tủa MGF từ dung dịch quá bão hòa Để đảm bảo tiểu phân tạo ra có kích thước nhỏ, cần sử dụng các biện pháp phân tán và chất bảo vệ phù hợp

3.2.1 Xác định độ tan của mangiferin trong một số dung môi

Độ tan của MGF trong một số dung môi được xác định theo phương pháp đã được nêu ở mục 2.2.6 Kết quả được trình bày trong bảng 3.3

y = 36,045x + 0,4001 R² = 1

0 300 600 900 1200 1500

Bảng 3.3: Độ tan của MGF trong một số dung môi

Nhận xét: Độ tan của MGF trong hầu hết các dung môi đều rất thấp (< 1,5

mg/ ml), trừ DMSO Độ tan của MGF trong DMSO là 213,983 mg/ ml Do vậy chúng tôi chọn DMSO làm môi trường hòa tan MGF để thực hiện biện pháp kết tủa

do thay đổi dung môi Môi trường phân tán được lựa chọn là nước do có độ tan gần như thấp nhất trong số các dung môi khảo sát (0,106 mg/ ml)

3.2.2 Xây dựng phương pháp kết tủa MGF do thay đổi dung môi

3.2.2.1 Khảo sát kĩ thuật kết tủa

Để xây dựng phương pháp bào chế, trước tiên chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm khảo sát: phối hợp nhanh dung dịch MGF 20% trong DMSO vào nước để được các nồng độ MGF khác nhau, thể tích hỗn hợp là 20 ml, sử dụng máy khuấy từ với tốc độ đặt ở mức 2 để khuấy trộn Khi mới phối hợp, các hỗn hợp đều trong và không có tiểu phân nhìn thấy được Sau 1 khoảng thời gian, các hỗn hợp trở nên mờ đục và có đặc điểm khác nhau Kết quả được trình bày trong bảng 3.4

Bảng 3.4: Đặc điểm hỗn dịch khi bào chế với nồng độ MGF khác nhau

bông hoàn toàn, hệ đặc nhớt; mật độ tiểu phân lớn

bông hoàn toàn

bông hoàn toàn

Khi quan sát tủa bông thu được trong các CT với nồng độ MGF 0,2 - 2% trên kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy tủa bông gồm nhiều tiểu phân nhỏ hơn kết tụ lại (hình 3.4b) So với nguyên liệu MGF với kích thước vài micromet tới vài chục micromet (hình 3.4a), các tiểu phân sau khi bào chế có kích thước nhỏ hơn rất nhiều Sau đó, phân tán các mẫu tủa bông trong nước và đo KTTP trên máy Zetasizer ZS90 theo phương pháp đã nêu ở mục 2.2.8, kết quả được trình bày ở bảng 3.5 Các mẫu có KTTPTB từ 500 - 600 nm, có một lượng tiểu phân có kích thước > 1 micromet

Hình 3.4: a Nguyên liệu MGF quan sát trên kính hiển vi quang học vật kính 40;

b Tủa bông MGF quan sát trên kính hiển vi quang học vật kính 100

Bảng 3.5: Kích thước tiểu phân các mẫu sau khi phân tán lại trong nước