3.2.2.1. Khảo sát kĩ thuật kết tủa
Để xây dựng phƣơng pháp bào chế, trƣớc tiên chúng tôi tiến hành một số thí nghiệm khảo sát: phối hợp nhanh dung dịch MGF 20% trong DMSO vào nƣớc để đƣợc các nồng độ MGF khác nhau, thể tích hỗn hợp là 20 ml, sử dụng máy khuấy từ với tốc độ đặt ở mức 2 để khuấy trộn. Khi mới phối hợp, các hỗn hợp đều trong và không có tiểu phân nhìn thấy đƣợc. Sau 1 khoảng thời gian, các hỗn hợp trở nên mờ đục và có đặc điểm khác nhau. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4: Đặc điểm hỗn dịch khi bào chế với nồng độ MGF khác nhau
Nồng độ MGF (% kl/ tt)
Thời gian hệ
mờ đục (phút) Đặc điểm hệ sau khi mờ đục
10,0
2 - 5 phút Hỗn hợp trắng vàng, đặc sánh. Pha loãng thấy các tiểu phân kích thƣớc lớn > 1 µm.
5,0
2,0 10 - 12 phút Tủa xuất hiện nhanh, sau khoảng 2 phút hệ kết bông hoàn toàn, hệ đặc nhớt; mật độ tiểu phân lớn. 1,0 15 - 20 phút Tủa xuất hiện nhanh, sau khoảng 5 phút hệ kết
bông hoàn toàn.
0,5 Khoảng 40 phút Tủa xuất hiện chậm, sau khoảng 10 phút hệ kết bông hoàn toàn.
29
Khi quan sát tủa bông thu đƣợc trong các CT với nồng độ MGF 0,2 - 2% trên kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy tủa bông gồm nhiều tiểu phân nhỏ hơn kết tụ lại (hình 3.4b). So với nguyên liệu MGF với kích thƣớc vài micromet tới vài chục micromet (hình 3.4a), các tiểu phân sau khi bào chế có kích thƣớc nhỏ hơn rất nhiều. Sau đó, phân tán các mẫu tủa bông trong nƣớc và đo KTTP trên máy Zetasizer ZS90 theo phƣơng pháp đã nêu ở mục 2.2.8, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.5. Các mẫu có KTTPTB từ 500 - 600 nm, có một lƣợng tiểu phân có kích thƣớc > 1 micromet.
a b
Hình 3.4:a.Nguyên liệu MGF quan sát trên kính hiển vi quang học vật kính 40; b. Tủa bông MGF quan sát trên kính hiển vi quang học vật kính 100
Bảng 3.5: Kích thƣớc tiểu phân các mẫu sau khi phân tán lại trong nƣớc
Nồng độ MGF (% kl/ tt) KTTPTB PDI % tiểu phân ≥ 1106 nm 2,0 585,8 0,356 57,4 1,0 557,4 0,423 56,1 0,5 546,8 0,338 53,2 0,2 563,1 0,396 48,6
Từ các kết quả thu đƣợc ở trên, chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp kết tủa tạo thành tủa bông có thể đƣợc sử dụng để bào chế tiểu phân nano MGF. Trong khoảng
30
nồng độ 0,2 - 2%, KTTP MGF tạo ra khác nhau không nhiều, ngoài ra dựa vào đặc điểm xuất hiện tủa, chúng tôi đã lựa chọn nồng độ MGF là 1% để tiến hành các thí nghiệm về sau.
Sau khi lựa chọn kĩ thuật kết tủa và nồng độ bào chế, chúng tôi tiến hành khảo sát các thiết bị và thông số kĩ thuật, sử dụng công thức CT1. Trong công thức này, Tween 40 làm giảm năng lƣợng bề mặt tiểu phân, HPMC K15M có độ nhớt lớn và cấu trúc không gian cồng kềnh, do đó cả 2 chất đều có tác dụng ngăn chặn sự kết tụ của các tiểu phân nano MGF trong quá trình bào chế.
*Công thức bào chế (CT1) Mangiferin 0,20 g DMSO 1,0 ml Tween 40 0,06 g HPMC K15M 0,01 g Nƣớc cất 2 lần vđ 20,0 ml
3.2.2.2. Khảo sát thiết bị bào chế
Tiến hành bào chế theo công thức CT1 và phƣơng pháp đã nêu ở mục 3.2.2.1, các thiết bị bào chế đƣợc khảo sát gồm:
+ Bể siêu âm WUC - A10H (công suất 200 W, tần số 40 kHz) + Máy khuấy cơ VELP
+ Máy khuấy từ IKA RH basic 1
+ Máy đồng nhất hóa tốc độ cao UniDriver X1000.
Xác định thời điểm hỗn hợp bào chế mờ đục, sau đó duy trì lực phân tán trong 10 phút. Phân tán tủa thu đƣợc và đo KTTP theo phƣơng pháp đã nêu ở mục 2.2.8, kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.6.
31
Bảng 3.6: Đặc điểm hỗn dịch khi sử dụng thiết bị bào chế khác nhau (n = 3) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thiết bị Thời điểm hệ
mờ đục (phút)
KTTPTB
TB±SD (nm) Đặc điểm bào chế
Bể siêu âm + máy khuấy cơ
50 vòng/ phút 20 - 25 359,3±14,0 Bể siêu âm + máy khuấy cơ
500 vòng/ phút Nhiều bọt, khó quan sát Máy khuấy từ tốc độ ở mức 2 25 - 30 432,5±14,1 Máy đồng nhất hóa tốc độ cao 4.000 vòng/ phút Nhiều bọt, sau 3 - 5 phút chuyển màu nâu
Nhận xét: các thiết bị ảnh hƣởng khác nhau đến quá trình bào chế cũng nhƣ KTTP MGF tạo ra. Khi sử dụng bể siêu âm phối hợp với máy khuấy cơ tốc độ 50 vòng/ phút cho hiệu quả tốt nhất. Thiết bị đồng nhất hóa tốc độ cao làm tăng sự hòa tan oxy thúc đẩy phản ứng oxy hóa tạo sản phẩm mang màu, trên sắc ký đồ khi phân tích mẫu bằng phƣơng pháp HPLC có nhiều píc tạp ngoài píc của MGF (phụ lục 1). Do đó, các thiết bị khuấy trộn không đƣợc sử dụng ở tốc độ lớn.
Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi lựa chọn thiết bị bào chế là bể siêu âm kết hợp với máy khuấy cơ, tốc độ khuấy đƣợc giữ nguyên 50 vòng/ phút nhằm hạn chế quá trình tạo bọt dẫn tới giảm tác động của lực phân tán.
3.2.2.3. Khảo sát thời gian phân tán sau khi hệ mờ đục
Sau khi hệ trở nên mờ đục, chúng tôi đã khảo sát thời gian duy trì lực phân tán bằng bể siêu âm và máy khuấy cơ. Thời gian khảo sát: 10, 20, 30, 60 phút; sau 60 phút thay thiết bị phân tán bằng máy khuấy từ tốc độ ở mức 2, nhiệt độ 25±2oC trong 24 giờ. Tại từng thời điểm, hút 2 ml hỗn dịch pha loãng 5 lần bằng nƣớc cất 2 lần, lấy một phần dịch thu đƣợc cho vào cốc có mỏ 50 ml, phân tán rồi đo KTTP theo phƣơng pháp đã nêu ở mục 2.2.8, phần còn lại lọc qua màng PTFE 0,2 µm, định lƣợng dịch lọc theo phƣơng pháp quang phổ đã nêu ở mục 2.2.5. Kết quả đƣợc trình bày trong bảng 3.7.
32
Bảng 3.7: KTTP và nồng độ MGF trong dịch lọc khi tác động lực phân tán trong khoảng thời gian khác nhau
Thời gian KTTPTB (nm) Nồng độ MGF trong
dịch lọc (mg/ ml) 10 phút 357,1 0,671 20 phút 362,8 0,506 30 phút 343,6 0,397 60 phút 348,9 0,342 24 giờ 398,1 0,218
Nhận xét: KTTP MGF tạo ra gần nhƣ không có sự thay đổi nhƣng nồng độ MGF trong dịch lọc giảm dần theo thời gian. Dựa vào kết quả thu đƣợc, chúng tôi lựa chọn thời gian duy trì lực phân tán sau khi hệ mờ đục là 30 phút, do tại thời điểm đó tủa thu đƣợc đảm bảo yêu cầu về kích thƣớc và hiệu suất bào chế.
3.2.2.4. Khảo sát thứ tự, tốc độ phối hợp
Chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo công thức và phƣơng pháp đã lựa chọn ở mục 3.2.2.1, trong đó thay đổi cách phối hợp 2 pha nhƣ sau:
+ Thay đổi thứ tự phối hợp: phối hợp pha nƣớc vào pha dung môi; phối hợp pha dung môi vào pha nƣớc.
+ Thay đổi tốc độ phối hợp: phối hợp nhanh (thả nhanh trong 2 - 3 giây); phối hợp chậm (nhỏ giọt bằng pipet Pasteur).
* Thứ tự phối hợp
Khi mới phối hợp pha nƣớc vào pha dung môi, trong hỗn dịch luôn xuất hiện tiểu phân rất lớn kết đám. Tiếp tục quá trình phối hợp, chúng tôi không thấy tủa xuất hiện nhiều hơn, sau khoảng 20 phút hệ mờ đục tƣơng tự nhƣ việc phối hợp pha dung môi vào pha nƣớc đã thực hiện ở các thí nghiệm trƣớc. Nhƣ vậy việc phối hợp pha nƣớc vào pha dung môi không có nhiều ý nghĩa đối với quá trình kết tủa MGF.
33
Kết quả các thí nghiệm ở trên cho thấy: khi phối hợp pha dung môi vào pha nƣớc, tủa MGF không xuất hiện ngay. Ngoài ra do tƣơng quan tỉ lệ thể tích pha dung môi : pha nƣớc nhỏ (0,5 : 10) do đó tốc độ phối hợp nhanh hay chậm không ảnh hƣởng lớn đến việc hình thành tiểu phân MGF. Để thuận tiện, chúng tôi lựa chọn tốc độ phối hợp nhanh: thả nhanh hoàn toàn pha dung môi vào pha nƣớc.
3.2.2.5. Khảo sát tốc độ ly tâm
Sau khi bào chế đƣợc tiểu phân MGF, sự có mặt của DMSO trong hệ ảnh hƣởng tới quá trình tái hòa tan và kết tinh dƣợc chất, giảm độ bền động học của hệ. Chúng tôi sử dụng biện pháp ly tâm để tách riêng tủa MGF, cụ thể nhƣ sau: thu tủa bằng cách ly tâm trong 15 phút, bỏ phần dịch trong; rửa tủa bằng cách lắc mạnh tủa với nƣớc cất 2 lần, ly tâm trong 15 phút, bỏ phần dịch trong; tiến hành rửa 5 lần.
Chúng tôi khảo sát với 2 tốc độ ly tâm là 6.000 vòng/ phút và 10.000 vòng/ phút. Phân tán tủa thu đƣợc bằng bể siêu âm, xác định thời gian phân tán lại tủa (từ lúc bắt đầu phân tán đến khi không thấy tiểu phân quan sát đƣợc), đo KTTP MGF sau khi bào chế và sau khi phân tán lại tủa. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.8.
Bảng 3.8: Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm(n = 3)
Tốc độ ly tâm
(vòng/ phút) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau khi bào chế Sau khi phân tán lại tủa
Thời gian phân tán (phút) KTTPTB (nm) TB±SD PDI TB±SD KTTPTB (nm) TB±SD PDI TB±SD 6.000 347,4±11,2 0,173 ±0,032 348,2±9,5 0,144 ±0,021 5 - 10 10.000 353,1±12,8 0,169 ±0,043 15 - 20
Nhận xét: Khi ly tâm với 2 tốc độ khảo sát, thời gian và khả năng phân tán lại tủa thu đƣợc rất khác nhau. Đối với tốc độ 10.000 vòng/ phút, tủa MGF bám rất chắc ở đáy ống ly tâm, do đó thời gian phân tán dài hơn khoảng 2 lần so với ở tốc độ thấp hơn (6.000 vòng/ phút). Trong quá trình thực nghiệm chúng tôi nhận thấy
34
KTTP MGF và hiệu suất thu hồi tủa ở 2 tốc độ ly tâm không khác nhau nhiều, do vậy chúng tôi lựa chọn sử dụng tốc độ 6.000 vòng/ phút.
Qua quá trình khảo sát và lựa chọn kĩ thuật, chúng tôi đã xây dựng đƣợc phƣơng pháp bào chế tiểu phân nano MGF nhƣ sau:
- Hòa tan dƣợc chất vào dung môi.
- Ngâm trƣơng nở polyme và hòa tan chất diện hoạt vào nƣớc. - Làm lạnh pha nƣớc ở nhiệt độ 5 - 10oC bằng nƣớc đá.
- Phối hợp nhanh pha dung môi vào pha nƣớc, lực phân tán: bể siêu âm và máy khuấy cơ tốc độ 50 vòng/ phút, duy trì nhiệt độ của hệ 5 - 10oC.
- Khi hệ trở nên mờ đục, duy trì lực phân tán trong 30 phút.
- Ly tâm thu tủa với tốc độ 6.000 vòng/ phút trong 15 phút, bỏ phần dịch trong. Rửa tủa bằng cách lắc tủa MGF trong nƣớc cất 2 lần, ly tâm tốc độ 6.000 vòng/ phút trong 15 phút, bỏ phần dịch trong. Lặp lại 5 lần quá trình rửa tủa.
- Tủa thu đƣợc chứa tiểu phân nano mangiferin.