NGUYÊN LÝ CÁC PHÉP ĐO QUANG SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM HÓA SINH

NGUYÊN LÝ CÁC PHÉP ĐO QUANG SỬ DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM HÓA SINH Nguyên lý đo quang 1.1 Bản chất ánh sáng Ánh sáng dạng vật chất vừa có tính chất hạt, vừa có tính chất sóng Dựa vào tính chất sóng người ta giải thích tượng giao thoa, nhiễu xạ phân cực ánh sáng Dựa vào tính chất hạt ánh sáng người ta giải thích tượng quang điện, quang hoá tượng hấp thụ ánh sáng ánh sáng truyền không gian dạng hạt photon mang lượng gọi quang tử 1.2 Sự chuyển động phân tử mức lượng phân tử vật chất Cấu tạo phân tử vật chất phức tạp nhiều so với cấu tạo nguyên tử chuyển động phân tử phức tạp Chuyển động phân tử vật chất bao gồm chuyển động nguyên tử, chuyển động dao động chuyển động quay thân phân tử Chuyển động điện tử phân tử tạo thành đám mây điện tử Chuyển động dao động thay đổi tuần hồn vị trí tương đối hạt nhân nguyên tử phân tử Chuyển động quay phân tử thay đổi tuần hồn định hướng phân tử khơng gian Các dạng chuyển động phân tử xảy đồng thời có tương tác lẫn Mỗi dạng chuyển động phân tử có lượng đặc trưng lượng phân tử gồm dạng lượng: lượng điện tử, lượng dao động lượng quay 1.3 Sự tương tác ánh sáng phân tử vật chất (nguyên lý đo quang) Nguyên lý đo quang: Dựa nguyên lý tượng quang phổ hấp thụ Quang phổ hấp thụ thực chất trình tương tác hạt photon ánh sáng với phần vật chất Khi ta chiếu chùm tia sáng gồm photon có mức lượng khác qua dung dịch chất hấp thụ Dung dịch hấp thụ chọn lọc photon có mức lượng phù hợp với mức lượng điện tử, lượng dao động lượng quay phân tử chất Như phân tử vật chất có cấu trúc khác cho phổ hấp thụ với đỉnh bước sóng đặc trưng khác 1.4 Các định luật hấp thụ ánh sáng Định luật Bouger - Lamber: cường độ chùm tia sáng đơn sắc qua dung dịch chất hấp thụ tỷ lệ nghịch với chiều dày lớp dung dịch mà qua Định luật Beer: giảm cường độ ánh sáng qua dung dịch chất hấp thụ phụ thuộc vào số lượng tiểu phân tử vật chất hấp thụ mà ánh sáng gặp phải đường đi, nghĩa phụ thuộc vào nồng độ dung dịch chất hấp thụ Theo định luật Bouguer – Lamber - Bear với trường hợp chất cần xác định nồng độ dung dịch loãng: Độ hấp thụ quang (mật độ quang học) tỷ lệ thuận với nồng độ dung dịch: DA =  CA.L Trong đó: DA : Mật độ quang học dung dịch CA : Nồng độ dung dịch  : Hệ số tắt dụng dịch L : Chiều dầy lớp dung dịch mà chùm tia sáng qua Trong tham số trên, hệ số tắt  dung dịch không đổi, chiều dầy lớp dung dịch mà chùm tia sáng qua không đổi Bản chất dung dịch bước sóng khơng đổi, nên mật độ quang DA phụ thuộc vào nồng độ CA dung dịch Nếu nồng độ dung dịch cần định lượng vượt giới hạn cho phép mật độ quang học khơng cịn tuyến tính với nồng độ dung dịch nước Khi nồng độ dung dịch tăng, khoảng cách phân tử đáng kể, sai khác đi, hệ số hấp thụ không phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ nữa, phải pha loãng dung dịch, kết thu phải nhân với tỉ lệ pha lỗng Q trình dẫn truyền ánh sáng qua dung dịch biểu diễn sau: AS đa sắc AS đơn sắc ( tia tới ) Cường độ It Tia ló Mật độ quang DA Cường độ Iot Đèn Halogen Kính lọc (Mật độ quang DA hiệu số cường độ ánh sáng tia ló với cường độ ánh sáng tia tới qua dung dịch ) DA= It - Io Dựa vào định luật Bouguer - Lamber - Bear ta tính nồng độ dung dịch cần đo: Trong CA mẫu nồng độ dung dịch mẫu biết trước DA mẫu mật độ quang dung dịch mẫu đo Như hệ số K coi hệ số chuẩn trình làm xét nghiệm tìm nồng độ chất thử: CA = Hệ số K x DA thử Các phép đo quang (Method ): 2.1 Phép đo điểm cuối (End point ): Là phép đo mật độ quang (DA) dung dịch chất thử mà q trình thực phản ứng xảy hồn tồn sau thời gian định Tại thời điểm phản ứng kết thúc tạo phức hợp màu đặc trưng bền vững Mật độ đo tỷ lệ thuận với nồng độ MĐQ DA Điểm kết thúc phản ứng thời gian t Nồng độ dung dịch thử tuân theo công thức chuẩn : Hay: C thử = DAThử  Hệ số K ( Factor)  Chú ý phép đo điểm cuối: - Trong hóa sinh lâm sàng, tất xét nghiệm có phản ứng tạo mẫu đặc trưng, việc chọn bước sóng (kính lọc ) phù hợp việc làm bắt buộc Hiện nay, hầu hết xét nghiệm hóa sinh đại, người ta sử dụng loại thuốc thử với chế phẩm enzym, sản phẩm phản ứng mầu thường thể dạng mầu hồng cánh sen, thích hợp cho việc chọn kính lọc có bước sóng 500 - 546 nm, dạng phức hợp mầu xanh lục thích hợp cho việc lựa chọn kính lọc có bước sóng 578 - 620 nm - Riêng kỹ thuật xét nghiệm Bilirubin toàn phần Bilirubin trực tiếp huyết xét nghiệm sử dụng phép đo điểm cuối phải dùng “trắng“ bệnh phẩm (End point with sample blank) Sở dĩ chất huyết nhiều Bilirubin có mầu vàng, làm thay đổi mật độ quang dung dịch Mỗi người bệnh có nồng độ Bilirubin khác nhau, nên bệnh nhân làm xét nghiệm Bilirubin máu, kèm theo việc xác định MĐQ trắng bệnh phẩm (Sample blank) 2.2 Phép đo động học điểm ( Two point kinetic, fixed time ) Phép đo sử dụng cho xét nghiệm hóa sinh có phản ứng xảy khơng hồn tồn sau thời gian định Không thể xác định điểm kết thúc phản ứng MĐQ D2 t1 t2 thời gian D1 Tại thời điểm t1 , đo mật độ quang D1 Tại thời điểm t2 , đo mật độ quang D2 Hiệu số mật độ quang D = D2 - D1 Nồng độ chất cần tìm xác định theo công thức sau: ΔD thu C C mau ΔD mau Trong hóa sinh lâm sàng, xét nghiệm Ure Creatinin máu thường sử dụng phép đo động học điểm 2.3 Phép đo động học enzym ( enzymatic kinetic ) Phép đo sử dụng cho xét nghiệm hóa sinh tìm hoạt độ enzym huyết Phản ứng enzym thường không tạo phức hợp mầu mà làm thay đổi độ đục dung dịch phản ứng khoảng thời gian định Việc xác định hoạt độ enzym xác định phép đo điểm cuối mà phải sử dụng phép đo động học nhiều thời điểm ( t1, t2, t3, , tn ) MĐQ D5 D4 D3 D2 D1 t1 t2 t3 t4 t5 thời gian Người ta thường quen gọi phép đo Kinetic Phép đo tính hoạt độ enzym phải thông qua việc xác định hiệu số mật độ quang trung bình: D D1 = D2 - D1 D2 = D3 - D2 D3 = D4 - D3  D  D n D4 = D5 - D4 Hoạt độ enzym : U/l = D x K ( Hệ số K nhà sản xuất hoá chất cung cấp)  ... xét nghiệm Ure Creatinin máu thường sử dụng phép đo động học điểm 2.3 Phép đo động học enzym ( enzymatic kinetic ) Phép đo sử dụng cho xét nghiệm hóa sinh tìm hoạt độ enzym huyết Phản ứng enzym... ) Phép đo sử dụng cho xét nghiệm hóa sinh có phản ứng xảy khơng hồn tồn sau thời gian định Khơng thể xác định điểm kết thúc phản ứng MĐQ D2 t1 t2 thời gian D1 Tại thời điểm t1 , đo mật độ quang. .. Trong hóa sinh lâm sàng, tất xét nghiệm có phản ứng tạo mẫu đặc trưng, việc chọn bước sóng (kính lọc ) phù hợp việc làm bắt buộc Hiện nay, hầu hết xét nghiệm hóa sinh đại, người ta sử dụng loại