Cải tiến quy trình làm tiêu bản di truyền ở bậc trung học phổ thông

- Nghiên cứu quy trình thực hiện tiêu bản bộ NST của một số loài thực vật, động vật của các tác giả trong và ngoài nước từ đó tiến hành thực hiện các bộ tiêu bản cố định phục vụ cho công

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích đề tài 2

3 Nhiệm vụ nghiên cứu 3

4 Khách thể nghiên cứu 3

5 Đối tượng nghiên cứu 3

6 Phạm vi nghiên cứu đề tài 3

7 Nội dung nghiên cứu 3

8 Phương pháp nghiên cứu 3

9 Sản phẩm của đề tài 4

10 Ý nghĩa của đề tài 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vai trò của thí nghiệm, thực hành trong dạy học Sinh học 5

1.2 Các bài thực hành Di truyền học trong chương trình Sinh học Trung học Cơ sở và Trung học Phổ thông 5

1.3 Các quy trình làm tiêu bản Di truyền học trong và ngoài nước 9

1.4 Một số loại thuốc nhuộm nhiễm sắc thể 13

1.5 Đối tượng thường được dùng trong thực hiện tiêu bản Di truyền học 15

1.6 Các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời có trong SGK 15

1.7 Các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời và cố định có trong các tài liệu ngoài SGK 18

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu 25

2.2 Hóa chất và dụng cụ 25

2.2.1 Hóa chất 2.2.1.1 Thuốc nhuộm NST 25

2.2.1.2 Dung dịch cố định mẫu 25

2.2.1.3 Dung dịch nhược trương 25

2.2.1.4 Dung dịch làm mềm mẫu 25

2.2.1.5 Các loại hóa chất xử lí mẫu 25

2.2.1.6 Môi trường nuôi ruồi giấm 26

2.2.2 Dụng cụ 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 26

2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết về các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời và cố định 26

2.3.2 Bố trí thí nhiệm 26

2.3.3 Xử lý thống kê 27

2.3.3.1 Cách đếm số lượng tế bào trong các thí nghiệm có định lượng 27

2.3.3.2 Xử lý số liệu 28

2.3.4 Khảo sát các bước (công đoạn) trong các quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời và cố định 2.3.4.1 Thao tác chuẩn bị mẫu 28

2.3.4.2 Xử lí đa bội hóa tế bào thực vật 29

2.3.4.3 Xử lý sốc nhược trương 29

2.3.4.4 Cố định mẫu 30

2.3.4.5 Làm mềm mẫu 30

2.3.4.6 Nhuộm mẫu 30

2.3.4.7 Thao tác lên kính 30

2.3.4.8 Cố định tiêu bản 30

2.3.4.9 Khảo sát độ bền màu của tiêu bản cố định qua thời gian 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Các khâu thực hiện tiêu bản Di truyền trong điều kiện trường Trung học Phổ thông 31

3.1.1 Thao tác chuẩn bị mẫu vật 31

3.1.1.1 Thao tác chuẩn bị mẫu đối với nguyên phân ở hành tím, hành tây và tỏi 31 3.1.1.2 Thao tác chuẩn bị mẫu đối với giảm phân ở hẹ 32

3.1.1.3 Thao tác chuẩn bị mẫu đối với châu chấu 33

3.1.1.4 Thao tác chuẩn bị mẫu đối với dế mèn 34

3.1.1.5 Thao tác chuẩn bị mẫu đối với ruồi giấm 35

3.1.2 Ảnh hưởng của thời điểm thu mẫu lên chỉ số nguyên phân ở rễ hành tím 37 3.1.3 Đa bội hóa tế bào hành, tỏi 40

3.1.4 Gây sốc nhược trương tế bào động thực vật cho quan sát số lượng NST 40

3.1.4.1 Gây nhược trương đối với tế bào rễ hành tím, hành tây và tỏi 41

3.1.4.2 Gây nhược trương đối với tế bào sinh dục của châu chấu và dế mèn đực 43 3.1.5 Cố định mẫu vật 44

3.1.5.1 Cố định mẫu đối với hành tím, tỏi, hành tây và hoa hẹ 45

3.1.5.2 Cố định mẫu đối với tinh hoàn châu chấu 45

3.1.6 Làm mềm mẫu 45

3.1.7 Nhuộm mẫu 47

3.1.7.1 Nhuộm NST bằng phẩm nhuộm aceto-orcein 47

3.1.7.2 Nhuộm NST bằng phẩm nhuộm xanh methylene 50

3.1.8 Hóa chất và thao tác lên kính 52

3.2 Xây dựng các quy trình cải tiến việc thực hiện tiêu bản Di truyền ở trường Trung học Phổ thông 53

3.2.1 Sơ dồ hóa các quy trình cải tiến 53

3.2.2 Đánh giá các quy trình cải tiến 55

3.3 Xây dựng các quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát bộ NST của một số loài động thực vật 58

3.3.1 Sơ đồ hóa các quy trình 58

3.3.2 Những lưu ý khi thực hiện quy trình làm tiêu bản bộ NST động thực vật 62

3.3.2.1 Xử lý để làm bộ NST rõ nét và dàn đều 62

3.3.2.2 Xử lý thuốc nhuộm để làm bộ NST bắt màu tốt 65

3.4 Xây dựng và đánh giá hiệu quả quy trình cố định tiêu bản 66

3.4.1 Xây dựng quy trình cố định tiêu bản 66

3.4.1.1 Tách lamelle khỏi lame 66

3.4.1.2 Loại nước bằng cồn 6

3.4.1.3 Dán tiêu bản 67

3.4.1.4 Quy trình cố định tiêu bản cải tiến 68

3.4.2 Khảo sát độ bền màu của tiêu bản cố định theo thời gian 68

3.4.3 Hình ảnh hiển vi của các tiêu bản Di truyền học cố định đã thực hiện được 69 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 74

TÀI LIỆU THAM KHẢO 75

PHỤ LỤC 77

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

SGK: Sách Giáo Khoa

KHV: Kính hiển vi

NST: Nhiễm sắc thể

3 Bảng 3.1: Kích thước hoa hẹ tương ứng với các kì giảm phân quan sát

4 Bảng 3.2: Kết quả quan sát giảm phân ở tinh hoàn dế với kích thước

5 Bảng 3.3: Số tế bào thu được ở các kì tại các thời điểm thu mẫu khác

7 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ KCl và thời gian xử lí nhược trương

lên sự phân tán của nhiễm sắc thể ở tế bào hành tím, hành tây và tỏi 42

8 Bảng 3.6: Ảnh hưởng của thao tác xử lý cơ học và hóa học lên sự phân

9

Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ KCl và thời gian xử lí nhược trương

lên sự phân tán của nhiễm sắc thể ở tế bào sinh dục của châu chấu và dế

mèn đực

44

10 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của nồng độ HCl lên việc dàn đều các tế bào của

11 Bảng 3.9: So sánh quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời quá trình

12 Bảng 3.10: So sánh quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời bộ NST của

13 Bảng 3.11: So sánh quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời bộ NST lưỡng

bội (2n) và tứ bội (4n) ở hành tím, tỏi, hành tây 59

14 Bảng 3.12: Thời gian (tính theo giây) và nồng độ cồn trong thao tác loại

TT Tên hình Trang

2 Hình 1.2: Công thức cấu tạo của xanh methylene 14

3 Hình 1.3: Sự bắt màu của mô với xanh methylene 15

4 Hình 1.4: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan

5 Hình 1.5: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan

6 Hình 1.6: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

7 Hình 1.7: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát hình thái, số lượng NST thực vật ở nguyên phân 20

8 Hình 1.8: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan

9 Hình 1.9: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan

10 Hình 1.10: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan

11 Hình 1.11: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định 24

12 Hình 2.1: Phòng đếm Neubauer và sơ đồ của lưới 27

13 Hình 3.1: Mẫu rễ ở hành tây (a); tỏi (b); hành ta (c) sau 2 ngày 32

14 Hình 3.2: Hoa hẹ với các kích thước khác nhau (a); cụm hoa (b) 33

15 Hình 3.3: Châu chấu đực (a); cái (b) và mẫu tinh hoàn đã tách mô mỡ

16 Hình 3.4: Phân biệt dế mèn trưởng thành đực (a) và cái (b) 35

17 Hình 3.5: Ruồi giấm bắt ngoài thiên nhiên

18 Hình 3.6: Ấu trùng ruồi giấm độ tuổi 3

19 Hình 3.7: Tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm dưới kính hiển vi 37

20 Hình 3.8: Nhiễm sắc thể khổng lồ ở ruồi giấm (X100) 37

21 Hình 3.9: Sử dụng phòng đếm Neubauer để ước tính (X100)

22 Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện số tế bào rễ hành tím đang ở kì giữa

nguyên phân tại các thời điểm thu mẫu khác nhau 39

23 Hình 3.11: Tế bào của hành tây khi không xử lý nhược trương (a)

và xử lý nhược trương với KCl 0,2% trong 30 phút (b) (X400) 42

24 Hình 3.12 : Bộ NST của châu chấu qua xử lý nhược trương để phân

Hình 3.21: So sánh tiêu bản NST của tỏi khi nhuộm bằng xanh

methylene 2% (a) và bằng aceto-orcein 2% (b) (X400) 52

34 Hình 3.22: Tiêu bản tạm thời bộ NST của châu chấu nhuộm bằng xanh

35 Hình 3.23: Sơ đồ quy trình cải tiến thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát các kì của nguyên phân ở hành tím, tỏi và hành tây 53

36 Hình 3.24: Sơ đồ quy trình cải tiến thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

37 Hình 3.25: Sơ đồ quy trình cải tiến thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát bộ NST của một số loài thực vật 55

38 Hình 3.26: Tiêu bản nguyên phân ở rễ hành tím theo quy trình 1a (a)

45 Hình 3.33: Bộ nhiễm sắc thể nhuộm với aceto-orcein 2% - 5 phút

46 Hình 3.34: NST khổng lồ ở ruồi giấm cuộn trong tế bào (X400) 64

47 Hình 3.35: NST khổng lồ ở ruồi giấm ở dạng trải (X400) 64

48 Hình 3.36: Tế bào hành tím bị biến dạng do thao tác đun mẫu quá

50 Hình 3.38: Sơ đồ quy trình cố định tiêu bản hiển vi 68

51 Hình 3.39: Bộ NST của tỏi trước cố định (a)

52 Hình 3.40: Tiêu bản cố định nguyên phân ở hành tây (x100) 69

54 Hình 3.42: Tiêu bản cố định giảm phân ở hoa hẹ 70

55 Hình 3.43: Tiêu bản cố định giảm phân ở châu chấu 70

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Quan sát và thí nghiệm là hai phương pháp nghiên cứu đặc thù của Sinh học – một môn Khoa học thực nghiệm Vì vậy, trong dạy học Sinh học, các phương pháp trực quan và thực hành – thí nghiệm cần phải được chú trọng Các phương pháp trực quan và thực hành – thí nghiệm nếu được chuẩn bị tốt và vận dụng khéo léo sẽ huy động được sự tham gia của nhiều giác quan, kết hợp được cả hai hệ thống tín hiệu, do vậy sẽ giúp cho người học dễ hiểu, nhớ lâu, phát triển năng lực chú ý, quan sát, rèn luyện những kĩ năng, kĩ xảo, phát triển tư duy tìm tòi, phát hiện tri thức mới (Đinh Quang Báo và Nguyễn Đức Thành, 2003) Trong chương trình Sinh học bậc Trung học, mục tiêu về kĩ năng thực hành là rèn luyện và phát triển kĩ năng quan sát, thí nghiệm Qua đó, học sinh sẽ học được cách thu thập, xử lí mẫu vật, biết cách bố trí

và thực hiện một số thí nghiệm đơn giản nhằm tìm hiểu nguyên nhân của một số hiện tượng và quá trình Sinh học Muốn thực hiện mục tiêu này, việc tổ chức dạy học các bài thực hành trong sách giáo khoa là một việc làm cần thiết (Trịnh Nguyên Giao, Nguyễn Đức Thành, 2009)

Từ những năm 1990, trong nội dung chương trình và sách giáo khoa Sinh học bậc Trung học đã chú trọng cung cấp cho học sinh các kiến thức cơ bản, hiện đại về

Di truyền học – một Khoa học giúp lý giải các hiện tượng cơ bản nhất của sự sống Tuy nhiên, kiến thức về Di truyền học là loại kiến thức khó với nhiều khái niệm trừu tượng và các đối tượng nghiên cứu ở mức tế bào hoặc phân tử có kích thước hiển vi hoặc siêu hiển vi Các bài thực hành Di truyền học trong chương trình sẽ giúp học sinh củng cố kiến thức, cụ thể hóa các khái niệm, gây hứng thú học tập, v.v Các bài thực hành Di truyền học có thể kể đến gồm: Bài 14, Sách giáo khoa (SGK) Sinh học 9:

“Thực hành: Quan sát hình thái nhiễm sắc thể”; Bài 20, SGK Sinh học 10 cơ bản:

“Thực hành: Quan sát các kỳ của nguyên phân trên tiêu bản rễ hành”; Bài 31, SGK Sinh học 10 nâng cao: “Thực hành: Quan sát các kỳ của nguyên phân rễ hành trên tiêu bản tạm thời và cố định”; Bài 7, SGK Sinh học 12 cơ bản và bài 10, SGK Sinh học 12 nâng cao: “Thực hành quan sát các dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể trên tiêu bản

cố định và trên tiêu bản tạm thời”

Qua quan sát thực tế tại nhiều trường Trung học, việc tổ chức các bài thực hành

Di truyền học còn gặp nhiều khó khăn Có một số nguyên nhân khách quan lý giải cho điều đó, chẳng hạn như: Thiếu cán bộ chuyên trách phòng thí nghiệm; cơ sở vật chất của một số trường còn hạn chế; thiếu phương tiện dạy học; một số giáo viên ít được tiếp cận với phương pháp làm các bài thực hành - thí nghiệm khi còn học ở trường Sư phạm; v.v Khó khăn cơ bản nhất chính là các quy trình làm tiêu bản Di truyền học được mô tả trong các tài liệu trong nước còn chưa cụ thể, rõ ràng; thời gian tiến hành một thí nghiệm nếu kéo dài sẽ không đủ gói gọn trong 1 – 2 tiết thực hành của học sinh Trung học; giá thành của một số thuốc nhuộm đặc trưng như carmine, orcein khá cao và cách pha chế thuốc nhuộm còn nhiều bất cập Vì vậy, việc nghiên cứu và đề xuất cải tiến các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời và cố định, rút ngắn thời gian thực hiện tiêu bản, tìm kiếm các thuốc nhuộm thay thế hoặc phương cách giảm thiểu lượng thuốc nhuộm tiêu tốn là những việc làm có ý nghĩa, tạo thuận lợi cho công tác triển khai tổ chức dạy học thực hành Di truyền học ở bậc Trung học

Với những lý do vừa nêu, hướng nghiên cứu “Cải tiến quy trình làm tiêu bản di truyền ở bậc Trung học Phổ trông” được đề xuất thực hiện Các quy trình thực hiện

tiêu bản Di truyền của Vũ Đức Lưu (2006) (SGK Sinh học 10 nâng cao), quy trình của Phạm Văn Lập (2008) (SGK Sinh học 12 cơ bản) và quy trình của Nguyễn Như Hiền

và Vũ Đức Lưu (2008) (SGK Sinh học 12 nâng cao) được nghiên cứu cải tiến với các tiêu chí: cụ thể và rõ ràng hơn, tiết kiệm thời gian và hóa chất Ngoài ra, nghiên cứu này còn mở rộng sang các đối tượng thí nghiệm khác ngoài các đối tượng kinh điển là hành tím, hẹ và châu chấu Thuốc nhuộm xanh methylene cũng được nghiên cứu để nhuộm nhiễm sắc thể (NST) thay cho các loại thế cho thuốc nhuộm chuyên dùng Quá trình cố định tiêu bản hiển được nghiên cứu cải tiến nhằm tạo ra bộ tiêu bản có chất lượng tốt và giá thành phù hợp nhằm phục vụ công tác giảng dạy các bài thực hành Di truyền học

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Nghiên cứu các quy trình thực hiện các tiêu bản hiển vi tạm thời về quá trình nguyên phân và quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời bộ NST trong SGK Sinh học lớp

10 và 12

- Nghiên cứu quy trình thực hiện tiêu bản bộ NST của một số loài thực vật, động vật của các tác giả trong và ngoài nước từ đó tiến hành thực hiện các bộ tiêu bản cố định phục vụ cho công tác dạy học các bài thực hành Di truyền học

- Đề xuất các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền học phù hợp trong điều kiện trang thiết bị đơn giản nhất

4 Khách thể nghiên cứu

Hành tím, tỏi, hành tây, hẹ, châu chấu, dế mèn và ruồi giấm

5 Đối tƣợng nghiên cứu

- Quá trình nguyên phân ở hành tím, tỏi và hành tây

- Quá trình giảm phân ở hẹ, châu chấu và dế mèn

- Bộ NST của hành tím (2n = 16), tỏi (2n = 16), hành tây (2n = 16), hẹ, châu chấu

đực (2n = 22 + OX), dế mèn đực (2n = 28+OX) và ruồi giấm (Drosophila sp.) (2n =

4)

6 Giới hạn, phạm vi nghiên cứu đề tài

Nghiên cứu hiện dừng lại ở các nội dung thực hành Di truyền học ở bậc Trung học Phổ thông, với một số đối tượng cụ thể như sau:

- Cải tiến 03 quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời về quá trình nguyên phân và bộ NST trong các SGK Sinh học lớp 10 (nâng cao) và SGK Sinh học 12 (cơ bản và nâng cao)

- Thực hiện bộ tiêu bản cố định về quá trình nguyên phân ở rễ hành tím

- Thực hiện bộ tiêu bản cố định về quá trình giảm phân ở hoa hẹ

- Thực hiện tiêu bản cố định về bộ NST của hành tím, tỏi, châu chấu và dế mèn,

và bộ NST khổng lồ của ruồi giấm

- Đánh giá chất lượng bộ tiêu bản cố định sau 9 tháng - 1 năm

7 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu và cải tiến quy trình làm tiêu bản nguyên phân và giảm phân

- Nghiên cứu và đề xuất quy trình làm tiêu bản bộ nhiễm sắc thể

- Nghiên cứu cố định các tiêu bản

8 Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu lý thuyết và thực nghiệm:

- Dựa trên quy trình của SGK (quy trình chuẩn), thiết kế các thí nghiệm để tìm

hiểu và cải tiến mỗi khâu (bước) thực hiện

- Nghiên cứu các quy trình thực hiện tiêu bản NST ở thực vật và động vật hiện có

trong các tài liệu trong và ngoài nước, từ đó thiết kế và xây dựng quy trình hiệu quả

nhất cho mỗi đối tượng cụ thể

9 Sản phẩm của đề tài

- Các quy trình cải tiến

- Bộ tiêu bản, mỗi loại gồm 20 chiếc đóng hộp

- Hướng dẫn sinh viên nghiên cứu khoa học và làm khóa luận tốt nghiệp

- Bài đăng trên tạp chí

10 Ý nghĩa, hiệu quả của đề tài

- Đề tài thành công sẽ cung cấp cho các giáo viên Sinh học một quy trình làm tiêu

bản Di truyền học cụ thể, rõ ràng và hiệu quả (dễ thực hiện, dễ thành công)

- Quy trình tìm được có thể đưa vào sản xuất trên quy mô thủ công các loại tiêu

bản Di truyền học nhằm cung cấp cho thị trường thiết bị dạy học trong Thành phố

- Là tiền đề cho việc biên soạn giáo trình, đề cương bài giảng Thực hành

Di truyền học cho sinh viên Cao đẳng, Đại học, Trung học chuyên nghiệp…

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vai trò của thí nghiệm, thực hành trong dạy học Sinh học

Đối tượng của Sinh học là thế giới sống Trong đó, thí nghiệm - thực hành là phương pháp cơ bản, đặc trưng cho hoạt động nghiên cứu và dạy học Sinh học Trong dạy học Sinh học, giáo viên sử dụng phương pháp thí nghiệm - thực hành khi nghiên cứu các quá trình, quy luật, các hiện tượng sinh học Đối với học sinh, thông qua các bài thí nghiệm - thực hành, các em tự mình khám phá ra những kiến thức mới, hoàn thiện kĩ năng, kĩ xảo và qua đó kích thích hứng thú học tập, tạo sự say mê và niềm tin khoa học (Đinh Quang Báo và Nguyễn Đức Thành, 2003)

Căn cứ vào mục đích của quá trình dạy học, người ta chia thí nghiệm - thực hành làm các loại: Thí nghiệm hình thành kiến thức mới; thí nghiệm củng cố và hoàn thiện kiến thức; thí nghiệm để kiểm tra - đánh giá; thí nghiệm vận dụng kiến thức Tùy theo mục đích sử dụng, nội dung, cách tiến hành, thời gian tiến hành thực hành thí nghiệm

mà các bài thực hành - thí nghiệm được sắp xếp ở những vị trí khác nhau trong chương trình Ở cấp Trung học Phổ thông, thí nghiệm thực hành thường được xếp vào bài cuối chương, gồm khoảng một hay hai thí nghiệm thực hành với mục đích: củng cố kiến thức; rèn luyện kỹ năng, kỹ xảo; giúp học sinh nhận thức được thế giới khách quan, thế giới sinh vật cụ thể hơn, hình thành cho học sinh thái độ đúng đắn với môi trường sống xung quanh, với thế giới sinh vật Ngoài ra, còn có một số thí nghiệm được đặt ở đầu mỗi bài với mục đích giúp học sinh phát hiện kiến thức mới, chuẩn bị tâm thế và tăng tính tích cực, chủ động của học sinh (SGK Sinh học lớp 10, SGK Sinh học lớp 12)

1.2 Các bài thực hành Di truyền học trong chương trình Sinh học Trung học Cơ

thực vật (giun đũa, châu chấu, bò, lợn, người, hành, lúa nước ), bộ tiêu bản với số lượng tương ứng với số nhóm học sinh (SGK Sinh học lớp 9)

Trong chương trình Sinh học lớp 10, kiến thức Di truyền được đề cập ở phần II

“Sinh học tế bào” và chương IV “Phân bào” Học sinh được tìm hiểu về cơ chế Di truyền ở cấp độ tế bào: Quá trình nguyên phân và giảm phân Trong chương này, học sinh được rèn luyện kĩ năng thực hành ở bài 20 “Thực hành: Quan sát các kỳ của nguyên phân trên tiêu bản rễ hành” (SGK Sinh học 10 cơ bản), bài 31“Thực hành: Quan sát các kỳ của nguyên phân rễ hành trên tiêu bản tạm thời và cố định” (SGK Sinh học 10 nâng cao) với các mục tiêu là nhận biết được các kì nguyên phân trên tiêu bản tạm thời dưới KHV quang học, rèn kĩ năng sử dụng KHV và kĩ năng làm tiêu bản tạm thời của tế bào rễ hành (SGK Sinh học lớp 10 cơ bản và nâng cao)

Trong chương trình Sinh học lớp 12, kiến thức Di truyền được đề cập ở phần V

“Di truyền học”, tập trung ở năm chương đầu trong SGK Riêng ở chương I “Cơ chế di truyền và biến dị”, học sinh sẽ được thực hiện thí nghiệm “Thực hành: quan sát các dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể trên tiêu bản cố định và trên tiêu bản tạm thời” ở bài 7 SGK Sinh học 12 cơ bản hay bài 10 SGK Sinh học 12 nâng cao Đối tượng để thực hiện tiêu bản giữa SGK Sinh học 12 cơ bản và SGK Sinh học 12 nâng cao có sự khác nhau SGK Sinh học 12 cơ bản đề xuất đối tượng dùng để thực hiện tiêu bản quan sát NST là châu chấu, trong khi đó SGK Sinh học 12 nâng cao lại đề xuất đối tượng là khoai môn, khoai sọ hoặc ráy (SGK Sinh học lớp 12 cơ bản và nâng cao)

Bảng 1.1: Một số bài thực hành liên quan đến kiến thức Di truyền học trong chương

trình Sinh học phổ thông (Nguồn: Các SGK Sinh học lớp 9, lớp 10 và lớp 12 cơ bản và nâng cao)

SGK Sinh học 9

SGK Sinh học 10

Cơ bản

SGK Sinh học 10 Nâng cao

SGK Sinh học 12

Cơ bản

SGK Sinh học 12 Nâng cao

rễ hành”

Bài 31 “Thực hành: quan sát các kỳ của nguyên phân

rễ hành trên tiêu bản tạm thời và cố định”

Bài 7 “Thực hành: quan sát các dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể trên tiêu bản cố định và trên tiêu bản tạm thời”

Bài 10“ Thực hành: quan sát các dạng đột biến số lượng nhiễm sắc thể trên tiêu bản cố định và trên tiêu bản tạm thời”

- Vẽ được các

tế bào ở các

kì nguyên phân quan sát được dưới KHV

- Rèn luyện kĩ năng quan sát tiêu bản trên KHV

- Nhận biết được các kì khác nhau của nguyên phân trên tiêu bản tạm thời hay cố định

- Rèn luyện kĩ năng quan sát tiêu bản trên KHV

- Rèn kĩ năng làm tiêu bản tạm thời của

tế bào rễ hành

- Quan sát được bộ NST dưới KHV

- Xác định được một số dạng đột biến NST trên tiêu bản cố định

- Rèn kĩ năng làm tiêu bản NST và xác định số lượng NST dưới KHV

- Xác định được các cặp NST tương đồng của

- Phân biệt các dạng đột biến số lượng NST trên tiêu bản cố định hay tiêu bản tạm thời

- Vẽ được hình thái, số lượng NST đã quan sát

người trên ảnh chụp

- Các tiêu bản

cố định NST của một số loài như giun đũa, châu chấu, trâu, bò, lợn, người, hành, lúa nước

- Củ hành đã trồng ra rễ

- Tiêu bản cố định bộ NST của người bình thường

thường

- Châu chấu đực (để làm tiêu bản tạm thời)

- Tiêu bản cố định bộ NST của khoai môn, khoai

sọ, ráy (2n); khoai môn, khoai sọ tam bội (3n) hoặc ráy tứ bội (4n)

- Tiêu bản NST của tế bào bạch cầu của người bị hội chứng Down; người

bị hội chứng Turner

- Nếu không

có tiêu bản cố định, có thể làm tiêu bản tạm thời bộ NST

Qua bảng 1.1, có thể nhận thấy ở các bài thực hành Di truyền học của lớp 9 và lớp 10 có cùng một mục tiêu chung, đó là giúp học sinh phân biệt được các kì của nguyên phân Ở chương trình Sinh học 10 cơ bản, học sinh được yêu cầu là vẽ được các kì quan sát được trên KHV Ngược lại, chương trình Sinh học 10 nâng cao có yêu cầu cao hơn, đó là học sinh phải rèn luyện được kĩ năng làm được tiêu bản tạm thời của nguyên phân ở tế bào rễ hành Đối với các bài thực hành trong chương trình Sinh học 12 cơ bản, các mục tiêu là tương tự nhau, đó là quan sát được bộ NST bình thường

và đột biến và rèn kĩ năng làm tiêu bản tạm thời để quan sát bộ NST Để đảm bảo được các mục tiêu của bài học nói trên, giáo viên và học sinh cần nắm vững các kĩ năng và thao tác thực hiện tiêu bản tạm thời Thời gian thực hiện tiêu bản tạm thời càng ngắn cũng đồng nghĩa với việc học sinh có nhiều thời gian quan sát và phân tích tiêu bản trên KHV hơn và từ đó dễ đạt được mục tiêu của bài học Vì vậy, việc tìm ra quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời đạt yêu cầu với thời gian ngắn nhất và tiết kiệm hóa chất nhưng vẫn đảm bảo chất lượng là rất hữu ích

Về tiêu bản và mẫu vật cần chuẩn bị, tất cả các bài thực hành Di truyền học đều yêu cầu bộ tiêu bản cố định bộ NST của các loài động thực vật và của người (riêng đối với chương trình lớp 12) Việc chuẩn bị các tiêu bản cố định của khoai môn, khoai sọ, ráy tam bội hoặc tứ bội là điều rất khó khăn vì hầu như trên thị trường chưa bán các tiêu bản này, vì vậy có thể thay thế bằng việc thực hiện tiêu bản tạm thời để quan sát đột biến đa bội trên đối tượng khoai sọ, khoai môn, ráy, hành tím, tỏi hoặc hành tây (4n) bằng cách xử lý mẫu với colchicine Tuy nhiên, rất ít tài liệu hướng dẫn cho giáo viên quy trình cụ thể để chuẩn bị các mẫu vật gây đột biến như trong SGK giới thiệu Điều này thực sự gây khó khăn cho giáo viên và học sinh khi dạy và học các bài thực hành trên

1.3 Các quy trình làm tiêu bản Di truyền học trong và ngoài nước

Darlington và La Cour (1942) đã giới thiệu nhiều phương pháp thực hiện tiêu

bản để phân tích NST của động thực vật Các công đoạn cố định mẫu, nhuộm mẫu, thực hiện tiêu bản tạm thời và tiêu bản cố định đã được mô tả Trong đó, có sự phân tích công dụng của các loại hóa chất sử dụng để nhuộm mẫu vật và hướng dẫn cách pha chế nhiều loại hóa chất một cách chi tiết Tuy nhiên, việc pha chế hóa chất cũng như quy trình thực hiện phải trải qua nhiều công đoạn phức tạp và tốn nhiều thời gian, điều này lại không phù hợp với các tiết dạy thực hành ở phổ thông với thời lượng 1 tiết

Ostergren và Heneen (1962) đã nghiên cứu và đề xuất quy trình thực hiện tiêu

bản hiển vi tạm thời và cố định để nghiên cứu hình thái NST ở thực vật bao gồm 14 bước cụ thể và chi tiết Các tác giả đã đề xuất sử dụng thuốc nhuộm là Feulgen trong 2 giờ, thủy phân bằng HCl 1N ở 60oC trong 8 phút, xử lý bằng dung dịch 8-hydroxy-quinoline (0,002 mol/L) ở 15oC trong khoảng 3 - 4 giờ Tuy nhiên, để thực hiện quy trình trên cần tốn rất nhiều thời gian (ít nhất là 24 giờ) và nhiều hóa chất (14 loại)

Karuzina (1980) đã đề cập đến các bài thực hành quan sát quá trình nguyên

phân, giảm phân và NST khổng lồ Tài liệu này đã hướng dẫn cách pha chế thuốc nhuộm carmin và orcein, đồng thời cũng giới thiệu cách thức chuẩn bị mẫu tuyến nước

bọt để tiến hành quan sát NST khổng lồ của muỗi Chironomus và ruồi giấm

Drosophila melanogaster

SGK Sinh học 10 Nâng cao (2006) đã giới thiệu phương pháp thực hiện tiêu bản tạm thời để quan sát các kì nguyên phân trong bài 31 “Thực hành: quan sát các kì nguyên phân qua tiêu bản tạm thời và cố định” với mục đích rèn luyện kĩ năng làm tiêu bản tạm thời của tế bào rễ hành và các kĩ năng thực hành khác Trong bài thực hành này, ở SGK cũng như Sách giáo viên đều không hướng dẫn cách pha các loại thuốc nhuộm và một số hóa chất cần thiết Điều này có thể sẽ gây ra sự lúng túng cho những giáo viên chưa có kinh nghiệm khi thực hiện công tác chuẩn bị và giảng dạy Nếu không thực hiện được tiêu bản tạm thời thì giải pháp thay thế là giáo viên có thể cho học sinh quan sát trên tiêu bản cố định Tuy nhiên, rất ít trường Trung học hiện nay được trang bị đầy đủ các loại tiêu bản cố định như SGK giới thiệu

Bài số 10 “Thực hành quan sát các dạng đột biến số lượng NST trên tiêu bản cố định hay trên tiêu bản tạm thời” trong SGK Sinh học12 Nâng cao (2008) đã mô tả và hướng dẫn cách thực hiện tiêu bản tạm thời theo phương pháp ép để quan sát các dạng đột biến số lượng NST trên các đối tượng như khoai môn, khoai sọ hoặc ráy lưỡng bội, tam bội và tứ bội Tuy nhiên, việc chuẩn bị các loại mẫu vật thực vật đa bội là điều khá khó khăn đối với nhiều giáo viên phổ thông Thêm nữa, các tiêu bản cố định bộ NST của các loài trên hiện nay dường như chưa có trên thị trường Do vậy, giáo viên thường cho học sinh xem tranh ảnh bộ NST thay vì thực hành tại phòng thí nghiệm. Đào Như Phú (1998) đã giới thiệu nhiều phương pháp thực hiện các thí nghiệm trong chương trình Sinh học ở trường Trung học, trong đó có đề cập đến các thí nghiệm về Di truyền học Tác giả đã mô tả cách thức thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát NST của châu chấu và hành tím hoặc hành tây Thay vì hơ nóng tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn hoặc đặt tiêu bản trong tủ ấm ở 60oC như quy trình của một

số tác giả khác, Đào Như Phú đề xuất sử dụng phương pháp hơ nóng tiêu bản tạm thời bằng hơi nước trên cốc thủy tinh nhằm giúp thuốc nhuộm ngấm nhanh hơn nhưng không làm hư mẫu vật Tác giả sử dụng thuốc nhuộm NST là orcein, carmine hay mực

đỏ nhưng không hướng dẫn chi tiết cách pha và bảo quản chúng Quy trình thực hiện làm tiêu bản vẫn chỉ dừng ở mức tạm thời chứ chưa đề cập đến mức cố định tiêu bản Huỳnh Thị Ngọc Nhân và ctv (2004) đã giới thiệu quy trình thực hiện các loại tiêu bản Di truyền học như: nguyên phân ở hành tiều đỏ, giảm phân ở hoa của cây một

lá mầm hay hai lá mầm, tứ bội hóa tế bào hành bằng colchichine, NST khổng lồ ở ruồi giấm Tuy nhiên một số hóa chất được tác giả giới thiệu trong quy trình vẫn chưa đề cập nồng độ cụ thể, ví dụ như dung dịch HCl dùng để làm mềm mẫu, điều này đã gây lúng cho người thực hiện đặc biệt là những người mới bắt đầu Tương tự, nhiều loại thuốc nhuộm như orcein, hematoxyline, Giemsa, crystal violet, Schiff được sử dụng trong các quy trình không ghi nồng độ cụ thể, cách thức chuẩn bị thuốc nhuộm cũng như quy trình cố định tiêu bản vẫn chưa được đề cập

Vũ Đức Lưu và Nguyễn Minh Công (2007), trong giáo trình Di truyền học thuộc

dự án đào tạo giáo viên Trung học Cơ sở, đã giới thiệu một số bài thực hành để quan sát hình thái, số lượng nhiễm sắc thể ở thực vật và động vật, sử dụng thuốc nhuộm là aceto – carmine 2%; orcein hoặc fuchsin Quy trình chuẩn bị mẫu vật cũng như cố định mẫu để bảo quản đã được đề cập một cách khá chi tiết Quá trình cố định tiêu bản hiển vi quá trình nguyên phân ở hành tây (hoặc hành tím) cũng được các tác giả giới thiệu nhưng các dung dịch sử dụng trong quá trình cố định tiêu bản vẫn chưa có nồng

độ hoặc cách pha chế cụ thể Bên cạnh đó, một vài quy trình thực hiện các tiêu bản hiển vi tạm thời cũng chưa thật rõ ràng và chi tiết, cách thức pha thuốc nhuộm và một

số dung dịch cần thiết vẫn chưa được đề cập đã gây không ít khó khăn trong quá trình thực hiện đối với giáo sinh và giáo viên

Nguyễn Thị Minh Phương và Tashiro (2010) đã tiến hành nghiên cứu sự đa dạng

và số lượng NST của cây trồng ăn được thuộc chi Hành tỏi ở Việt Nam Đề tài đã tiến hành khảo sát số lượng NST của 10 loài thuộc chi Hành tỏi, sử dụng phương pháp ép

và nhuộm mẫu bằng leucobasic fuchsin Tuy nhiên, phương pháp thực hiện tiêu bản vẫn chưa được mô tả một cách cụ thể

Võ Thị Thanh Phương (2012) đã sử dụng phương pháp sốc nhược trương để khảo sát số lượng NST ở một số loài thực vật và động vật Tác giả đã giới thiệu quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định để quan sát bộ NST của một số loài động thực vật phổ biến, bao gồm dưa hấu, hành tím, hành tây, đậu Hà Lan, 9 loài thực

vật thuộc họ Araceae, châu chấu đực Acrida sp., ruồi giấm Drosophila sp Các bước

thực hiện tiêu bản cố định được mô tả rất chi tiết, tuy nhiên trong quy trình thao tác có

sử dụng nhiều loại hóa chất ảnh hưởng đến sức khỏe như xylene, n-butanol Trong khi Ruiyang và ctv (1982) (trích dẫn của Võ Thị Thanh Phương, 2012) đề cập đến việc sử dụng KCl 0,075M để nhược trương tế bào thực vật thì Võ Thị Thanh Phương (2012) lại nghiên cứu và sử dụng citrate natri 0,4% hay NaCl 0,4 – 0,5% (tùy loài) Qua đó, tác giả đã cho thấy hiệu quả nhất định của việc sử dụng một số dung dịch muối để gây sốc nhược trương tế bào thực vật giúp NST phân tán đều và dễ quan sát

Nghiên cứu của Nguyễn Đức Lập và Võ Thị Thanh Phương (2012) tiến hành trên

kiểu nhân hành tím (Allium ascalonicum L.) Các tác giả đã khảo sát thời gian thu mẫu

và xác định được thời gian tốt nhất là từ 8 giờ đến 8 giờ 45 phút sáng Nhược trương tế

bào trong natri citrate 0,1% trong 45 phút kết hợp xử lí mẫu rễ với 8-oxyquinolince để tăng kích thước nhiễm sắc thể Việc xác định thể kèm sẽ tạo thuận lợi cho quan sát hình thái NST, sắp xếp và xác định kiểu nhân

Nghiên cứu của Phạm Trút My và Võ Thị Thanh Phương (2012) về thực hiện

tiêu bản hiển vi tạm thời và cố định rễ hành tím (Allium ascalonicum L.), các tác giả

đã đề xuất tráng lame bằng albumin để tăng độ bám của tế bào và sử dụng phẩm nhuộm crystal violet có giá thành thấp, tiết kiệm chi phí nhưng vẫn cho kết quả tốt Nhược điểm của cách nhuộm này là màu sắc tiêu bản chỉ giữ được trong một thời gian ngắn

Trương Văn Xạ và Võ Thị Thanh Phương (2012) cũng đã thực hiện tiêu bản hiển

vi tạm thời và cố định trên đối tượng là rễ hành tím (Allium ascalonicum L.), với thuốc

nhuộm hematoxylin Thời gian cố định mẫu trong carnoy tốt nhất là 4 giờ Mẫu được làm mềm bằng HCl 1N và methanol (1:1) trong 5 phút nhằm tăng hiệu quả bắt màu với thuốc nhuộm Hematoxylin được pha loãng trong nước cất (1:4) để nhuộm NST trong 25 phút ở nhiệt độ 45oC Kết quả thu được là các tế bào bắt màu đồng đều, màu tím xanh đậm, có thể quan sát rõ hình thái nhiễm sắc thể ở các kì của nguyên phân Riêng đối với tình hình sản xuất và cung cấp cho thị trường trong nước, có một

số cơ quan trước đây đã từng thực hiện các bộ tiêu bản hiển vi về quá trình nguyên phân và giảm phân như Đại học Y Hà Nội, Công ty Cổ phần Sách thiết bị trường học

TP Hồ Chí Minh Tuy nhiên hiện nay các cơ quan này đã ngừng sản xuất Thay vào

đó, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt hiện có sản xuất và phân phối “Bộ tiêu bản nhiễm sắc thể người bình thường và bất thường” cũng như bộ tiêu bản về nguyên phân

ở hành tím Qua thực tế sử dụng, nhận thấy khuyết điểm của sản phẩm là tiêu bản thường mất màu sau khoảng 1 năm sử dụng, nhiều tiêu bản về quá trình nguyên phân

chưa đạt yêu cầu cho việc quan sát và phân biệt rõ các kì Theo đánh giá cá nhân, hiện

vẫn còn nhu cầu cao về các bộ tiêu bản Di truyền học như là loại phương tiện trực quan trong dạy học thực hành, đặc biệt là trong các trường không có đủ điều kiện để tự thực hiện tiêu bản

1.4 Một số loại thuốc nhuộm nhiễm sắc thể

Có rất nhiều loại thuốc nhuộm được sử dụng trong các nghiên cứu NST Một số thường được sử dụng phổ biến ở nước ta gồm aceto-carmine; aceto-orcein; Giemsa; hematoxyline; leuco-basic fuchsin; xanh methylene, v.v…

Orcein có công thức C28H24O2N7 Khi kết hợp với acid acetic tạo thành aceto – orcein tạo nên một loại thuốc nhuộm thực vật có màu nâu đỏ Thuốc nhuộm aceto-orcein được đề xuất bởi La Cour (1941) và được sử dụng phổ biến để nhộm NST ở cả thực vật và động vật hiện nay (Darlington and La Cour, 1942) Dùng orcein dạng bột pha với acid acetic 45% và đun nóng khoảng 1 giờ sau đó lọc và bảo quản trong lọ màu, có thể sử dụng từ 1 - 2 năm Tuy nhiên, nếu để quá lâu thì cần lọc lại bằng giấy lọc trước khi dùng để hạn chế cặn bẩn

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của orcein

(nguồn: http://stainsfile.info/StainsFile/dyes/orcein.htm)

Tài liệu của Lê Đình Trung và Đặng Hữu Lanh (2000) cũng có đề cập đến việc dùng xanh methylene để nhuộm NST nhưng không đề cập đến quy trình sử dụng và đối tượng nghiên cứu Phẩm nhuộm xanh methylene được sử dụng rất phổ biến trong các nghiên cứu mô học hiện nay, thường được sử dụng trong nhuộm nhân tế bào còn sống, nhuộm mô của động thực vật hoặc NST (Ostergren and Heneen, 1962) Xanh methylene tan dễ dàng trong nước và cồn Tại các mô, xanh methylene nhanh chóng bị

khử thành xanh leukomethylen (Junis, 1965) Xanh methylene do có khả năng oxy hóa làm tổn thương NST nên ít được khuyên dùng cho nhuộm NST (Darlington and La Cour, 1942) Tuy vậy, loại thuốc nhuộm này có giá thành rẻ, dễ pha chế Nếu sử dụng

để nhuộm tiêu bản di truyền với mục đích quan sát quá trình nguyên phân, giảm phân hoặc quan sát bộ NST của một số loài với các yêu cầu không quá khắt khe trong các bài thực hành Di truyền sẽ giúp tiết kiệm chi phí mua các loại thuốc nhuộm chuyên dụng đắt tiền như carmine hoặc orcein Hạn chế của phẩm nhuộm này là dễ tan trong cồn nên khi khử nước bằng cồn trong thao tác cố định tiêu bản sẽ khiến màu sắc của mẫu nhạt đi đáng kể, cần chú ý để khắc phục

Hình 1.2: Công thức cấu tạo của xanh methylene

(nguồn: www.chemexplore.net/triangulene.htm)

Sự bắt màu của thuốc nhuộm với mô do các liên kết hóa học cũng như nhiều yếu

tố khác Một số thuốc nhuộm bắt màu nhờ sự hỗ trợ của các hóa chất trung gian (mordant) được bổ sung trong hỗn hợp thuốc nhuộm làm tăng khả năng bắt màu của chúng, ví dụ Ag hoặc Fe làm tăng khả năng bắt màu của hematoxyline với nhân tế bào

Bảng 1.2: Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng bắt màu của mô đối với thuốc nhuộm

Hình 1.3: Sự bắt màu của mô với xanh methylene

bởi liên kết ion (a) và liên kết hydro (b) (Nguồn: www.scionpublishing.com)

1.5 Đối tượng thường được dùng trong thực hiện tiêu bản Di truyền học

Có một số đối tượng thường được lựa chọn để làm tiêu bản Di truyền học, chẳng

hạn như nhị của các hoa còn non của một số loài thuộc chi Tradescantia (Belar, 1929),

bao phấn của một số loài thực vật (Wulff, 1934), tuyến nước bọt của các loài thuộc Bộ Hai cánh (Diptera), họ Chironomidae (Bauer, 1934), tinh hoàn của một số loài trong

họ Orthoptera để quan sát quá trình giảm phân (Belar, 1929) hoặc đuôi của các loài thuộc Bộ Có đuôi (Urodela) ở lưỡng cư để quan sát NST (Barber và Callan, 1942) (trích dẫn của Darlington và La Cour, 1942)

Để thuận tiện cho việc thực hiện tiêu bản Di truyền đối với giáo viên Trung học

và học sinh ở nước ta, cần đề xuất lựa chọn các đối tượng phổ biến, dễ tìm kiếm ở các vùng miền và thường có quanh năm như là hành, tỏi, hẹ, châu chấu, dế mèn hay ruồi giấm Đây cũng là các đối tượng được giới thiệu phổ biến trong các bài thực hành di truyền của SGK Sinh học lớp 9, 10, 12 và một số giáo trình Di truyền học phổ biến ở nước ta hiện nay

1.6 Các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời có trong SGK

Qua hướng dẫn trong các SGK Sinh học lớp 10 và 12, có 3 quy trình được nghiên cứu và sơ đồ hóa như sau:

Quy trình 1a: Thực hiện tiêu bản tạm thời để quan sát các kì nguyên phân

Trồng hành cho ra rễ, cắt rễ sau đó rửa sạch

và cố định đầu rễ trong dụng dịch carmine để giữ cho tế bào không hỏng

Lấy 4-5 rễ hành cho vào đĩa kính có dung dịch aceto-carmine (bước 1.1)

Đun nóng trên đèn cồn trong 6 phút (không cho sôi)

rồi chờ 30-40 phút bước (bước 1.2)

Đặt lên phiến kính 01 giọt acid acetic 45%, dùng kim mũi mác lấy rễ hành đặt lên phiến kính, dùng dao cạo cắt đầu rễ khoảng 1,5-2mm và bổ đôi (bước 1.3)

Đậy lá kính lên mẫu, dùng giấy thấm hút hết acid acetic còn thừa, dùng đầu cán

gỗ của kim mũi mác chà lên lá kính theo 1 chiều để các tế bào dàn thành 1 lớp

(bước 1.4)

Quan sát tiêu bản trên KHV

Hình 1.4: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát các kì của nguyên phân (Nguồn: SGK Sinh học 10 – nâng cao )

Quy trình 2a: Thực hiện tiêu bản tạm thời để quan sát số lượng NST

Tách tinh hoàn ra khỏi phần bụng của châu chấu đực (bước 2.1)

Đưa tinh hoàn lên phiến kính và nhỏ lên đó vài giọt nước cất (bước 2.2)

Dùng kim mổ tách bỏ mỡ xung quanh tinh hoàn (bước 2.3)

Nhỏ vài giọt aceto - orcein lên tinh hoàn, nhuộm 15-20 phút (bước 2.4)

Đậy lá kính, dùng ngón tay ấn nhẹ lên mặt lá kính cho tế bào dàn đều (bước 2.5)

Quan sát tiêu bản trên KHV

Hình 1.5: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát bộ NST

(Nguồn: SGK Sinh học 12 – cơ bản)

Quy trình 3a: Thực hiện tiêu bản tạm thời để quan sát đột biến số lượng NST

Lấy củ khoai môn, khoai sọ hoặc ráy (2n, 3n, 4n) trồng vào chậu cát ẩm

Cho ra rễ dài khoảng 2-3 cm (bước 3.1)

Cắt lấy phần chóp rễ; rửa sạch (bước 3.2)

Cho vào dung dịch cố định theo tỉ lệ (3 cồn 90o: 1 acid acetic đặc)

Cố định trong 12 giờ (bước 3.3)

Rửa bằng cồn 70o (bước 3.4)

Đun cách thủy rễ trong dung dịch thuốc nhuộm orcein (hoặc carmine) 4-5%

cho tới khi rễ mềm (bước 3.5)

Lấy 1-2 chóp rễ dài 2-3 mm đưa lên phiến kính, nhỏ thêm 1 giọt thuốc nhuộm

orcein (hoặc carmine) 4-5% lên mẫu (bước 3.6)

Đậy lá kính lên mẫu sau đó đặt giấy lọc lên trên rồi ấn nhẹ cho NST tung đều (bước 3.7)

Quan sát trên KHV

Hình 1.6: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát bộ NST ở một số thực vật (Nguồn: SGK Sinh học 12- nâng cao)

1.7 Các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời và cố định có trong các tài liệu ngoài SGK

Bộ tiêu bản hiển vi cố định cần phải đạt những yêu cầu cao hơn so với các tiêu bản tạm thời mà giáo viên thực hiện trong các tiết dạy thực hành Tiêu bản tạm thời muốn chuyển thành tiêu bản cố định cần đạt những tiêu chí cụ thể như: NST bắt màu đậm và có sự tương phản rõ nét về màu sắc so với tế bào chất; các tế bào dàn đều; các

tế bào (7-10 tế bào) có bộ NST dàn đều (đối với tiêu bản quan sát bộ NST); có đầy đủ

các kì của nguyên phân hoặc giảm phân trên 1 tiêu bản (đối với tiêu bản nguyên phân hoặc giảm phân)

Để đảm bảo các yêu cầu trên, việc chuyển tiêu bản tạm thời thành tiêu bản cố định cần được thực hiện theo 1 quy trình riêng, với một vài khác biệt so với quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời đã được hướng dẫn trong SGK Chính vì thế, việc tiến hành thực hiện tiêu bản hiển vi cố định trong nghiên cứu này được dựa trên các quy trình làm tiêu bản tạm thời của Vũ Đức Lưu và Nguyễn Minh Công (2007) cho các đối tượng cụ thể như hành, hẹ, châu chấu, kết hợp với quy trình cố định tiêu bản do Võ Thị Thanh Phương (2012) đề xuất nhằm tìm ra các quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời và cố định phù hợp cho mỗi đối tượng nghiên cứu đã đề cập trong mục vật liệu nghiên cứu nói trên

Quy trình 4a: Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát hình thái, số lượng NST

trong nguyên phân ở tế bào hành tây, hành tím, tỏi

Trồng hành đến khi rễ dài khoảng 0,5 - 1,5cm (bước 4.1)

Cắt rễ và ngâm trong Carnoy khoảng 24 giờ (bước 4.2)

Bảo quản rễ trong cồn 70o ở 4oC (bước 4.3)

Thủy phân mẫu trong HCl 1N ở 60oC khoảng 10-30 phút (bước 4.4)

Rửa mẫu bằng nước cất (bước 4.5)

Nhuộm carmine 2% trong 30 phút (bước 4.6)

Cắt đầu rễ đã nhuộm (khoảng 1-2mm) và đặt lên lame (bước 4.7)

Nhỏ 1 giọt acid acetic 45% lên mẫu rễ trên lame và đậy lamelle (bước 4.8)

Quan sát trên KHV

Hình 1.7: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát hình thái, số lượng NST thực vật ở nguyên phân (Nguồn: Vũ Đức Lưu, Nguyễn Minh Công, 2007)

Quy trình 5a: Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát NST trong quá trình

giảm phân ở hoa hẹ

Dùng kim nhọn tách bao phấn ở nụ hoa đặt lên lame (bước 5.1)

Dầm nát bao phấn bằng kim phân tích (bước 5.2)

Nhuộm bằng carmine trong 15-20 phút (bước 5.3)

Đậy lamelle và quan sát trên KHV (bước 5.4)

Hình 1.8: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát NST trong giảm phân ở hoa hẹ (Nguồn: Vũ Đức Lưu, Nguyễn Minh Công, 2007)

Quy trình 6a: Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát hình thái, số lượng NST

trong giảm phân ở châu chấu đực

Chọn châu chấu đực trưởng thành, dùng kéo và kim nhọn tách lấy tinh hoàn châu chấu (bước 6.1)

Nhuộm tinh hoàn trong đĩa đồng hồ với orcein trong 10 – 15 phút (bước 6.2)

Tách lấy 3 ống sinh tinh đặt lên lame, dùng kim nhọn xé rách bao ống để bung các tế bào ra (bước 6.3)

Ép lamelle và quan sát trên KHV (bước 6.4)

Hình 1.9: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát bộ NST ở châu chấu đực (Nguồn: Vũ Đức Lưu, Nguyễn Minh Công, 2007)

Quy trình 7a: Thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát

NST khổng lồ ở ruồi giấm

Tách lấy tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm trên lame có sẵn 1 giọt NaCl 0,6% (bước 7.1)

Loại bỏ phần thể mỡ và các phần mô thừa (bước 7.2)

Nhỏ 1 - 2 giọt orcein hoặc carmine, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn,

nhuộm từ 10-15 phút (bước 7.3)

Ép lamelle, thấm hết thuốc nhuộm (bước 7.4)

Quan sát trên KHV

Hình 1.10: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời

để quan sát NST khổng lồ ở ruồi giấm (Nguồn: Vũ Đức Lưu, Nguyễn Minh Công, 2007)

Quy trình 8a: Cố định tiêu bản tạm thời đạt yêu cầu

Chọn những tiêu bản tạm thời đẹp

Úp ngược tiêu bản tạm thời trong acid acetic 45% khoảng10 phút để tách lamelle

khỏi lame hoặc đặt tiêu bản trên băng đá CO2 từ 12-24 giờ,

sau đó tách lamelle khỏi lame (bước 8.1)

Ngâm tiêu bản lần lượt qua các dung dịch có nồng độ cồn tăng dần từ

300  400  500  600  700  800  900  960  cồn tuyệt đối

trong vài giây tùy đối tượng (bước 8.2)

Ngâm tiêu bản trong dung dịch n – butanol

và xylene 1  xylene 2 trong vài phút

Để khô tiêu bản, nhỏ 1 giọt bome canada lên lame, đậy lamelle lại và để tiêu bản khô tự nhiên (bước 8.3)

Hình 1.11: Sơ đồ quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi cố định

(Nguồn: Võ Thị Thanh Phương, 2012)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu nghiên cứu

Với mong muốn tạo điều kiện thuận lợi cho giáo viên và học sinh khi chuẩn bị mẫu vật thí nghiệm trong các bài thực hành, đề tài chọn lựa các đối tượng thí nghiệm phổ biến, dễ tìm và được giới thiệu trong các bài thực hành của SGK Cụ thể gồm: hành tím, tỏi, hành tây, hẹ, châu chấu, dế mèn và ruồi giấm

2.2 Hóa chất và dụng cụ

2.2.1 Hóa chất

2.2.1.1 Thuốc nhuộm NST

- Orcein-acetic 1%; 2%; 3%; 4% (hãng Merk)

Cách pha Orcein-acetic 1% như sau: cân 1g orcein cho vào bình tam giác có sẵn

100 ml acid acetic 45%, đun nóng dung dịch trên cho đến khi sôi nhẹ khoảng 1 giờ (chú ý đậy lên trên bình tam giác một phễu thủy tinh để hạn chế sự bay hơi của dung dịch trong quá trình đun nóng), lọc qua giấy lọc và bảo quản trong lọ màu ở nhiệt độ phòng Sau vài tháng, nếu sử dụng nên lọc lại để loại bỏ các cặn bẩn

- Xanh methylene (Himedia - Ấn Độ) 1%; 1,5%; 2% pha trong dung dịch acid acetic 5%

Cách pha xanh methylene 1% như sau: cân 1g xanh methylene nguyên chất cho

từ từ dung dịch acid acetic 5% đến khi đủ 100ml, khuấy đều và lọc qua giấy lọc, bảo quản trong lọ màu ở nhiệt độ phòng

- CH3COOH 5%; 10%; 15% và 45%

- Colchicine 0,01%; 0,02%; 0,03% (Himedia - Ấn Độ)

- Cồn 40o, 50o, 60o, 70o, 80o, 90o, 96o và cồn tuyệt đối

- Canada balsam (Trung Quốc) pha trong xylene với tỉ lệ 1:1,5 (v/v)

2.2.1.6 Môi trường nuôi ruồi giấm

- Gồm 250 nước cất 250g chuối sứ đâm nhuyễn; agar 5g; thuốc chống mốc Cách pha như sau: nước cất (hoặc nước lã) nấu sôi và cho agar vào khuấy đều cho tan hết Đâm nhừ chuối sứ chín rục và cho vào dung dịch trên quậy đều khoảng 5 phút, tắt lửa Cho thuốc chống mốc (khoảng 10ml) vào quậy đều Đổ môi trường vào các lọ thủy tinh (độ dày lớp thạch khoảng 1 - 2 cm), đậy nút bông hoặc vải

Thuốc chống mốc 10% gồm 10g Na benzoate (NaC6H5CO2) và 100ml cồn tuyệt đối, lắc đều trước khi sử dụng

2.2.2 Dụng cụ

- Lọ thủy tinh, lọ nhựa, bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 250ml

- Phễu thủy tinh và giấy lọc, lame (phiến kính) và lamelle (lá kính), đĩa đồng hồ, đĩa petri

- Đèn cồn và diêm

- Kim nhọn, kim mũi mác, ống nhỏ giọt, dao lam, dao mổ, kéo, bút lông

- Trắc vi thị kính, máy ảnh Canon

- KHV quang học Nikon SE (phóng đại từ 40 – 1000 lần)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Nghiên cứu lý thuyết về các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời

mẫu (đối với mẫu hành tím, thí nghiệm trên 5 đầu rễ có chiều dài bằng nhau của 5 củ hành tím khác nhau) Các công đoạn trong mỗi quy trình được thực hiện nối tiếp nhau, kết quả của công đoạn trước là tiền đề cho công đoạn sau

Quy trình sau cải tiến cần đạt được các tiêu chí như: cụ thể, đơn giản, dễ thực hiện, rút ngắn thời gian, tiết kiệm hóa chất, loại bỏ các hóa chất gây hại cho sức khỏe nhưng vẫn cho ra những tiêu bản đạt yêu cầu đối với công tác dạy học thực hành Di truyền học ở Việt Nam hiện nay

Hầu hết các kết quả thu được được đánh giá qua quan sát định tính Riêng đối với đối tượng hành tím, vốn là một đối tượng nghiên cứu kinh điển, sẽ được khảo sát qua nhiều thí nghiệm hơn, và đánh giá kết quả qua xử lí thống kê

2.3.3 Xử lý thống kê

2.3.3.1 Cách đếm số lƣợng tế bào trong các thí nghiệm có định lƣợng

- Đối với tổng số tế bào có trong một tiêu bản:

Việc đếm toàn bộ số tế bào có trong mỗi tiêu bản đòi hỏi nhiều công sức Do vậy,

để tạo ra một cỡ mẫu chung cho toàn bộ các thí nghiệm có tính định lượng, tiến hành đếm tổng số tế bào có trong 3 tiêu bản lấy ngẫu nhiên và tính trung bình cộng Đối với mỗi tiêu bản, thực hiện cách đếm như sau:

Tính diện tích của mẫu ép đã dàn đều có trong một tiêu bản (diện tích = a mm2) Dàn đều một mẫu trên phòng đếm Neubauer cải tiến (Neubauer improved) Đếm ít nhất 3 ô có diện tích với 1 mm2 chứa các tế bào đã dàn đều và lấy trung bình cộng (giá trị b)

Tính tổng số tế bào có trong 1 tiêu bản: N (tế bào) = a x b

Hình 2.1: Phòng đếm Neubauer và sơ đồ của lưới

- Đối với tổng số tế bào có trong mỗi kì ở mỗi tiêu bản:

Đếm toàn bộ tế bào có trong mỗi kì ở mỗi tiêu bản qua KHV quang học ở bội giác X100

2.3.3.2 Xử lý số liệu

Số liệu được phân tích phương sai một nhân tố, vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel

2010 Việc phân tích sự khác biệt giữa các nghiệm thức được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0

2.3.4 Khảo sát các bước (công đoạn) trong các quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời và cố định

2.3.4.1 Thao tác chuẩn bị mẫu

Đối với hành tím, hành tây và tỏi: Dùng củ đem gieo cho đến khi ra rễ Cắt lấy chóp rễ để thực hiện tiêu bản nguyên phân và quan sát NST

Đối với hẹ: Hoa hẹ mua ở ngoài chợ, tách lấy bao phấn trong nụ hoa để thực hiện tiêu bản giảm phân

Đối với châu chấu và dế mèn: Bắt ở ngoài đồng hoặc mua tại các tiệm bán chim cảnh trong thành phố Đem về phòng thí nghiệm, chọn con đực kích cỡ phù hợp, tách lấy tinh hoàn, loại bỏ các mô mỡ, để thực hiện tiêu bản giảm phân, quan sát bộ NST Đối với ruồi giấm: Bẫy ruồi ngoài thiên nhiên bằng một vài lát chuối chín hoặc trái cây chín đặt trong lọ nhựa và để nơi mát mẻ trong nhà hoặc ngoài vườn Ruồi sau khi bẫy được chuyển về phòng thí nghiệm nuôi trong lọ thủy tinh có pha sẵn môi trường Sau vài ngày sẽ thấy xuất hiện ấu trùng (dòi) Tiến hành tách lấy tuyến nước bọt của ấu trùng để quan sát NST khổng lồ

Trong các tài liệu, hầu hết không nêu cụ thể thời điểm thu mẫu, cách lựa chọn mẫu vật phù hợp cho thí nghiệm, chẳng hạn như: Lúc nào thì cắt rễ hành, tỏi? Chọn trong cụm bông hẹ hoa hẹ cỡ nào là phù hợp? Phân biệt châu chấu hay dế đực và cái,

và lựa chọn con đực có kích thước (độ tuổi) nào cho hiệu quả cao?, v.v Tất cả những vấn đề này sẽ được lưu ý trong thao tác chuẩn bị mẫu nhằm chuẩn hóa công tác chuẩn bị mẫu

Riêng đối với quy trình làm tiêu bản quá trình nguyên phân ở rễ hành tím, tiến hành định lượng và xử lý thống kê số tế bào đang ở mỗi kì, đồng thời so sánh giữa các nghiệm thức khác nhau về thời điểm thu mẫu (7 giờ; 9 giờ; 11 giờ; 13 giờ)

2.3.4.2 Xử lí đa bội hóa tế bào thực vật

Ngâm mẫu với colchicine ở các nồng độ từ 0,01%; 0,02%; 0,03% trong các khoảng thời gian khác nhau nhằm tìm ra nồng độ và thời gian thích hợp nhất cho việc thực hiện các tiêu bản đột biến đa bội (4n) đối với mẫu vật là hành tím, tỏi và hành tây

Các mẫu vật đa bội hóa này có thể sử dụng thay thế cho các mẫu thực vật đa bội mà SGK đề cập như môn, ráy vì các loại này không phổ biến bằng và cũng chưa có quy trình hướng dẫn xử lý mẫu cụ thể

Định lượng và xử lý thống kê đối với kết quả thu được trên đối tượng hành tím

2.3.4.3 Xử lý sốc nhược trương

Khi thực hiện tiêu bản quan sát NST ở các đối tượng, cần có thêm công đoạn nhược trương mẫu vật trong dung dịch muối nhằm giúp NST phân tán đều trong tế bào, dễ quan sát hình thái và số lượng Đề tài tiến hành khảo sát hiệu quả nhược trương với KCl 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% trong các khoảng thời gian khác nhau đối với tế bào trong rễ tỏi, hành tây và hành tím, trong tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm, và trong tinh hoàn của châu chấu và dế mèn (kết quả định tính)

Hình thái và số lượng NST của mỗi loài được quan sát rõ nhất khi tế bào đang ở

kỳ giữa Bên cạnh đó, colchicine được cho rằng có tác dụng cản trở sự hình thành của thoi vô bào cho nên cũng giúp tạo điều kiện cho các NST dàn đều trong tế bào Do vậy, trong khảo sát này, số lượng tế bào có bộ NST dàn đều cũng được đếm, xử lý thống kê và so sánh giữa 3 cách xử lý: (1) không dùng colchicine và cũng không gây sốc nhược trương (Đối chứng), (2) không dùng colchicine và sốc nhược trương với KCl với nồng độ và thời gian thích hợp, và (3) qua xử lý colchicine với nồng độ và thời gian thích hợp và không gây sốc nhược trương Kết quả định lượng cũng chỉ được đánh giá trên đối tượng hành tím

2.3.4.4 Cố định mẫu

Cố định mẫu có tác dụng bảo quản mẫu để sử dụng lâu dài khi không có mẫu tươi Mẫu rễ tỏi, hành tây, hành tím, tinh hoàn châu chấu và dế mèn được cố định trong dung dịch Carnoy cải tiến (3 cồn : 1 acid acetic) với những khoảng thời gian khác nhau từ 15 phút; 30 phút; 1 giờ Ngoài ra, đề tài còn tiến hành thực hiện tiêu bản

ép đối với mẫu tươi không cần cố định

2.3.4.5 Làm mềm mẫu

Làm mềm mẫu giúp dàn mẫu dễ dàng hơn và tạo điều kiện cho mẫu bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn Có hai cách làm mềm mẫu Làm mềm bằng hóa chất, sử dụng HCl 1N, 1,5N và 2N trong các khoảng thời gian ngâm mẫu khác nhau Làm mềm mẫu bằng nhiệt, cho mẫu vào ống nghiệm có sẵn phẩm nhuộm sau đó đun nhẹ (không cho sôi) trên ngọn lửa đèn cồn

2.3.4.6 Nhuộm mẫu

Mẫu được nhuộm với phẩm nhuộm aceto-orcein 1%; 2%; 3%; 4% hoặc xanh methylene 1%; 1,5%; 2% (đối với hành tím, tỏi, hành tây) trong khác khoảng thời gian khác nhau

Tiêu bản tạm thời đạt yêu cầu sẽ được chuyển qua khâu cố định, tiến hành khảo sát ở các công đoạn sau:

- Tách lame khỏi lamelle: khảo sát việc tách lame khỏi lamelle qua các cách: (1)

để khô tự nhiên; (2) ngâm trong acid acetic 45% trong 10 phút (theo Nguyễn Minh Công, 2007); (3) đặt tiêu bản trên băng đá CO2 trong ngăn đá tủ lạnh (theo Võ Thị Thanh Phương, 2012); (4) đặt tiêu bản trong ngăn đá tủ lạnh ở các khoảng thời gian khác nhau

- Khử nước bằng cồn ở các khoảng thời gian khác nhau

- Dán mẫu bằng canada balsam pha trong xylene với tỉ lệ 1:1,5 (v/v)

2.3.4.9 Khảo sát độ bền màu của tiêu bản cố định qua thời gian

Tiến hành quan sát và chụp hình các tiêu bản cố định đạt yêu cầu ngay sau khi thực hiện và sau 1 tháng; 3 tháng; 6 tháng; 1 năm nhằm đánh giá chất lượng tiêu bản

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Các khâu thực hiện tiêu bản Di truyền trong điều kiện trường Trung học Phổ thông

3.1.1 Thao tác chuẩn bị mẫu vật

3.1.1.1 Thao tác chuẩn bị mẫu đối với nguyên phân ở hành tím, hành tây và tỏi

Đối với quy trình 1a (SGK Sinh học 10 – nâng cao), phương pháp trồng hành tím để lấy rễ vẫn chưa được đề cập, thực tế cho thấy trồng hành không đúng cách sẽ khó mọc rễ Khi trồng hành tím, hành tây hoặc tỏi theo một số tài liệu trước đây, nếu đặt trên đất ẩm bình thường thì một số loại hành hoặc tỏi rất khó mọc rễ hoặc ra rễ với

số lượng rất ít, có khi đến 7 ngày mới thấy xuất hiện một vài rễ hoặc không mọc rễ, đặc biệt là hành tây và tỏi Có đề xuất cho rằng nên đặt củ hành lên cốc nước lã sao cho phần dưới của củ hành chấm vào nước, đặt vào chỗ tối vài ngày cho đến khi rễ mọc dài vào trong nước 2 - 3cm (Đào Như Phú, 1998) Tuy nhiên, khi trồng theo phương pháp này củ hành thường bị mốc do nấm hoặc không ra rễ

Một biện pháp thay thế mà đề tài đã thực hiện thành công: ngâm các loại củ trên trong nước khoảng 12 – 24 giờ sau đó bóc lớp vỏ ngoài và trồng trong đất ẩm, chỉ sau

1 đến 2 ngày đã thấy xuất hiện rất nhiều rễ Việc ngâm trong nước giúp tăng độ ẩm có tác dụng kích thích việc ra rễ ở các loài trên Khi rễ hành/tỏi dài khoảng 1 – 2 cm, dùng kéo cắt lấy khoảng 2 mm phần đầu rễ và rửa sạch bằng nước Nếu để rễ mọc quá dài (khoảng 4 – 5 cm) sẽ thấy rất ít tế bào phân chia

Nếu muốn thu được nhiều rễ, mỗi lần cắt đầu rễ xong cần cắt bỏ toàn bộ rễ và đặt lại trong đất ẩm, sau 1 - 2 ngày sẽ thấy rễ mọc thêm rất nhiều, có thể thu hoạch rễ

từ 5 - 6 đợt như vậy Nếu làm theo phương pháp này thì giáo viên có thể thu được rất nhiều rễ từ một ít củ hành hoặc tỏi ban đầu giúp tiết kiệm chi phí và chủ động mẫu vật trong một thời gian dài