Những lưu ý khi thực hiện quy trình làm tiêu bản bộ NST động thực vật

3.3. Xây dựng các quy trình thực hiện tiêu bản hiển vi tạm thời để quan sát bộ NST của một số loài động thực vật

3.3.2. Những lưu ý khi thực hiện quy trình làm tiêu bản bộ NST động thực vật

Theo Lê Đình Trung (2000), có thể dùng dung dịch monobromo naphthalene bão hòa trong nước để xử lí các rễ non. Còn theo Nguyễn Nghĩa Thìn (2006), trong một số trường hợp khó đếm số lượng thể nhiễm sắc hoặc thể nhiễm sắc quá dài thì trước khi cố định phải xử lý rễ hay mầm lá, đỉnh sinh trưởng của thân qua một số thuốc như 8-oxyquinolin, chloral hydrate, colchicine, paradichlorobenzene hoặc làm lạnh. Đối tượng sau khi ngắt khỏi cơ thể thực vật phải cho ngay vào dung dịch 8- oxyquinolin ở nồng độ 0,002 M (dùng 0,58 g 8-oxyquinolin hòa vào 200 ml nước cất ấm) ở nhiệt độ 10 - 14oC trong khoảng 3 giờ. Xử lý bằng chất này để làm tăng độ lớn của thể nhiễm sắc lên 1,5 lần mà không làm thay đổi chiều dài của chúng, đồng thời làm cho các eo sơ cấp và thứ cấp hiện rõ hơn. Muốn xem NST được dễ dàng và chính xác thì trước khi xử lý, đối tượng cần được làm lạnh ở 0oC trong 24 giờ nhằm giúp NST co ngắn đáng kể. Theo Kagava (trích dẫn của Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006), có thể ngâm mẫu thực vật trong dung dịch chloral hydrate 0,3 - 1% để làm ngắn thể nhiễm

sắc, sau đó cho vào nước cất để rửa trong một giờ và tiếp tục cho vào buồng ấm 2 - 4 giờ rồi mới cho vào dung dịch cố định.

Gần đây, người ta thường đề cập đến việc sử dụng dung dịch colchicine 0,01 - 0,05% để xử lý mẫu thực vật trong thời gian 2 giờ trước khi cố định. Đối với lá non người ta ngâm trong dung dịch colchicine 0,2% trong 1 - 2 giờ. Cũng có thể dùng dung dịch paradichlorobenzene (lấy 5 - 10 g tinh thể paradichlorobenzene hòa tan trong 500 ml nước cất để trong bình đậy kín đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 60oC trong 10 - 12 giờ) để xử lý rễ ở nhiệt độ 12 - 16oC trong 2 - 3 giờ (Nguyễn Nghĩa Thìn, 2006).

Ngoài ra, để phân tích kiểu nhân người ta thường xử lý dung dịch colchicine kết hợp với hỗn hợp dung dịch paradichlorobenzene đậm đặc và 8-oxyquinolin 0,002 M theo tỷ lệ 1:1 trong thời gian 2 giờ (hai dung dịch này pha trong tủ ấm ở 60oC). Qua thực nghiệm (xem thêm mục 3.1.3) cho thấy, việc ngâm các mẫu rễ trong colchicine 0,03%

trong 2 giờ sẽ thấy xuất hiện nhiều tế bào đang ở kì giữa, tạo điều kiện thuận lợi cho việc quan sát hình thái, số lượng NST trong tế bào.

Đối với hai đối tượng động vật chưa được đề cập trong SGK Trung học Phổ thông là dế mèn và ruồi giấm, cần lưu ý cách xử lý nhược trương cụ thể như sau. Cách xử lý nhược trương trên tế bào tuyến tinh của dế mèn đực, có thể áp dụng tương tự như đối với châu chấu là ngâm KCl 0,4% trong 10 phút. Tuy vậy, chất lượng tiêu bản vẫn chưa thật rõ và đẹp như ở tiêu bản của châu chấu, có lẽ là do đặc điểm riêng của tế bào của mỗi loài (Hình 3.33).

Hình 3.33: Bộ nhiễm sắc thể nhuộm với aceto-orcein 2% - 5 phút ở châu chấu (a) và dế mèn (b)(X400)

Đối với tế bào tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm, sau khi tách tuyến nước bọt trong môi trường đẳng trương NaCl 0,75%, tiến hành nhược trương tế bào tuyến

nước bọt của ruồi giấm bằng dung dịch NaCl 0,5% trong 10 phút (Võ Thị Thanh Phương, 2012). Kết quả thực nghiệm cho thấy NST trải đều nhân, tế bào trương lên nhưng không bị vỡ (Hình 3.34). Nếu muốn quan sát NST khổng lồ ở dạng dàn trải thì cần kết hợp sốc nhược trương với thao tác ép với lực vừa phải để NST trải đều nhưng không bị đứt gãy thành nhiều đoạn nhỏ (Hình 3.35).

Hình 3.34: NST khổng lồ ở ruồi giấm cuộn trong tế bào (X400)

Hình 3.35: NST khổng lồ ở ruồi giấm ở dạng trải (X400)

Thao tác làm mềm mẫu có tác dụng hỗ trợ việc dàn đều tế bào và NST trong mô thực vật. Mục 3.1.6 bên trên đã đề cập đến thao tác làm mềm mẫu rễ hành tỏi bằng HCl hay kết hợp với nhiệt. Đối với mẫu là bao phấn ở hoa hẹ, cần lưu ý rằng thời gian làm mềm mẫu với HCl 1,5N trong 5 phút cho kết quả tốt nhất. Nếu ngâm mẫu ở nồng độ HCl 2N trong 5 phút khi quan sát sẽ thấy hầu hết tế bào bị vỡ, khó quan sát và nhận diện các kì của giảm phân.

Hình 3.36: Tế bào hành tím bị biến dạng do thao tác đun mẫu quá nóng 3.3.2.2. Xử lý thuốc nhuộm để làm bộ NST bắt màu tốt

Phần trên đã trình bày kết quả nghiên cứu về khâu nhuộm NST trên đối tượng hành tỏi. Mẫu rễ được nhuộm với aceto-orcein 2% trong 5 phút đã cho kết quả tốt khi quan sát các kì của nguyên phân và thấy rõ bộ NST bên trong tế bào. Tuy nhiên, đối với tế bào hẹ, cần nhuộm mẫu với aceto-orcein 3% trong 15 phút để cho kết quả tốt (Hình 3.37).

Hình 3.37: Tiêu bản bộ NST của hẹ (X400)

Đối với tế bào động vật, kết quả thực nghiệm cho thấy quá trình nhuộm mẫu đối với tinh hoàn châu chấu và dế mèn tương tự nhau, nếu nhuộm với aceto-orcein 3%

trong 5 phút kết hợp với việc dùng dao lam dầm nhẹ lên mẫu túi tinh vài lần trước khi nhuộm giúp phẩm nhuộm thấm nhanh hơn, có thể thấy rõ NST. Riêng đối với tế bào

tuyến nước bọt của ruồi giấm, cần nhuộm với aceto-orcein 3% trong 30 phút mới có thể thấy rõ các băng sáng tối khi quan sát trên KHV quang học.