CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Nghiên cứu lý thuyết về các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền tạm thời và cố định
Quy ước: Các quy trình tham khảo trong SGK, giáo trình và các tài liệu khác được xem như quy trình chuẩn với ký hiệu chữ “a” đi kèm. Các quy trình sau cải tiến sẽ đi kèm với ký hiệu chữ “b”.
2.3.2. Bố trí thí nhiệm
Các quy trình thực hiện tiêu bản Di truyền trong SGK Sinh học cần tiến hành khảo sát gồm 03 quy trình (SGK Sinh học 10 nâng cao; SGK Sinh học 12 cơ bản và SGK Sinh học 12 nâng cao). Mỗi quy trình sẽ tiến hành bố trí các thí nghiệm để tìm hiểu, phân tích ưu nhược điểm của mỗi bước (công đoạn) từ đó tiến hành cải tiến lại mỗi bước. Mỗi nghiệm thức (mỗi bước) được lặp lại 3 lần, mỗi lần thực hiện với 5
mẫu (đối với mẫu hành tím, thí nghiệm trên 5 đầu rễ có chiều dài bằng nhau của 5 củ hành tím khác nhau). Các công đoạn trong mỗi quy trình được thực hiện nối tiếp nhau, kết quả của công đoạn trước là tiền đề cho công đoạn sau.
Quy trình sau cải tiến cần đạt được các tiêu chí như: cụ thể, đơn giản, dễ thực hiện, rút ngắn thời gian, tiết kiệm hóa chất, loại bỏ các hóa chất gây hại cho sức khỏe nhưng vẫn cho ra những tiêu bản đạt yêu cầu đối với công tác dạy học thực hành Di truyền học ở Việt Nam hiện nay.
Hầu hết các kết quả thu được được đánh giá qua quan sát định tính. Riêng đối với đối tượng hành tím, vốn là một đối tượng nghiên cứu kinh điển, sẽ được khảo sát qua nhiều thí nghiệm hơn, và đánh giá kết quả qua xử lí thống kê.
2.3.3. Xử lý thống kê
2.3.3.1. Cách đếm số lƣợng tế bào trong các thí nghiệm có định lƣợng - Đối với tổng số tế bào có trong một tiêu bản:
Việc đếm toàn bộ số tế bào có trong mỗi tiêu bản đòi hỏi nhiều công sức. Do vậy, để tạo ra một cỡ mẫu chung cho toàn bộ các thí nghiệm có tính định lượng, tiến hành đếm tổng số tế bào có trong 3 tiêu bản lấy ngẫu nhiên và tính trung bình cộng. Đối với mỗi tiêu bản, thực hiện cách đếm như sau:
Tính diện tích của mẫu ép đã dàn đều có trong một tiêu bản (diện tích = a mm2).
Dàn đều một mẫu trên phòng đếm Neubauer cải tiến (Neubauer improved).
Đếm ít nhất 3 ô có diện tích với 1 mm2 chứa các tế bào đã dàn đều và lấy trung bình cộng (giá trị b).
Tính tổng số tế bào có trong 1 tiêu bản: N (tế bào) = a x b
Hình 2.1: Phòng đếm Neubauer và sơ đồ của lưới - Đối với tổng số tế bào có trong mỗi kì ở mỗi tiêu bản:
Đếm toàn bộ tế bào có trong mỗi kì ở mỗi tiêu bản qua KHV quang học ở bội giác X100.
2.3.3.2. Xử lý số liệu
Số liệu được phân tích phương sai một nhân tố, vẽ biểu đồ bằng phần mềm Excel 2010. Việc phân tích sự khác biệt giữa các nghiệm thức được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0.
2.3.4. Khảo sát các bước (công đoạn) trong các quy trình thực hiện tiêu bản tạm thời và cố định
2.3.4.1. Thao tác chuẩn bị mẫu
Đối với hành tím, hành tây và tỏi: Dùng củ đem gieo cho đến khi ra rễ. Cắt lấy chóp rễ để thực hiện tiêu bản nguyên phân và quan sát NST.
Đối với hẹ: Hoa hẹ mua ở ngoài chợ, tách lấy bao phấn trong nụ hoa để thực hiện tiêu bản giảm phân.
Đối với châu chấu và dế mèn: Bắt ở ngoài đồng hoặc mua tại các tiệm bán chim cảnh trong thành phố. Đem về phòng thí nghiệm, chọn con đực kích cỡ phù hợp, tách lấy tinh hoàn, loại bỏ các mô mỡ, để thực hiện tiêu bản giảm phân, quan sát bộ NST.
Đối với ruồi giấm: Bẫy ruồi ngoài thiên nhiên bằng một vài lát chuối chín hoặc trái cây chín đặt trong lọ nhựa và để nơi mát mẻ trong nhà hoặc ngoài vườn. Ruồi sau khi bẫy được chuyển về phòng thí nghiệm nuôi trong lọ thủy tinh có pha sẵn môi trường. Sau vài ngày sẽ thấy xuất hiện ấu trùng (dòi). Tiến hành tách lấy tuyến nước bọt của ấu trùng để quan sát NST khổng lồ.
Trong các tài liệu, hầu hết không nêu cụ thể thời điểm thu mẫu, cách lựa chọn mẫu vật phù hợp cho thí nghiệm, chẳng hạn như: Lúc nào thì cắt rễ hành, tỏi? Chọn trong cụm bông hẹ hoa hẹ cỡ nào là phù hợp? Phân biệt châu chấu hay dế đực và cái, và lựa chọn con đực có kích thước (độ tuổi) nào cho hiệu quả cao?, v.v... Tất cả những vấn đề này sẽ được lưu ý trong thao tác chuẩn bị mẫu nhằm chuẩn hóa công tác chuẩn bị mẫu.
Riêng đối với quy trình làm tiêu bản quá trình nguyên phân ở rễ hành tím, tiến hành định lượng và xử lý thống kê số tế bào đang ở mỗi kì, đồng thời so sánh giữa các nghiệm thức khác nhau về thời điểm thu mẫu (7 giờ; 9 giờ; 11 giờ; 13 giờ)
2.3.4.2. Xử lí đa bội hóa tế bào thực vật
Ngâm mẫu với colchicine ở các nồng độ từ 0,01%; 0,02%; 0,03% trong các khoảng thời gian khác nhau nhằm tìm ra nồng độ và thời gian thích hợp nhất cho việc thực hiện các tiêu bản đột biến đa bội (4n) đối với mẫu vật là hành tím, tỏi và hành tây.
Các mẫu vật đa bội hóa này có thể sử dụng thay thế cho các mẫu thực vật đa bội mà SGK đề cập như môn, ráy vì các loại này không phổ biến bằng và cũng chưa có quy trình hướng dẫn xử lý mẫu cụ thể.
Định lượng và xử lý thống kê đối với kết quả thu được trên đối tượng hành tím.
2.3.4.3. Xử lý sốc nhược trương
Khi thực hiện tiêu bản quan sát NST ở các đối tượng, cần có thêm công đoạn nhược trương mẫu vật trong dung dịch muối nhằm giúp NST phân tán đều trong tế bào, dễ quan sát hình thái và số lượng. Đề tài tiến hành khảo sát hiệu quả nhược trương với KCl 0,1%; 0,2%; 0,3%; 0,4%; 0,5% trong các khoảng thời gian khác nhau đối với tế bào trong rễ tỏi, hành tây và hành tím, trong tuyến nước bọt của ấu trùng ruồi giấm, và trong tinh hoàn của châu chấu và dế mèn (kết quả định tính).
Hình thái và số lượng NST của mỗi loài được quan sát rõ nhất khi tế bào đang ở kỳ giữa. Bên cạnh đó, colchicine được cho rằng có tác dụng cản trở sự hình thành của thoi vô bào cho nên cũng giúp tạo điều kiện cho các NST dàn đều trong tế bào. Do vậy, trong khảo sát này, số lượng tế bào có bộ NST dàn đều cũng được đếm, xử lý thống kê và so sánh giữa 3 cách xử lý: (1) không dùng colchicine và cũng không gây sốc nhược trương (Đối chứng), (2) không dùng colchicine và sốc nhược trương với KCl với nồng độ và thời gian thích hợp, và (3) qua xử lý colchicine với nồng độ và thời gian thích hợp và không gây sốc nhược trương. Kết quả định lượng cũng chỉ được đánh giá trên đối tượng hành tím.
2.3.4.4. Cố định mẫu
Cố định mẫu có tác dụng bảo quản mẫu để sử dụng lâu dài khi không có mẫu tươi. Mẫu rễ tỏi, hành tây, hành tím, tinh hoàn châu chấu và dế mèn được cố định trong dung dịch Carnoy cải tiến (3 cồn : 1 acid acetic) với những khoảng thời gian khác nhau từ 15 phút; 30 phút; 1 giờ. Ngoài ra, đề tài còn tiến hành thực hiện tiêu bản ép đối với mẫu tươi không cần cố định.
2.3.4.5. Làm mềm mẫu
Làm mềm mẫu giúp dàn mẫu dễ dàng hơn và tạo điều kiện cho mẫu bắt màu thuốc nhuộm tốt hơn. Có hai cách làm mềm mẫu. Làm mềm bằng hóa chất, sử dụng HCl 1N, 1,5N và 2N trong các khoảng thời gian ngâm mẫu khác nhau. Làm mềm mẫu bằng nhiệt, cho mẫu vào ống nghiệm có sẵn phẩm nhuộm sau đó đun nhẹ (không cho sôi) trên ngọn lửa đèn cồn.
2.3.4.6. Nhuộm mẫu
Mẫu được nhuộm với phẩm nhuộm aceto-orcein 1%; 2%; 3%; 4% hoặc xanh methylene 1%; 1,5%; 2% (đối với hành tím, tỏi, hành tây) trong khác khoảng thời gian khác nhau.
2.3.4.7. Thao tác lên kính
Lên kính bằng các dung dịch acic acetic 5%; 10%; 15% hoặc nước cất và so sánh hiệu quả.
2.3.4.8. Cố định tiêu bản
Các tiêu bản tạm thời và cố định đạt yêu cầu phải đảm bảo các yếu tố như: tế bào dàn đều, NST bắt màu đậm trong khi tế bào chất bắt màu nhạt, NST dàn đều, tiêu bản không bị bọt khí, vị trí mẫu nằm chính giữa lame, đối với tiêu bản cố định thì cần thêm tiêu chí bền màu với thời gian.
Tiêu bản tạm thời đạt yêu cầu sẽ được chuyển qua khâu cố định, tiến hành khảo sát ở các công đoạn sau:
- Tách lame khỏi lamelle: khảo sát việc tách lame khỏi lamelle qua các cách: (1) để khô tự nhiên; (2) ngâm trong acid acetic 45% trong 10 phút (theo Nguyễn Minh Công, 2007); (3) đặt tiêu bản trên băng đá CO2 trong ngăn đá tủ lạnh (theo Võ Thị Thanh Phương, 2012); (4) đặt tiêu bản trong ngăn đá tủ lạnh ở các khoảng thời gian khác nhau.
- Khử nước bằng cồn ở các khoảng thời gian khác nhau.
- Dán mẫu bằng canada balsam pha trong xylene với tỉ lệ 1:1,5 (v/v).
2.3.4.9. Khảo sát độ bền màu của tiêu bản cố định qua thời gian
Tiến hành quan sát và chụp hình các tiêu bản cố định đạt yêu cầu ngay sau khi thực hiện và sau 1 tháng; 3 tháng; 6 tháng; 1 năm nhằm đánh giá chất lượng tiêu bản.
CHƯƠNG 3