Độc tố nấm mốc ochratoxin

Độc tố nấm mốc ochratoxin

Môn học : Độc tố VSV Giảng viên: TS Bùi Thị Hải Hòa

******************************

Lớp 10-01 Nhóm 6.

OCHRATOXIN

Đề tài thuyết trình

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ViỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

II/ Lịch sử phát hiện Ochratoxin

III/ Tính chất hóa lý Ochratoxin

IV/ Cơ chế tác động của Ochratoxin

 Đặc thù khí hậu và nền sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam tình trạng nhiễm độc tố nấm mốc là khá phổ biến.

 Tìm hiểu, đánh giá đúng độc tố có ý nghĩa rất quan trọng

B/ Tìm hi u B/ Tìm hi u. ể ể

I/ Sơ lược về độc tố nấm mốc:

 Đ/n: Độc tố nấm mốc hay còn gọi là mycotoxins là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp từ nấm mốc () Độc tố nấm mốc có tính bền vững nhiệt độ

cao và không bị tiêu diệt trong quá trình chế biến thức ăn thông thường Ước lượng thực tế có khoảng 300 loại độc tố nấm mốc có hại cho người và động vật

 Xuất hiện: Mycotoxin có thể xuất hiện trước khi thu hoạch hoặc trong thời gian lưu trữ, hoặc trong thức ăn hoàn chỉnh khi không được bảo

quản đúng cách

 Nhiễm độc:

 Cấp tính: Sự nhiễm độc cấp tính do mycotoxin gây nên rất nhiều đợt dịch bệnhvà kèm theo tỉ lệ tử vong rất cao Nhiễm liều thấp gây ra rối

loạn chuyển hóa

 Mạn tính: mycotoxin còn gây nên các bệnh lý rất khác nhau Mycotoxin có thể gây độc cho các hệ thống khác nhau của cơ thể như gan

,thận ,hệ thần kinh ,hệ tiêu hóa của động vật tiêu thụ các sản phẩm nhiễm các độc tố nấm mốc

Các căn bệnh ở người và động vật do nấm mốc gây ra có các đặc điểm sau:

1 Đây là bệnh không lây Điều trị bằng hóa học trị liệu ít hoặc không hiệu quả.

2 Bệnh thường bùng nổ theo mùa, Sự bùng nổ của bệnh thường liên quan đến thức ăn đặc biệt.

3 Mức độ nhiễm bệnh thường chịu ảnh hưởng của tuổi, giới tính, trạng thái dinh dưỡng của cơ thể.

4 Khi kiểm tra thức ăn thấy có dấu hiệu của nấm mốc.

 Độc tố nấm mốc gây độc cho gia súc gia cầm, làm ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi và hiệu quả kinh tế Chúng

còn gây độc trực tiếp cho người, hoặc gián tiếp.

 MỘT SỐ MYCOTOXIN ĐIỂN HÌNH

 MỘT SỐ MYCOTOXIN ĐIỂN HÌNHTên đ c t ộ ố T n t i ồ ạ Ả nh h ng s c kh e ưở ứ ỏ

Aflatoxin

- Đ c t ph bi n nh t ộ ố ổ ế ấ

- T n t i trong m t s lo i h t ng c c (lúa m ch, ồ ạ ộ ố ạ ạ ũ ố ạ

b p, kê, y n m ch, g o, lúa mi ng, lúa mì), s a, th t, ắ ế ạ ạ ế ữ ị

tr ng, n i t ng, ngô, hoa qu khô, gia v ứ ộ ạ ả ị

- Gây ung th ư

- c ch mi n d ch.Tác đ ng lên nhi u h chuy n hóa( gan, th n, m t), h n i Ứ ế ễ ị ộ ề ệ ể ậ ậ ệ ộ

ti t, h x ế ệ ươ ng

- Gi m kh năng ti t s a, đ tr ng và s c đ kháng gia súc, gia c m ả ả ế ữ ẻ ứ ứ ề ở ầ

Ochratoxin A -T n t i trong th t, tr ng, n i t ng, rồ ạ ị ứ ộ ạ ượu, cafe, ng c c, ũ ố

hoa qu khô, n ả ướ c ép nho.

- Gây ung th Gây đ t bi n và quái thai ư ộ ế

- c ch mi n d ch Ứ ế ễ ị

- Kích thích peroxy hóa lipid nh h ng đ n th n kinh Ả ưở ế ầ

Patulin

-N ướ c trái cây, r ượ u táo, các s n ph m t táo ả ẩ ừ - Gây ung thư

- c ch mi n d ch, gây x ng, viêm loét niêm m c ru t Ứ ế ễ ị ư ạ ộ

Vomitoxin,

Zearalenone, Fumonisin -Thường t n t i trong ngô và các s n ph m t ngô.ồ ạ ả ẩ ừ

- Gây ung th Gây đ t bi n và quái thai.R i lo n sinh s n ư ộ ế ố ạ ả

- c ch mi n d ch Kích thích peroxy hóa lipid nh h ng đ n th n kinh Ứ ế ễ ị Ả ưở ế ầ

C/ OCHRATOXIN.

I/ Khái niệm:

các loại nông sản thực phẩm: ngũ cốc, thảo dược, bia,cà phê trong các sản phẩm có nguồn gốc động vật do bị lây nhiễm trước Ochratoxins đc biết đến là sản phẩm của các loài nấm Aspergillus và Penicillium và thường được tìm thấy trong đa dạng các sản phẩm lương thực và thức ăn chăn nuôi.

Hình 1 Penicillium verrucosum Hình Hình 2 Aspergillus 2 Aspergillus

II/ Lịch sử phát hiện Ochratoxin

 Ochratoxin A lần đầu tiên đc tìm thấy ở nấm mốc A ochraceus vùng Nam Phi bởi Scott( 1965) trên hạt lúa miến bị nhiễm A.ochraceus.

 Ở Đức tìm thấy Ochratoxin thường xuyên trong thịt Ở Anh, chúng đc tìm thấy trong đậu nành, bắp bột,

ca cao

 M.Nakajima năm 1997 đã ghi nhận tỷ lệ chiểm 30% ở hàm lượng OTA từ 0.1 – 17,4 µg/kg ở 47 mẫu café được nhập vào Nhật Bản từ các nước Phi , và 1 số nước ASIAN.

 Tại VN, Nghiên cứu tiến hành trên 123 mẫu ngô của 2 xã Cán Tỷ và Lùng Tám huyện Quản Bạ tỉnh Hà

Giang Kết quả cho thấy: trong 123 mẫu ngô được phân tích có tới 50 mẫu (40,7 %) phát hiện

có Ochratoxin A, trong số đó có 2 mẫu (1,6 %) vượt mức dư lượng theo quy định của Bộ Y tế

 Cho tới nay đã phát hiện được 7 loại Ochratoxin khác nhau

III/ Tính chất hóa lý Ochratoxin

 Ochratoxin là đốc tố tinh thể không màu, ít tan trong nước, tan trong các dung môi hữu cơ, như benzen, chloroform Dạng

muối dễ tan trong nước Dạng axit tan trong dung môi phân cực (chloroform, methenol)

 Ochratoxin rất bền vững với các xử lý nhiệt và hóa chất Hiện tại, p2 hay dùng là sử dụng khí quyển điều chỉnh, tăng CO 2 = 30% ức chế hoàn toàn sự tạo thành OTA

• Ochratoxin phát huỳnh quang và hấp thụ UV cực

• Sự sản sinh Ochratoxin phụ thuộc chủng nấm mốc,

hoạt tính của nước trong hạt, cơ chất, nhiệt độ

OTA phát hu nh quang xanhỳ

Con đường xâm nhập

IV/ Cơ chế tác động của Ochratoxin

 Ochratoxin gây ức chế sự vận chuyển của ribonucleic axit (tRNA) và các axitamin

 Ochratoxin còn ức chế vi khuẩn, nấm men và phenylalanine-tRNA ở gan Tác động làm ức chế sự tổng hợp protein trong tế bào và cơ thể.

 Sự ức chế miễn dịch của ochratoxin được biểu hiện làm giảm thực bào và ứcchế tế bào lympho Ức chế tương tự như trên các amino axit synlaza tRNAtương ứng

 OTA gây ức chế hydroxylase phenylalanine, 1 nửa phenylalanine củaOTA là 1 phần hydroxyl hóa để tyrosin gây bệnh các tế bào gan trong cơ thể

 Ochratoxin ức chế sự tổng hợp RNA làm ảnh hưởng đến các protein trong vòngtuần hoàn Tác động đến các tế bào màng ty thể và gây ra các hiệu ứngkhác nhau trên ti thể Kích thích sự hình thành DNA trong thận, gan và lá lách CácDNA này là các sợi đơn bị phá vỡ.

C.I/ OCHRATOXIN B

C.II/ OCHRATOXIN C

C22H22ClNO6

B ng tính ch t lý hóa c a 3 lo i Ochratoxin đi n hình ả ấ ủ ạ ể

5chloro-3,4-dihydro-8- Khối lượng phân tử là 403.822Da.

Hình 3 Cấu tạo OTA

b/ Tính ch t v t lý ấ ậ

 OTA là hợp chất không màu, kết tinh Tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicabonat, tan hạn chế trong nước

 Phổ hấp thụ116-332nm

 OTA có điểm nóng chảy ở 94-96 0C.

 Phổ hồng ngoại trong cloroform cho các peak có độ dài 3380, 1723,1678, 1655 cm-1

 OTA có tính axit yếu pKa14.2-4.4 và pKa2 7.0-7.3.

 OTA phát huỳnh quang xanh khi dùng thiết bị TLC chiếu tia UV ở 366nm

c/ N m m c t ng h p Ochratoxin ấ ố ổ ợ

Aspergillus section Penicillium

Circumdati Flavi Nigri

A cretensis A alliaceus A carbonarius P nordicum

A flocculosus Petromyces albertensis A lacticoffeatus P verrucosum

c/ Nấm mốc tổng hợp Ochratoxin

Hình 4 A cabonius

Đặc điểm:

- Xuất hiện trong trái cây trưởng thành.

- Đề kháng cao với ánh nắng mặt trời.

- Phát triển tốt nhất ở 15-20độ C, hoạt

độ nước 0.95-0.98 aw.

Click to edit Master text styles

- Phát triển tốt nhất ở 24 °C và ở hoạt độ nước 0.95–0.99 aw

- Có thể sản xuất OTA ở nhiệt độ thấp là 5 ° C

d/ Đ c tính ộ

d/ Đ c tính ộ

 Ochratoxin A ( OTA) có tính độc cao nhất Do nhóm hydroxyl phenol được tách ra dễ dàng OTA thường gây ra nhiễm độc mãn tính hơn cấp tính

d.1/ Tác động tới nông sản:

Ngay từ khi gieo trồng, tất cả các loại ngũ cốc đều bị nhiễm nấm mốc Loại nấm mốc này có tên là Fusarium

Hình 7 Fusarium Hình 8 Ngô nhi m n m m c ễ ấ ố

Food products Contamination levels

d.2/ Tác động đối với vật nuôi :

 OTA là độc tố nấm mốc tác động lên cơ quan đích là thận Ảnh hưởng của ngộ độc cấp tính xuất huyết đa ổ ở các cơ quan khác nhau và

fibrin huyết khối trong lá lách, não, gan, thận và tim

• Trên heo:

•Liều gây chết : LD50 1-6mg/kg

- OTA gây tổn thươngthận Hợp chất này được tìm thấy ở thịt

heo và các sản phẩm từ thịt.OTA cũng ảnh hưởng đến sự sinh sản của heo nọc Gây chết hàng loạt ở heo con

Hình 10 Tổn thương thận

Hình 11 Nhiễm độc thịt heo

d.2/ Tác động đối với vật nuôi :

 Ở gà: LD50 3,6mg/kg đối với gà con 10 ngày tuổi

- OTA gây chậm phát triển, khả năng trao đổi giống giảm, sản lượng trứng giảm, tiêu chảy Số lượng các thành phần máu hữu hình và hàm lượng hemoglobin đều giảm Protein tổng số và lipid giảm Độ thanh thải thận cũng giảm

Hình 12 Gà bị nhiễm độc OTA

d.2/ Tác động đối với vật nuôi :

 Trong các loài động vật nhai lại, ochratoxin hấp thụ qua đường máu với một tỷ lệ chuyển hóa thành alpha ochratoxin chất chuyển hóa thành chất không độc hại và ít độc hại.

d.3/ Tác động trên động vật thí nghiệm.

 OTA gây tổn thương gan và gan hoại tử ở động vật thí nghiệm.

 Gây ung thư: Tính chất gây ung thư của OTA đã được thử nghiệm trên chuột Nó làm tăng tỷ lệ mắc các khối u tb gan ở chuột, kết hợp với u tuyến tính và ung thư biểu mô tế bào.thận

 Năm 1993, Cơ quan Quốc tế Nghiên cứu về Ung thư (IARC) phân loại ochratoxin vào nhóm 2B có khả năng gây ung thư

Hình 13 Chu t tn b ung thộ ị ư

Hình 13 Chu t tn b ung thộ ị ư

d.3/ Tác động đối với cơ thể người :

 Ochratoxin A có thể thấm qua da của con người

 OTA gây chứng bệnh suy thận ở người Nh ững trường hợp nhiễm độc OTA cấp tính có thể bị tử vong OTA gây đột biến, tác động vào hệ sinh sản gây quái thai, nhiễm độc thần kinh, hoại tử gan , tăng huyết áp, phù nề, gây độc tố tới hệ thống lympho miễn dịch

Hấp thu, chuyển hoá, thải trừ :

- Ochratoxin A được hấp thu chủ yếu trong dạ dày

- Trong ruột phát hiện thấy ochratoxin độc tố được

phân bố nhiều nhất trong thận, sau đó làgan, cơ và

các tổ chức mỡ

Hình 13 Các c quan b nh hơ ị ả ưởng

Hình 13 Các c quan b nh hơ ị ả ưởng

d.3/ Tác động đối với cơ thể người :



Hình 14

Hình 15.OTA tác đ ng khu th n kinhộ ầ

Hình 15.OTA tác đ ng khu th n kinhộ ầ

-Ochratoxin A có một mối quan hệ mạnh mẽ với não, đặc biệt là các tiểu não và cơ cấu vùng đồi thị.

-Ochratoxin gây ra sự suy giảm nhận thức tạo thành tiền đề của bệnh Parkinson,

-Ochratoxin A có một mối quan hệ mạnh mẽ với não, đặc biệt là các tiểu não và cơ cấu vùng đồi thị.

-Ochratoxin gây ra sự suy giảm nhận thức tạo thành tiền đề của bệnh Parkinson,

Một số tác động khác của OTA

 Ochratoxin A trên sự miễn dịch của thú: Làm giảm tế bào lympho, tăng apoptotic thực bào, tăng lượng bạch cầu ưa acid, làm tăng lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa bazơ và làm giảm sự thực bào

 Tác động lên gene:

 DNA: tổn thương DNA, sửa chữa DNA, và quang sai nhiễm sắc thể.

 RNA: Ochratoxin ức chế sự tổng hợp RNA làm ảnh hưởng đến các protein trong vòngtuần hoàn

 Ochratoxin A trên sự miễn dịch của thú: Làm giảm tế bào lympho, tăng apoptotic thực bào, tăng lượng bạch cầu ưa acid, làm tăng lượng bạch cầu trung tính, bạch cầu ưa bazơ và làm giảm sự thực bào

 Tác động lên gene:

 DNA: tổn thương DNA, sửa chữa DNA, và quang sai nhiễm sắc thể.

 RNA: Ochratoxin ức chế sự tổng hợp RNA làm ảnh hưởng đến các protein trong vòngtuần hoàn

2.6 R ượ u vang, vang trái cây, bao g m c r ồ ả ượ u có ga, tr r ừ ượ u ng t (tráng mi ng) và vang có n ng đ c n ≥15 ọ ệ ồ ộ ồ o

2

2.7 R ượ u th m: g m c r ơ ồ ả ượ u u ng và cocktail ố 2 2.8 N ướ c ép nho: n ướ c ép nho cô đ c, r ặ ượ u nho h o h ng ả ạ 2 2.9 Th c ph m t ng c c cho tr s sinh và tr nh ự ẩ ừ ũ ố ẻ ơ ẻ ỏ 0.5 2.10 Th c ăn kiêng đ ứ ượ c ch đ nh đ c bi t cho tr s sinh ỉ ị ặ ệ ẻ ơ 0.5 2.11 Các lo i gia v : ạ ị

- t : bao g m t t c các lo i , t Ớ ồ ấ ả ạ ươ ng t, t b t, t c a gà , t cay ớ ớ ộ ớ ự ớ

- H t tiêu : h t khô bao g m c tiêu tr ng và tiêu đen ạ ạ ồ ả ắ

Các phương pháp phát hiện OTA trong ngũ cốc

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC)

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng

cao (HPLC)

Nội dung trình bày

HPLC làm sạch bằng silicagel

Phạm vi áp dụng

 Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định OTA với các hàm lượng lớn hơn 0.4 µg/kg trong các mẫu ngũ cốc, quả khô, các hạt

có dầu, đậu đỗ, cà phê nguyên liệu…

 Phương pháp này thử nghiệm trên bột mì cho thấy trong bột mì có chứa hàm lượng OTA từ 0.4 – 1.4 µg/kg.

Nguyên tắc

Sau khi đã axit hóa bằng axit HCl và bổ sung MgCl2 dùng toluene để chiết OTA Làm sạch dịch chiết trên cột Silicagel và xác định OTA bằng sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao trên cột pha đảo, nhận dạng và sửa đổi detector huỳnh quang.

Điều kiện vận hành HPLC

 Pha động: Tỷ lệ: acetonitril (HPLC): Nước: axit axetic = 49:49:2 (Thay đổi tỷ lệ nếu cần)

 Tốc độ dòng: 1ml/phút

 Cột pha tích pha đảo: 250mm x 4.6mm x C18 (5 µm)

 Detector: Huỳnh quang 420nm

 V bơm: 20 µl.

ng ly tâmỐ

50ml d.d chị(V2)

50ml d.d chị(V2)

C t chi tộ ếpha r nắ

C t chi tộ ếpha r nắ

Hút 1ml(V3)

Hút 1ml(V3)

+ 50ml MgCl2 0.4M

=> Khu y đ uấ ềThêm 100ml Toluen

B sung:ổ+ 30ml HCl 2M

+ 50ml MgCl2 0.4M

=> Khu y đ uấ ềThêm 100ml Toluen

Tính toán

WOTA= mt/m0 x F x 1000

Trong đó:

 WOTA : Lượng OTA (µg/ Kg)

 m0 : khối lượng mẫu thử (g)

 mt : khối lượng OTA tương ứng với diện tích pic đọc được từ đường chuẩn (Nanogam)

 F : hệ số pha loãng

HPLC làm s ch b ng Bicabonat ạ ằ

HPLC làm s ch b ng Bicabonat ạ ằ

Phạm vi áp dụng

 Tiêu chuẩn này qui đinh phương pháp xác định Ochratoxin A với các hàm lượng lớn hơn 3µg/kg trong các mẫu ngũ cốc như ngô hạt, cám, lúa mì…

 Phương pháp này thử nghiệm trên mẫu ngũ cốc chứa hàm lượng Ochratoxin A từ 3.0µg/kg đến 16.3µg/kg

Click to edit Master text styles

Điều kiện vận hành HPLC

 Pha động:

axetonitril : Nước : acid acetic = 49:49:2

 Tốc độ dòng:1 ml/phút

 Cột pha tích pha đảo: 250mm x 4.6mm x C18 (5µm)

 Phát hiện huỳnh quang:

+ Bước sóng kích thích: 333 nm

+ Bước sóng phát xạ: 460 nm

 Detector: Huỳnh quang 420 nm

 Vbơm: 20 µ l - 25 µ l

đã phủ diatomit

Bộ lọcsợi thủy tinh

đã phủ diatomit

50g dịch lọc

Phễu chiết

5mlHPLC

Kết quả

Bổ sung:

+ 250ml HCl Clorofom + 50ml H3PO4 0.1M

=> Trộn 3 phútThêm 10g diatomit

Bổ sung:

+ 250ml HCl Clorofom + 50ml H3PO4 0.1M

=> Trộn 3 phútThêm 10g diatomit

Cột chiết

Mẫu thô

+ 10g NaHCO3 30g/l

Nghiền

Tính toán

WOTA= mt/m0 x F x 1000 Trong đó:

 WOTA : Lượng OTA (µg/ Kg)

 m0 : khối lượng mẫu thử (g)

 mt : khối lượng OTA tương ứng với diện tích pic đọc được từ đường chuẩn (Nanogam)

 F : hệ số pha loãng

Đề xuấ

háp

Hạn chế

 Các hiểu biết hiện tại về OTA còn ít so với Aflatoxin

 OTA rất bền vững với các xử lí nhiệt và hóa chất: Chỉ 76% hàm lượng OTA

giảm đi khi gia nhiệt ở 250oC trong 40 phút.

 So với aflatoxin, OTA rất bền vững trong môi trường ẩm: Dung dịch OTA

trong methanol cũng không bị phân hủy khi bị chiếu xạ ( tới 7,5 Mrad ).

Nh ng gi i pháp phòng tr ữ ả ừ

Nh ng gi i pháp phòng tr ữ ả ừ

 kiểm soát sự tăng trưởng nấm mốc.

 Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi.

 Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng để trộn

thức ăn cho thú.

 Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu

 Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo.

 Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho:

 Sử dụng hóa chất chống nấm.

 kiểm soát sự tăng trưởng nấm mốc.

 Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi.

 Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng để trộn

thức ăn cho thú.

 Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu

 Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo.

 Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho:

 Sử dụng hóa chất chống nấm.