Bài tiểu luận phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật chất kháng sinh chất diệt khuẩn độc tố vi nấm

Bài tiểu luận phân tích dư lượng thuốc bảo vệ thực vật chất kháng sinh chất diệt khuẩn độc tố vi nấm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ

KHOA CƠ KHÍ - CÔNG NGHỆ

I: PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT

a Phương pháp hóa sinh

Cholinesteraza ( ChE ) là enzym thủy phân các Esteaxyl của cholin, nó đóng vai trò quan trọng trong hoạt động thông tin giữa các tế bào trong cơ thể sống, đặc biệt là các tế bào của hệ thần kinh ChE bị kìm hãm bởi các nhóm thuốc lân hữu cơ và carbamat

Phương pháp GT-test Kit:

Nguyên tắc : dựa vào đặc tính ức chế axetylcholinestearaza của các loại thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ và carbomat phần Axetylcholinnesteraza tự do (không bị ức chế) sẽ thủy phân Axetylcholin tạo acid Axetic và cholin dựa vào phản ứng tạo màu giữa Axetylcholin còn thừa với thuốc thử GT ta xác định lượng thuốc BVTV trong rau quả

1 Các phương pháp tiến hành

b Phương pháp sinh học

Đây là các phương pháp được sử dụng để kiểm tra độc tố và côn trùng Trong phần lớn các trường hợp chúng được coi như các phép thử định tính Các phương pháp này dược sử dụng khá phổ biến

c Phương pháp hóa lý

- Phương pháp cực phổ: Đây là phương pháp có độ nhạy cao

- Phương pháp quang phổ: Thường được sử dụng để nghiên cứu và định lượng các chất BVTV

-Phương pháp so màu: cơ sở của phương pháp dựa vào phản ứng tạo phức màu đặc trưng cho các chất BVTV

- Phương pháp sắc ký: Các phương pháp hay dùng: sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng, sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Ứng dụng: đây là phương pháp định lượng mới, nó được ứng dụng cho nhiều loại hóa chất BVTV khác nhau trong số đó được dùng phổ biến hơn cả là GC

2 Thực hành

xác định hàm lượng hóa chất BVTV thuộc nhóm lân hữu cơ

2.1 Nguyên tắc: Khi được tách chiết, hóa chất bảo vệ thực vật photpho-nitơ hữu cơ được xác định bằng sắc ký khí (GC) trực tiếp với detector FPD

2.2 Hóa chất:

• Axeton, diclomtan,ete petrol tinh khiết phân tích

• Natri sunfat khan tinh khiết

• Chất chuẩn cho nhóm chất BVTV nhóm photpho hữu cơ

• Dung dịch chuẩn làm việc

• Hút 0,5; 1,0; 2,0ml chuẩn gốc ở trên cho vào bình dịnh mức 10ml và pha loãng tới vạch bằng n-hexan được các nồng độ chuẩn tương ứng là 5;10 và 20ppm

• Bơm vào máy, theo hướng dẩn của phần mềm để lập đường chuẩn và xác định thời gian lưu, diện tích pic

 Tiến hành chiết mẫu

• mẫu được thái nhỏ và trộn điều cẩn thận cần xác định 100g mẫu cho vào bình nón 250ml, thêm 200ml aceton nghiền đồng nhất trong 1 phút lọc qua thiết bị lọc chân không, thu dịch chiết trong bình hút 500ml Cho 800ml dịch lọc mẫu vào phễu chiết 1lit, thêm 100ml ete petrol và 100ml diclometan,lắc mạnh trong 1 phút Lớp hữu cơ bên trong của phểu chiết ban đầu đê lam khô bằng cách cho chạy qua phểu lọc đường kính 10cm có chứa natri sunfat khan bên trên giấy lọc, thu dịch lọc vào bình cô quay

Rửa lớp natri sunfat bằng 50ml diclometan Cô đặc và bay hơi chậm bằng máy

cô quay chân không ở 450C Khi cô đặc còn khoảng 2ml, thêm 10ml axeton và lại cô đến còn khoảng 2ml Lặp lại việc cô đặc 2 lần với 10ml axeton Không

cô khô để tránh phân hủy mẫu

 Phân tích hổn hợp mẫu photpho hữu cơ và natri hữu cơ

• Hòa tan cặn dịch khô đến 10ml bằng axeton

• Bơm 1 µl dung dịch này vào máy sắc ký khí, sử dụng detector FPD với các điều kiện sau: cột SPB- 5 (30m x 0,25mm x 0,25µm ) Nhiệt độ cột: 500C (1 phút), tăng 200C/phút -1200C, tăng 500C/ngày-2500C chế độ bơm: không chia dòng, tốc độ 1ml/phút áp suất khi mang 100kpa

Xi : Hàm lượng hóa chất BVTV “i” có trong 1kg mẫu (mg/kg)

Si: diện tích pic tương ứng mẫu chất “i”

m : khối lượng mẫu phân tích

V : thể tích dịch mẫu cuối cùng, ml

Sm : diện tích pic tương ứng của mẫu chuẩn có chất “i”

m: khối lượng mẫu lấy phân tích, g

2.5 xử lý kết quả

So sánh thời gian lưu của mỗi đỉnh so với chất chuẩn để định tính

So sánh diện tích hoặc chiều cao của mỗi pic với pic chuẩn để định lượngHàm lượng của từng loại hóa chất BVTV được tính theo công thức:

II: PHÂN TÍCH DƯ LƯỢNG CHẤT KHÁNG SINH

1 Các phương pháp tiến hành

1.1 Phương pháp vi sinh

• Các phương pháptrong môi trường lỏng

Mẫu sau khi thanh trùng sẽ được cấy các chủng vi khuẩn nahyj với chất kháng sinh như (Bacillus, Streptococus…) Sau thời gian nuôi cấy nếu như có tạo ra axit lactic thì đó la bằng chứng cho việc không có mặt chất kháng sinh hoặc có ở một giới hạn nhất định Việc xác định có thể tiến hành bằng cách

đo PH hoặc đông tụ sữa Sự tăng tế bào vi khuẩn có thể được xác định bằng

đo độ đục

Các phương pháp trong môi trường thạch

Các chất kháng sinh khi tiếp xúc với môi trường thạch sẽ lan tỏa trong đó Sự lan lỏa tuân theo hàm logarit của nồng độ kháng sinh Sự phát triển của vi sinh vật trong môi trường thạch sau thời gian nuôi cấy cho phép sự có mặt của chất kháng sinh

1.2 Phương pháp điện di

• Mẫu được đưa vào các lỗ đục trên mặt thạch Sau khi tiến hành điện di trên tấm thạch các chất kháng sinh sẽ được phân tách và nhờ đó định tính được, ngoài ra loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác Tấm thạch thứ 2 được cấy một hay nhiều chủng vi sinh vật khác nhau tùy từng loại kháng sinh Sau khi nuôi cấy tiến hành đo đường kính kháng khuẩn từ đó có thể định lượng được loại kháng sinh có trong mẫu

Phương pháp này có các ưu điểm: loại trừ được ảnh hưởng của các chất khác; Xác định được các loại chất kháng sinh; Định lượng kháng sinh

1.3 Phương pháp hóa lý

• Phương pháp phóng xạ - enzym: Dựa trên phản ứng sinh hóa giữa chất kháng sinh và một cofacter có gắn đồng vị C14 Quá trình định lượng được tiến hành 10-15 phút, giới hạn phát hiện đạt 0,05UI/ml đối với penicilin

Phương pháp phóng xạ-miễn nhiễm

• Phương pháp phóng xạ - miễn nhiễm: Cơ sở phương pháp dựa trên đo sự thay đổi hoạt độ của một enzym dưới ảnh hưởng của một kháng thể thích hợp Phương pháp này có thuận lợ là không phải sử dụng chất đồng vị phóng xạ và

có độ nhạy gần với các phương pháp hiện hành

• Phương pháp huỳnh quang: Phương pháp dựa trên việc gắn chất phát quang lên phân tử chất kháng sinh và tiến hành đo bởi máy huỳnh quang dùng ánh sáng phân cực hoặc không phân cực phương pháp này dùng xác định tetracylin, sau khi đun nóng trông môi trường trung tính hoặc kiềm tạo thành phức chất phát quang Giới han phát hiện của phương pháp 2g/g

• Phương pháp quang sinh học : ATP tạo ra bởi vi khuẩn được chuyển thành ADP Luciferza, kèm theo đó là quá trình phát quang và được đo bằng trắc quang kế

• Phương pháp quang phổ: Dùng thiết bị quang phổ UV-Vis và RI cho phép xác định và định lượng penicilin, steptomycin, tetracylin…

• Phương pháp sắc kí: Sắc kí lớp mỏng: dùng xác định dư lượng kháng sinh trong sữa Định lượng có thể dùng phương pháp huỳnh quang Giới hạn phát hiện của phương pháp: tetracylin 0,025 g/ml; Choloramphenicol 1g/ml; neomycin 15 g/ml; treptomycin 0,5 g/ml.Sắc kí khí: áp dụng trong sữa Giới hạn phát hiện: Tetracylin 0,5 – 10 g/ml; Choloramphenicol 0,01 g/ml; penicilin 0,005UI/ml Sắc kí lỏng hiệu nâng cao (HPLC) đây là phương pháp hiện nay được dùng rất phổ biến để định tính và định lượng chất kháng sinh

2 Thực hành: phân tích dư lượng kháng sinh trong streptomycin

2.1 Nguyên tắc: Thuỷ phân streptomycin bằng kiềm cho maltol là hydroxy- 7pyron Sự tạo thành maltol xảy ra hoàn toàn định lượng cho phép xác định được streptomycin Maltol sinh ra được tách khỏi hỗn hợp thủy phân bằng cách dùng clorofooc để chiết khỏi dung dịch mẫu trong môi trường axit, sau đó giải chiết maltol bằng dung dịch kiềm trong nước Cho maltol tác dụng với phèn sắt (III) amonium, dung dịch 2% sẽ sinh ra phức màu đỏ tía đặc trưng

Methyl-3-và đo mật độ quang của phức màu này ở sóng 525 nm để xác định streptomycin Nồng độ của streptomycin được xác định theo phương pháp đường chuẩn

 Lấy mẫu: - Nên lấy mẫu ở dạng còn nguyên bao gói

- Nếu phải lấy mẫu một phần:

• Dụng cụ chứa mẫu phải sạch, khô, không có lỗ rò, miệng rộng có nắp đậy,

vô trùng, có kích thước phù hợp với mẫu cần lấy

• Tốt nhất là dụng cụ chứa mẫu bằng nhựa hay kim loại, hạn chế sử dụng dụng

cụ bằng thủy tinh

• Dùng các dụng cụ vô trùng để lấy mẫu vào dụng cụ chứa, không dùng tay tiếp xúc với mẫu

• Sản phẩm khô, có thể dùng hộp kim loại hay bao PE có thể bịt kín được

• Lấy ít nhất 100g cho mỗi mẫu, không được lấy mẫu đầy bình chứa

• Đối với mẫu lỏng phải phải kiểm soát nhiệt độ tại thời điểm lấy mẫu

2.2 Dụng cụ và thiết bị:

Máy ly tâm

Máy xay sinh tố Bình định mức

Máy trắc quang UV-VIS Phễu chiết

Máy trắc quang UV-VIS

2.3 Hóa chất:

Dùng hoá chất có độ tinh khiết phân tích

- Axit clohydric, dung dịch 1M

 Chuẩn bị mẫu phân tích

• Mẫu thịt cần phân tích được thái nhỏ, nghiền mịn, trộn đều và cân 1 lượng

a = 20g cho vào máy xay sinh tố Thêm 10 ml nước cất vào và cho máy chạy trong 5 phút Cho 5 ml axit clohydric 1 M vào và định mức đến 50 ml bằng nước cất Đun trong bếp cách thuỷ sôi trong 10 phút Để nguội, ly tâm lắng cặn, lấy dung dịch nước trong cho vào phễu chiết, thêm 10 ml clorofooc, lắc trong 10 phút sau đó để yên trong 15 phút cho phân lớp hoàn toàn trong phễu chiết rồi tách lấy tướng hữu cơ vào phễu chiết khác, thêm 2 ml natrihydroxyt 1N và 4 ml thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2% trong axit và nước cất đến 20

ml Lắc mạnh trong 30 phút, sau đó để yên trong 20 phút rồi tách lấy phần dung dịch nước Dung dịch này dùng để đo mật độ quang, xác định streptomycin ở bước sóng 525 nm

• Pha dãy chuẩn: Dùng dung dịch gốc tiêu chuẩn của streptomycin sunphat nồng độ 1mg/ml, tính toán lượng phù hợp để pha dãy dung dịch chuẩn có nồng độ 0,1- 0,5 - 1,0 - 1,5 - 2,0 - 2,5 μg/ml trong các bình định mức có thể tích g/ml trong các bình định mức có thể tích

20 ml sau đó thuỷ phân bằng kiềm, đun cách thuỷ cho sôi 10 phút, để nguội rồi cho 2 ml dung dịch thuốc thử phèn sắt (III) amonium 2%, định mức bằng nước cất đến 20 ml rồi để sau 20 phút mới tiến hành đo

• Tiến hành thử:

+ Đặt sóng đo và bật máy chạy cho ổn định (5 phút);

+ Đo mật độ quang của mẫu chuẩn và mẫu phân tích ở bước sóng 525 nm bằng Cuvét có chiều dày 2 cm Dùng mẫu trắng ở kênh so sánh làm mẫu so sánh và đo mỗi mẫu 3 lần;

+ Lập đồ thị đường chuẩn theo hệ toạ độ D-C Trong đó D là mật độ quang của dung dịch mẫu chuẩn có nồng độ C tương ứng ;

+ Xác định nồng độ Cx của chất phân tích theo đường chuẩn đã dựng được

• Mẫu trắng:

Mẫu trắng phải được chuẩn bị cùng một điều kiện như mẫu phân tích nhưng thay mẫu phân tích trên bằng nước cất sao cho có cùng thể tích

2.5 Xử lý kết quả:

Hàm lượng của streptomycin trong mẫu phân tích được tính theo công thức sau:

Co= (Cx.V) / a Tính bằng g/gTrong đó:

- a là lượng mẫu cân (ở đây a = 20 g)

- V là thể tích pha mẫu (V = 20 ml)

- Cx là nồng độ streptomycin xác định được theo đường chuẩn

III : CHẤT DIỆT KHUẨN

1 Các phương pháp phân tích:

a Phương pháp biến đổi sự chuyển hóa của nấm men

Phương pháp thường dùng là test quá trình lên men.Thực phẩm được đưa đi lên men có bổ sung một lượng chuẩn nấm men saccharomyces cerevisiae rất hoạt động Sau khi nuôi cấy kiểm tra thể tích khí CO2 tạo thành cho phép kết luận có hay không có mặt chất diệt khuẩn

2.1 Phương pháp vi sinh:

b Phương pháp phát triển trong môi trường thạch

Cơ sở của phương pháp là cho mẫu vào trong môi trường thạch Nếu mẫu có chất diệt khuẩn sẽ ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật trên bề mặt thạch Được so sánh với mẫu kiểm chứng tiến hành trong cùng điều kiện phương pháp hay dùng: phương pháp Drieux và Thierry áp dụng cho tất cả các sản phẩm ngoại trừ bơ Phương pháp Mossel và Eijgelaar áp dụng cho phân tích bơ

2.2 Phương pháp hóa lý:

• Acid sorbic và sorbat

Các phương pháp hay dùng: phương pháp so màu, phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại, phương pháp sắc kí khí (GC), phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

• Acid Benzoic dẫn xuất

Dẫn xuất của benzoic có nhiều loại: axit orthoclorobenzoic, paraclorobenzoic, salicylic, parahydroxybenzoic và các ester metyl, propyl, butyl của axit parahydroxybenzoic.Phương pháp thường dùng : sắc kí giấy, sắc kí bản mỏng, phương pháp HPLC

• Anhydric sunfurơ và sunfit

Anhydric sunfurơ được đưa vào thực phẩm lỏng dưới dạng khí sunfurơ, nó

sẽ kết hợp với đường, etanol và các chất màu Nó thường tồn tại một phần dưới dạng SO2 tự do có mùi đặc trưng và có tính diệt khuẩn

Sau khi đốt nóng mẫu và bổ sung nước, axit photphoric, có thể xác định anhydric sunfurơ theo 2 cách:

+ Nhận biết mùi

+ Con đường hóa học: dùng băng giấy amidon có tẩm kali, khi có mặt SO2 , băng giấy sẽ hiện màu xanh Có nhiều phương pháp kỹ thuật dùng định lượng

• Dẫn xuất halogen của axit axetic

Công thức chung CH2XCOOH.Trong đó axit monobromaxetic được dùng nhiều hơn cả Có nhiều phương pháp được dùng:Phương pháp Florentin-Munch,Cristol-Benezech,Jaulnes,Vivario

• Axit boric

Có nhiều phương pháp xác định axit boric trong thực phẩm, ta có thể kể tới

2 phương pháp chính:Phương pháp chuẩn độ,Phương pháp so màu

• Fomrmaldehyt và dẩn xuất

Diemair và Postel đưa ra phương pháp kiềm hóa formol bằng phản ứng với axit cromotropic với sự có mặt của H2SO4.Nếu có formol sẽ xuất hiện màu tím.Censi và Cremonini đưa ra phương pháp định lượng formol bằng cách dùng 2,4-dinitrophenylhydrazin

• Axit formic

Phương pháp Lecoq:Chiết bằng ete petrol, sau đó phần chiết ete được kiềm hóa bằng dung dịch xút 0,1N.Tách pha nước và tiến hành axit hóa bằng H2SO4 1N, sau đó chưng cất đến khi chỉ còn khoảng vài ml dịch chiết.Gia nhiệt phần nước chưng 15 phút bằng đun cách thủy, bổ sung vài hạt tinh thể HgCl2.Nếu có mặt axit formic, se tạo kết tủa trắng.Giới hạn kiểm tra của phương pháp hàm lượng axit ≥ 300mg/l

• Hợp chất flo

Phương pháp Truhaut: sau khi tro hóa, chuyển toàn bộ flo thành axit hydroflosilic bằng cách cho tác dụng với H2SO4 với sự có mặt của silic.Chưng cất cuốn hơi nước, thu axit flohydric (do thủy phân axit hydroflosilic) Chuẩn độ flo bằng đun dịch thori nitrat với chỉ thị natri alizarin-sulfonat hoặc parasulfophenyl-azo-dihydroxynaphtalen-disulfonic(SPADN3)

• Hợp chất amonium

Phương pháp Diemair-Postel: chiết amoni bằng hỗn hợp nước-axeton,tiếp theo bằng dicloetan , thu bằng bromophenol.Các hợp chất amoni tạo phức màu xanh với bromophenol và được định lượng bằng cách so màu ở bước sóng 608nm(xây dựng đường chuẩn ).Phương pháp Miller-Wildbrett:cải tiến từ phương pháp trên, hợp chất amoni tạo phức màu với eosin và so màu ở 542nm

• Hydroperoxyt

Được áp dụng nhiều trong công nghiệp sữa

+ Phương pháp hóa học: Phương pháp Pien, Desirant và Lafontaine; Phương pháp Rouquette; Phương pháp Amin và Olson; Phương pháp Ferrier;Phương pháp Gupta

+ Phương pháp enzym: Có độ nhạy cao hơn phương pháp hóa học

có hypoclorit hoặc cloramin