Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm tạo kháng thể có ái lực cao với fumonisin B1 và B2 (FB1 và FB2), làm nguyên liệu khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh các độc tố trên. Vật liệu và phương pháp: độc tố FB1 được gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây miễn dịch cho gà mái.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 THU NHẬN KHÁNG THỂ IgY CÓ ÁI LỰC CAO VỚI ĐỘC TỐ VI NẤM FUMONISIN SỬ DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN MIỄN DỊCH Đỗ Như Bình*; Trần Thị Huyền Trang** Tạ Mai Trang**; Lê Quang Hòa** TĨM TẮT Mục tiêu: tạo kháng thể có lực cao với fumonisin B1 B2 (FB1 FB2), làm nguyên liệu khởi đầu cho phương pháp miễn dịch phát nhanh độc tố Vật liệu phương pháp: độc tố FB1 gắn với Keyhole limpet hemocyanin (KLH) tạo thành phức hợp FB1-KLH để gây miễn dịch cho gà mái Kháng thể IgY tạo tách chiết, tinh kiểm tra độ đặc hiệu với FB1 FB2 thông qua phản ứng ELISA cạnh tranh gián tiếp Kết quả: thời điểm thu trứng tốt từ - 14 ngày sau lần tiêm cuối quy trình tinh cho chế phẩm IgY có độ tinh cao Giá trị IC50 FB1 FB2 chế phẩm IgY phản ứng ELISA cạnh tranh xác định 10 49 ng/ml Kết luận: chế phẩm IgY tạo nghiên cứu có khả sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất kit nhanh phát nhanh FB * Từ khoá: Fumonisin; Kháng thể lòng đỏ trứng (IgY); ELISA Obtaining High Affinity IgY Against Fumonisin with Potential Use in Immunodiagnostic Summary Objectives: To produce high affinity antibody against fumonisin (FB) FB1 and FB2, that can be used as materials for some immunologic methods in detection of toxin Materials and methods: FB1Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate was made to generate immunogenicity in hen Yolk immunoglobulin (IgY) antibody was purified by extraction and tested the specificity against FB1, FB2 by indirect competitive ELISA Results: The best time for egg collection was - 14 days after the last immunisation and the extraction protocol obtains high purity IgY antibody The IC50 value of IgY against FB1 and FB2 in the indirect competitive ELISA were 10 and 49 ng/ml, respectively Conclusion: IgY can be used as materials for developing rapid test kit to detect FB * Key words: Fumonisin; Yolk immunoglobulin (IgY); ELISA ĐẶT VẤN ĐỀ Độc tố fumonisin nhóm B (FB), thường tồn ngơ thực phẩm có nguồn gốc từ ngô, sản sinh từ chủng nấm Fusarium moniliforme [1] Trong đó, FB1 FB2 coi hai độc tố phổ biến, có độc tính cao nhóm fumonisin, gây nhiều bệnh người động vật chứng nhũn não ngựa, chứng phù phổi lợn, có độc tính gan thận nhiều lồi khác ung thư thực quản người [5, 7] * Học viện Quân y ** Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Như Bình (binhvef2006@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/04/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 25/05/2016 Ngày báo đăng: 27/05/2016 29 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 Hiện nay, phương pháp chuẩn để phát định lượng FB1, FB2 mẫu thực phẩm dựa kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), phương pháp yêu cầu cao thiết bị trình độ kỹ thuật viên, khơng thích hợp với phép phân tích sàng lọc trường Gần đây, nhờ ứng dụng kỹ thuật sắc ký miễn dịch dạng que thử với hợp phần quan trọng que thử phát FB kháng thể [4] việc phát độc tố vi nấm nói chung FB nói riêng đơn giản hóa Mục tiêu nghiên cứu: Sản xuất kháng thể IgY kháng FB1 cách gây đáp ứng miễn dịch gà IgY vận chuyển qua lòng đỏ trứng, tinh với số lượng lớn từ trứng gà phương pháp kết tủa đơn giản, chi phí thấp [2, 3] cầu nối glutaraldehyde dư chưa gắn với FB1 cho tác dụng với 6,5 mg L-lysine (Sigma) với điều kiện có khuấy nhiệt độ phòng Sau trình thẩm tích loại FB1 tự do, sản phẩm cuối tạo cộng hợp KLH-FB1 Cộng hợp BSA-FB1 chế tạo để làm đối chứng dương cho quy trình VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 02 gà mái thời kỳ đẻ trứng tiêm gây đáp ứng miễn dịch với liều 0,2 mg cộng hợp KLH-FB1 tổng thể tích ml chứa 50% tá chất FCA (Freund’s complete adjuvant) ngày Sau 10 ngày (ngày thứ 10), tiêm nhắc lại gà lần thứ với liều 0,1 mg cộng hợp KLH-FB1 tổng thể tích ml chứa 50% tá chất FIA (Freund’s incomplete adjuvant) 10 ngày (ngày thứ 20), tiêm nhắc lại gà lần thứ hai với liều lượng tương tự lần tiêm nhắc lại thứ Trứng gà không tiêm trứng gà tiêm KLH-FB1 thời điểm sau tiêm thu lại để tinh kháng thể IgY nhằm kiểm tra kỹ thuật ELISA Vật liệu nghiên cứu Gà siêu trứng Ai Cập, số lượng 03 Trang trại Gà giống Thụy Phương (Long Biên, Hà Nội) cung cấp Hóa chất sử dụng gồm: độc tố FB1 (Santa Cruz Biotechnology), FB2 (Sigma), kháng thể chuột đơn dòng kháng FB1 (Biotez), cộng hợp phát gắn HRP kháng KLH (Gallus Immunotech) kháng IgY (Santa Cruz Biotechnology) hóa chất khác (Hãng Thermo Scientific, Sigma Promega) Phƣơng pháp nghiên cứu * Chế tạo cộng hợp KLH-FB1 BSAFB1: Để tạo liên kết FB1 với KLH, sử dụng glutaraldehyde để nối gốc -NH2 KLH FB1 Cuối cùng, 30 * Kiểm tra hiệu tạo cộng hợp KLHFB1: Cộng hợp KLH-FB1 đặc tính hóa thơng qua kỹ thuật ELISA kẹp đôi Đo giá trị mật độ quang (OD) bước sóng 450 nm 630 nm máy đọc khay vi thể (Synergy HT, BioTek) Hiệu số giá trị OD450nm OD630nm thể lượng cộng hợp KLH-FB1 có mẫu * Tiêm cộng hợp gây miễn dịch gà mái: * Tinh IgY từ trứng gà: Tách kháng thể IgY trứng gà thu thời điểm tiêm khác theo phương pháp kết tủa PEG (Polson CS, 1985) [6] Sau đó, hòa tan kết tủa TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 thu ml PBS đổi đệm cột 100 kDa (Ultracell, Millipore) với PBS để thu nhận chế phẩm IgY tinh sạch, định lượng cách đo OD bước sóng 280 nm kiểm tra độ tinh điện di SDS-PAGE (12%) * Xác định thời điểm thu trứng có hiệu giá kháng thể IgY cao với FB1: Tiến hành kỹ thuật ELISA gián tiếp để tìm thời điểm thu trứng cho hiệu giá kháng thể IgY cao với FB1 Cường độ màu mạnh, lượng IgY kháng FB1 có mẫu nhiều * Xác định khả phản ứng chế phẩm IgY với FB1 FB2: Hình 1: Hiệu phản ứng cộng hợp KLH-FB1 với kháng thể đơn dòng chuột kháng FB1 (Giá trị OD tính hiệu số OD450nm OD630nm, biểu diễn giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn) Xác định khả phản ứng chế phẩm IgY với FB1 FB2 kỹ thuật ELISA cạnh tranh Cho ủ lượng IgY với 0, 1, 10, 100 1.000 ng FB1 FB2 30 phút 37oC trước cho vào giếng Để đánh giá khả phản ứng chế phẩm IgY thu nhận với FB1 FB2, tiến hành xác định giá trị IC50 FB1 FB2 (nồng độ FB1 FB2 ức chế 50% phản ứng IgY với BSA-FB1 ELISA cạnh tranh) Tính giá trị theo hàm hồi quy logistic dựa mối liên quan giá trị log lượng FB1 FB2 với giá trị OD Khi lượng cộng hợp KLH-FB1 đạt ng/giếng, tương ứng với nồng độ 10 ng/ml, giá trị OD thu bắt đầu có sai khác có ý nghĩa so với mẫu kiểm chứng Kết phù hợp với nghiên cứu hiệu cộng hợp FB1 với protein mang công bố với lượng cộng hợp cho kết dương tính phép thử ELISA nằm khoảng từ 300 ng/giếng [7, 8] Từ đây, nhận thấy tạo thành công cộng hợp KLHFB1 sử dụng cộng hợp để gây đáp ứng miễn dịch cho gà KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Đánh giá độ tinh kháng thể IgY SDS-PAGE Đặc tính hóa cộng hợp KLH-FB1 ELISA kẹp đôi Cộng hợp KLH-FB1 chế tạo nghiên cứu trước tiêm gây miễn dịch gà kiểm tra hoạt tính phản ứng với kháng thể đơn dòng kháng FB1 Sau q trình tinh phương pháp kết tủa với PEG siêu lọc với cột 100 kDa, lượng IgY thu từ trứng đạt 40 - 50 mg (căn theo kết đo OD bước sóng 280 nm, khơng trình bày báo) Đánh giá độ tinh chế phẩm IgY phương pháp điện di biến tính SDS-PAGE 31 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 Hình 2: Điện di SDS-PAGE (12%) kiểm tra độ tinh kháng thể IgY sau bước quy trình tinh (M: Marker protein Gangnam Stain; 1: 10 µg kháng thể IgY sau kết tủa với PEG; 2,3,4: 3, 10, 30 µg kháng thể IgY sau siêu lọc với cột 100 kDa) Ngồi băng vị trí 65 kDa, tương ứng với tiểu phần lớn IgY 25 kDa, tương ứng với tiểu phần nhỏ IgY, chế phẩm IgY sau kết tủa với PEG chứa hai protein tạp có kích thước khoảng 40 45 kDa Tuy nhiên, sau siêu lọc qua cột 100 kDa, loại bỏ hoàn toàn protein tạp nhiễm Ngay điện di 30 µg chế phẩm IgY không quan sát băng nhiễm tạp Như vậy, quy trình tinh kết hợp kỹ thuật siêu lọc kết tủa với PEG cho phép tạo chế phẩm IgY có độ tinh cao Lựa chọn thời điểm thu trứng cho hiệu giá kháng thể cao IgY từ trứng gà không tiêm, trứng gà tiêm PBS tá chất FCA/FIA, trứng gà thu thời điểm khác sau tiêm cộng hợp gây đáp ứng miễn dịch tinh kiểm tra khả phản ứng cộng hợp BSA-FB1 thơng qua kỹ thuật ELISA gián tiếp Hình 3: Ảnh hưởng thời gian thu trứng lên hiệu giá chế phẩm IgY 32 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 Kết thử nghiệm cho thấy IgY thu từ trứng gà không tiêm trứng gà tiêm PBS tá chất FCA/FIA không phản ứng với BSA-FB1 Chứng tỏ trước tiêm cộng hợp, gà khơng có đáp ứng miễn dịch với FB1, PBS thành phần tá dược không gây đáp ứng miễn dịch gà tạo IgY có phản ứng với FB1 Trong đó, gà tiêm cộng hợp KLH-FB1, kể từ ngày thứ 23 sau tiêm, trứng bắt đầu tạo IgY có phản ứng với FB1 Hiệu giá kháng thể FB1 đạt mức cao khoảng 29 - 34 ngày sau tiêm, hay - 14 ngày sau lần tiêm cuối Như vậy, với quy trình gây đáp ứng miễn dịch gồm lần tiêm, khoảng cách lần tiêm 10 ngày, lượng cộng hợp KLH-FB1 sử dụng A 0,2 0,1 mg, hiệu giá kháng thể đạt cao thời điểm - 14 ngày sau lần tiêm cuối, phù hợp với nghiên cứu Schade CS [7] cần phải có lần tiêm kháng nguyên để gây tính đáp ứng miễn dịch gà, kháng thể tinh từ lòng đỏ trứng, nên kiểm tra 14 ngày sau lần tiêm cuối xem tính đáp ứng miễn dịch hay khơng? Xác định khả phản ứng chế phẩm IgY với FB1 FB2 Để đánh giá khả phản ứng chế phẩm IgY thu nhận với FB1 FB2, tiến hành xác định giá trị IC50 FB1 FB2 (nồng độ FB1 FB2 ức chế 50% phản ứng IgY với BSA-FB1 ELISA cạnh tranh) B Hình 4: Khả phản ứng IgY với FB1 FB2 A IgY FB1 B IgY FB2 Ngay nồng độ thử nghiệm nhỏ (10 ng/ml) (tương ứng với lượng độc tố FB1 FB2 đưa vào giếng ng), giá trị OD thu giảm mạnh so với mẫu kiểm chứng Khi nồng độ FB1 FB2 đạt mức µg/ml, giá trị OD không giảm nữa, nồng độ tăng lên đến 10 µg/ml Giá trị IC50 FB1 xác định 10 ng/ml, IC50 FB2 49 ng/ml So với nghiên cứu Marcel CS [5], giá trị IC50 FB1 với 14 dòng kháng thể chuột đơn dòng nằm khoảng 300 - 670 ng/ml Như vậy, nhận thấy lực chế phẩm IgY tạo nghiên cứu cao nhiều lần 33 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2016 so với kháng thể đơn dòng nghiên cứu Nghiên cứu Yan-son CS (2012) [10], IC50 FB1 với kháng thể đơn dòng 11 ng/ml, đồng thời kháng thể đơn dòng có phản ứng chéo với FB2 (60,4%) Các thông số trùng khớp với kết thu Xét mặt giá thành, sử dụng 0,5 µg chế phẩm IgY cho phép thử miễn dịch nêu trên, theo tính tốn, từ trứng gà lựa chọn thời điểm tối ưu, chúng tơi tinh 40 50 mg chế phẩm IgY đủ để thực từ 80.000 - 100.000 phản ứng miễn dịch Đây ưu điểm việc sử dụng kháng thể IgY để chế tạo phép thử miễn dịch phát nhanh FB nói riêng tác nhân gây bệnh nói chung KẾT LUẬN Nghiên cứu tạo thành công chế phẩm IgY có lực cao với FB1 FB2, có khả sử dụng sinh phẩm miễn dịch phát độc tố Hiện nay, chế phẩm sử dụng để chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát nhanh độc tố FB thực phẩm Phản ứng chéo kháng thể IgY với độc tố vi nấm khác aflatoxin, ochratoxin A, zearalenone tiếp tục đánh giá thời gian tới TÀI LIỆU THAM KHẢO Antonissen G et al Fumonisins affect the intestinal microbial homeostasis in broiler chickens, predisposing to necrotic enteritis Vet Res 2015, 46 (1), p.98 Chalghoumi R, Y Beckers, D Portetelle, A Théwis Hen egg yolk antibodies (IgY), production and use for passive immunization against bacterial enteric infections in chicken: 34 a review Biotechnol Agron Soc Environ 2009, 13 (2), pp.295-308 Dias dSW; DV Tambourgi IgY: a promising antibody for use in immunodiagnostic and in immunotherapy Vet Immunol Immunopathol 2010, 135, pp.173-180 Kadir MKA, IE Tothill Development of an electrochemical immunosensor for fumonisins detection in foods Toxins Basel 2010, (4), pp.382-398 Marcel H, Elissalde et al Development of an improved monoclonal antibody‐based Elisa for fumonisin b1–3 and the use of molecular modeling to explain observed detection limits (2), Food and agricultural immunology 1995, pp.109-122 Polson A, T Coetzer, J Kruger, E vonMaltzahn, KJ vanderMerwe Immunol Invest 1985, 14, p.323 Schade R, Calzado EG, Sarmiento R, Chacana PA, Porankiewicz-Asplund J, Terzolo HR Chicken egg yolk antibodies (IgYtechnology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine Altern Lab Anim 2005, 33 (2), pp.129-154 Venkataramana M, K Navya CS, SR Priyanka, HS Murali, HV Batra Development and validation of an immunochromatographic assay for rapid detection of fumonisin B1 from cereal samples J Food Sci Technol 2014, 51 (9), pp.1920-1928 Wang DS, Liang YX, Nguyen TC, Le DD, Tanaka T, Ueno Y Natural co-occurrence of fusarium toxins and aflatoxin B1 in corn for feed in north Vietnam Nat Toxins 1995, (6), pp.445-449 10 Yan-Song L, Z Yu, L Shi-Ying, G DeJun, R Hong-Lin, M Xian-Mei, BHZL Chao, W Zhe, L Xiao-Bing, L Zeng-Shan Development of a one-step test strip for rapid screening of fumonisins B1, B2 and B3 in maize Food Control 2012, 24, pp.72-77 ... FB2, có khả sử dụng sinh phẩm miễn dịch phát độc tố Hiện nay, chế phẩm sử dụng để chế tạo que thử sắc ký miễn dịch phát nhanh độc tố FB thực phẩm Phản ứng chéo kháng thể IgY với độc tố vi nấm. .. điểm thu trứng có hiệu giá kháng thể IgY cao với FB1: Tiến hành kỹ thu t ELISA gián tiếp để tìm thời điểm thu trứng cho hiệu giá kháng thể IgY cao với FB1 Cường độ màu mạnh, lượng IgY kháng FB1 có. .. miễn dịch Đây ưu điểm vi c sử dụng kháng thể IgY để chế tạo phép thử miễn dịch phát nhanh FB nói riêng tác nhân gây bệnh nói chung KẾT LUẬN Nghiên cứu tạo thành cơng chế phẩm IgY có lực cao với