Tài liệu Vấn đề: Đề xuất quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chuẩn đoán bệnh ung thư. pptx

Vấn đề: Đề xuất quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chuẩn đoán bệnh ung thư. Giải quyết vấn đề: 1. Khái niệm bệnh ung thư Ung thư (Cancer) là một loại bệnh của các tế bào, nó là một quá trình bệnh lý trong đó một số tế bào (cell) thoát ra khỏi sự kiểm soát, sự biệt hóa sinh lý của tế bào và tiếp tục nhân lên không giới hạn. Những tế bào này có khả năng xâm lấn và phá hủy các tổ chức xung quanh, đồng thời chúng di trú và đến phát triển ở nhiều cơ quan khác nhau và hình thành nên di căn, cuối cùng là gây nên tử vong. Ung thư là bệnh của nhóm hơn 100 bệnh. Ung thư là loại bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất. Người phân chia ung thư thành nhiều loại khác nhau dựa trên vị trí phát sinh của chúng trên cơ thể (ung thư phổi, ung thư vòm họng, ung thư vú, ung thư buồng trứng – tinh hoàn ), hoặc có thể phân chia theo giai đoạn (giai đoạn sớm, giai đoạn cuối ). Các loại ung thư khác nhau có tỷ lệ tử vong khác nhau. Bảng 1: Ước tính số ca mắc mới và tỷ lệ tử vong trong 1 năm của bệnh ung thư Loại ung thư Số trường hợp mắc mới Số trường hợp tử vong Ung thư bàng quang 61.420 13.060 Ung thư vú (kể cả nam giới) 212.920 - 1.720 40.970 - 460 Đại tràng và trực tràng (kết hợp) 148.610 55.170 Ung thư nội mạc tử cung (tử cung) 41.200 7.350 Ung thư thận (tế bào thận) 31.890 10.530 Bệnh bạch cầu (tất cả) 35.070 22.280 Ung thư phổi (bao gồm cả phế quản) 174.470 162.460 U hắc tố 62.170 7.910 U lympho không Hodgkin 58.870 18.840 Ung thư tụy 33.370 32.300 Ung thư tuyến tiền liệt 234.460 27.350 Ung thư da (không hắc tố) >1.000.000 Không có số liệu Ung thư tuyến giáp 30.180 1.500 Bệnh ung thư là một dạng bệnh rất nguy hiểm, việc chẩn đoán bệnh, và tình trạng bệnh có vai trò rất quan trọng trong phòng và đưa ra hướng điều trị cho bệnh ung thư. Hiện nay, có nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh ung thư như: chẩn đoán bằng vật lý, giải phẫu, hóa sinh (xác định dấu ấn ung thư – tumor maker) - Phương pháp vật lý: chẩn đoán bệnh bằng việc sờ nắn, chụp chiếu (x- quang, chụp nhiệt, chụp cộng hưởng từ ), nội soi, siêu âm. - Phương pháp giải phẫu: đưa ra nhiều thông tin quý giá về khối u, nhưng hạn chế về mặt tâm lý, gây nhiều đau đớn khi tiến hành chọc hút sinh thiết) - Phương pháp hóa sinh (Enzyme – miễn dịch): có thể xác định chính xác mà không gây đau đớn do chỉ cần lấy mẫu máu và nước tiểu. Sử dụng chất chỉ thị (chất do tế bào ung thư – tế bào K tiết ra, đưa vào máu như AFP, CEA, Hormon). - Ngày nay, khoa học về chẩn đoán ung thư đang phát triển rất nhanh, có nhiều biện pháp chẩn đoán hiệu quả, chính xác như: chụp cắt lớp đơn vị phát xạ Positron (PET), đây là phương pháp mới chẩn đoán hình ảnh mới nhất, tuy nhiên việc áp dụng còn khó khăn do giá cả chuẩn đoán ung thư sử dụng kháng thể đơn dòng đang là phương pháp có tính khả thi nhất do yếu tố nhanh chóng nhưng chính xác cao, không gây đau đớn và giá thành tốt. 2. Một số nét về kháng thể đơn dòng 2.1. Kháng nguyên Kháng nguyên là một chất lạ, khi đưa vào cơ thể động vật ở điều kiện thích hợp sẽ gây ra cho cơ thể phản ứng chống lại - những phản ứng đó được gọi là "sự đáp ứng miễn dịch" (sinh kháng thể hoặc gây mẫn cảm) để tự bảo vệ. 2.2. Kháng thể - Định nghĩa kháng thể: Kháng thể là các phân tử Globulin miễn dịch (immunoglobulin) có bản chất Glycoprotein, do các tế bào lympho B (B cells) cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. - Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một kháng nguyên (epitope) duy nhất. - Kháng thể được tìm thấy chủ yếu trong huyết thanh của động vật, cũng có thể tìm thấy trong sữa. - Kháng thể có sẵn trong sữa hoặc huyết tương gọi là kháng thể tự nhiên (kháng thể không đặc hiệu). - Kháng thể được đưa vào cơ thể gọi là kháng thể tập nhiễm (kháng thể đặc hiệu). 2.3. Kháng thể đơn dòng - Các kháng thể đơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên. - Kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên. - Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinh học và y học, chúng vừa là phương tiện chẩn đoán, vừa là công cụ điều trị. Thí dụ, chúng được ứng dụng trong một phương pháp phát hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay. - Trước đây việc sản xuất cũng như ứng dụng kháng thể còn gặp nhiều khó khăn do kháng thể sản xuất ra có giá thành cao, nhưng đời sống ngắn. Trong những năm gần đây, khoa học kỹ thuật phát triển, công nghệ kháng thể đã có những bước tiến dài và có ứng dụng rộng rãi trong đời sống. 3. Sử dụng kháng thể đơn dòng trong chẩn đoán ung thư - Tiêm vào người bệnh một kháng thể đơn dòng có gắn một chất chỉ điểm sinh học (đồng vị phóng xạ, protein phát quang, enzyme) có khả năng nhận biết tế bào ung thư. Kháng thể đơn dòng sẽ tìm tế bào ung thư để bám vào. Nhờ chất chỉ điểm sinh học mà máy huỳnh quang sẽ chụp hình và phát hiện ra tế bào ung thư, cũng như tình trạng ung thư dựa vào kích thước và sự phát tán tế bào ung thư. - Nguyên lý: sử dụng kháng thể đơn dòng đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu. Dựa trên cơ sở sự tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể, có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm màu (đồng vị phóng xạ, protein phát quang, enzyme ). - Tiêu chuẩn của kháng thể đơn dòng: i. Có tính đặc hiệu tổ chức (khác với Protein của tế bào lành tổng hợp ra). ii. Đặc hiệu cơ quan (tính đặc hiệu đích) chỉ tác dụng với tế bào ung thư. iii. Dễ lấy, dễ bảo quản. iv. Nhạy ở nồng độ thấp (phát hiện bệnh sớm). v. Độ nhạy cao (phản ánh tình trạng bệnh). - Chất chỉ dùng là enzyme peroxidase (POD), phân hủy Hydrogen Peroxide thành oxygen và nước (H 2 O 2  H 2 O + ½ O 2 ), oxygen sinh ra sẽ oxy hóa chất không có màu thành có màu. 4. Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư - Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư gồm có nhiều giai đoạn: chọn vật gây nhiễm, chọn kháng nguyên (Ag – Antigene), gây đáp ứng miễn dịch, thu tế bào lách và tế bào u tủy (tế bào myeloma – có khả năng nhân lên vô hạn), dung hợp tế bào lách và tế bào u tủy tạo nên tế bào lai (Hybridoma), sàng lọc dòng hóa tế bào lai, nhân sinh khối kháng thể đơn dòng, thu và tách chiết, bảo quản kháng thể đơn dòng. - Ta có sơ đồ khái quát quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư như sau: Hình 1: Sơ đồ khái quát quy trình Chú thích: (1): tiêm chủng (2): lấy huyết thanh của 1con vật mẫn cảm cao (3) + (4): dung hợp tế bào lách và myeloma (5): chọn lọc và nuôi In Vivo (6): dòng hóa tế bào lai Hybridoma (7): thu nhận và tinh chiết tế bào lai (8): gắn chất chỉ thị sinh học sử dụng để chẩn đoán ung thư - Giải thích các bước trong quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư. i. Chọn động vật gây nhiễm: động vật gây nhiễm thường sử sụng trong quy trình này là chuột nhắt, chuột cống hay thỏ. ii. Chọn kháng nguyên (Antigene) Quá trình này quyết định sự thành công của quy trình, quyết định tính hiệ quả ứng dụng của sản phẩm tạo thành, quyết định quy trình sản xuất sản phẩm. Kháng nguyên được sử dụng ở đây có thể là: AFP (Alpha Fetoprotein) của bệnh ung thư gan, VCA (Viral Capside Antigene) của bệnh ung thư vòm họng, CA-125 (Cancer Antigene – 125) trong ung thu buồng trứng – loại kháng nguyên mà 80% số người mắc bệnh sinh ra rất nhiều. iii. Gây đáp ứng miễn dịch Tiêm kháng nguyên vào cho vật nhiễm: thường tiêm vào các vị trí tĩnh mạch, da và dưới da, cơ, khoang bụng. Gây đáp ứng miễn dịch khác loài và cùng loài cho vật nhiễm. iv. Dung hợp tế bào lách và tế bào u tủy (myeloma) Tế bào lách có đặc trung sinh kháng thể kháng lại kháng nguyên của bệnh ung thư, tế bào u tủy (myeloma) có đặc trưng sinh sản vô hạn định. Việc dung hợp 2 loại tế bào này tạo ra một “nhà máy” sản xuất kháng thể đơn dòng. Các kỹ thuật sử dụng trong dung hợp tế bào lai thường dùng: kết dính tự nhiên, sử dụng hóa chất PEG (PolyEthylene Glycol). v. Chọn lọc tế bào lai Sử dụng thể đột biến của tế bào lai Myeloma Môi trường nuôi cấy là HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine). Nguyên lý chọn lọc: (1) tế bào Lympho B (B cells) không dung hợp hay tế bào lai giữa chúng với nhau; (2) tế bào lai không dung hợp hay tế bào lai giữa chúng với nhau; (3) tế bào lai giữa tế bào lá lách (Lympho B) với tế bào u tủy (Myeloma) có khả năng tổng hợp kháng thể lại có khả năng tăng sinh trong môi trường HAT. vi. Sàng lọc tế bào lai: sàng lọc những tế bào lai sản xuất kháng thể mục tiêu. vii. Nhân sinh khối, tách chiết, tinh chế: sử dụng một số phương pháp như: sắc kí ái lực, sắc kí trao đổi ion,lọc gel, sắc kí cao áp, kết tủa với muối Amonium sulfate hay Caprylic acid. viii. Gắn chất chỉ thị sinh học Các chất chỉ thị là những chất có khả năng thay đổi màu sắc khi được chiếu huỳnh quang, hay gây ra phản ứng đổi màu khi gặp cơ chất (Protein, enzyme ). Các chất chỉ thường dùng như đồng vị phóng xạ, protein phát quang, hay enzyme 5. Áp dụng phương pháp chẩn đoán ung thư bằng kháng thể đơn dòng 5.1. Hạn chế - Hệ thống miễn dịch của con người nhận diện kháng thể đơn dòng sản xuất từ tế bào lá lách ( tế bào lypho B) của chuột như một protein lạ, và tạo ra các kháng thể để chống lại, trung hòa hoặc làm giảm hiệu quả. - Một số kháng thể đơn dòng tiếp cận và bám với kháng nguyên, tuy nhiên không có tác dụng trung hòa hay phá hủy. - Thành phần kết hợp với khang thể đơn dòng có thể bị tách ra và gây biến chứng trong quá trình sử dụng. - Khó thâm nhập, phá hủy khối u được bao bọc chắc chắn trong mạng mạch máu. 5.2. Khắc phục - Đưa tế bào lympho của người vào cơ thể chuột. - Sử dụng công nghệ gene. - Thay chuột bằng đối tượng khác (vi sinh vật ), tạo ra kháng thể đơn dòng nhỏ hơn, hữu hiệu hơn, gắn chặt với vật mang hơn, thâm nhập dễ dàng hơn vào khối u, và đặc biệt là có giá thành rẻ hơn. 6. Kết luận - Chẩn đoán bằng kháng thể đơn dòng là phương pháp tiên tiến, có nhiều tính ưu việt: tác dụng nhanh, độ chính xác cao, tiến hành dễ dàng và không gây đau đớn. - Các mặt hạn chế của phương pháp chẩn đoán ung thư bằng kháng thể đơn dòng đều đã được khắc phục, do đó việc áp dụng phương pháp này ngày càng được mở rộng. . Vấn đề: Đề xuất quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chuẩn đoán bệnh ung thư. Giải quy t vấn đề: 1. Khái niệm bệnh ung thư Ung thư. 4. Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung thư - Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng sử dụng trong chẩn đoán bệnh ung