Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng, ưu nhược điểm

Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng, ưu nhược điểm

THẢO LUẬN NHÓM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

ĐỀ BÀI : QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG, ƯU

NHƯỢC ĐIỂM.

1 KHÁNG THỂ.

Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein ), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất.

•Cấu trúc điển hình:

•Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi

nặng (H, heavy, tiếng Anh, màu tím trong hình 3) giống hệt nhau

và hai chuỗi nhẹ (L, light, tiếng Anh, màu xanh lá trong hình 3)

cũng giống hệt nhau Có hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do đó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ

có thể cùng là κ hoặc cùng là λ Các chuỗi của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có độ đàn hồi nhất định

2 KHÁNG THỂ

2 KHÁNG THỂ

Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố định nhưng phầnđầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên giữacác kháng thể khác nhau, để tạo nên các vị trí kết hợp

có khả năng phản ứng đặc hiệu với các khángnguyên tương ứng, điều này tương tự nhưmột enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó Có thể tạm

so sánh sự đặc hiệu của phản ứng kháng thể-khángnguyên với ổ khóa và chìa khóa

2 KHÁNG THỂ

6

Các domain hằng định:

• Các domain hằng định (C, constant, tiếng Anh) đặc trưng bởi các

chuỗi amino acide khá giống nhau giữa các kháng thể Domain hằng định của chuỗi nhẹ ký hiệu là CL Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng định, tùy theo lớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và

CH4.

• Các domain hằng định không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể Do đó, phần "chân" của chữ Y còn được gọi là Fc (tức

là phần hoạt động sinh học của kháng thể F: fragment,

c: cristallisable)

2.KHÁNG THỂ

• Mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên

(V, variable, tiếng Anh) ở đầu tận hai "cánh tay" của

chữ Y Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên

chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi

nhẹ (VL) tạo nên vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope) Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên Hai vị trí này giống nhau như đúc, qua đó một kháng thể có thể gắn được với 2

2 KHÁNG THỂ

8

2.KHÁNG THỂ

• Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần nhận

biết kháng nguyên, F: fragment, ab: antigen binding).

Domain kháng nguyên nơi gắn vào kháng thể gọi là epitope

• Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rấtnhiều giữa các kháng thể Chính sự biến thiên đa dạng nàygiúp cho hệ thống các kháng thể nhận biết được nhiều loạitác nhân gây bệnh khác nhau Cơ chế tạo nên sự biến thiênnày sẽ được đề cập ở những phần sau

10

2 KHÁNG THỂ

Đầu thập niên 1980, người ta khám phá ra các tự

kháng thể hình thành tự phát với số lượng ít, thường

đặc hiệu với nhiều kháng nguyên của cơ thể nên gọi

là đa đặc hiệu Các tự kháng thể này khá lành, không

gây phản ứng hủy diệt như các tự kháng thể trong cácbệnh tự miễn, khi cơ chế điều hòa miễn dịch bị quamặt

3 KHÁNG THỂ

Tính đặc hiệu của phản ứng kháng thể-kháng nguyên:

• Cũng chính Erhlich, vào đầu thế kỷ 20, đã đề xuấtrằng các kháng thể được sản xuất sẵn trong cơ thể,độc lập với mọi kích thích từ bên ngoài Vai tròcủa kháng nguyên là đẩy mạnh sự sản xuất kháng thểđặc hiệu tương ứng

• Mô hình của Erhlich đã được chứng minh là đúngmặc dù ở thời của ông người ta chưa phân biệt được 2loại lympho B và lympho T Cơ thể đã chuẩn bị sẵnkháng thể cho hầu như mọi "kẻ xâm nhập" tiềm năng

12

2.KHÁNG THỂ

Trong quá trình phát triển và biệt hóa các tế bàolympho B, có sự tái tổ hợp các gene mã hóaimmunoglobulin Trong mỗi tế bào lympho B, tổ hợpgene của phần biến thiên chỉ xảy ra 1 lần sẽ giữnguyên đến hết đời sống của tế bào đó Nếu vượt quađược các cơ chế chọn lọc, lympho B sẽ tiếp tục sống:

2 KHÁNG THỂ

• Lympho B sẽ tồn tại ở dạng naive cho đến khi gặp kháng

nguyên tương ứng.

• Nếu không gặp kháng nguyên, lympho B hoạt động cầm

chừng dưới dạng naive đến hết đời của nó.

14

của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là nguyên tắc của việc ngừa bệnh bằng vắc-xin

2 KHÁNG THỂ

Trong các immunoglobulin mà cơ thể có thể tạo ra, cónhững phân tử rất giống với nhau Khi một khángnguyên tiếp xúc với hệ miễn dịch, các dòng kháng thểtương tự đều được kích thích với những mức độ khácnhau, trong đó dòng đặc hiệu chính danh là đáp ứngmạnh nhất, nổi bậc nhất

16

2 KHÁNG THỂ

• Ái lực của kháng thể với kháng nguyên:

• Liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên, tương tự như giữa enzyme và cơ chất, có tính thuận nghịch Liên kết mạnh hay yếu tùy vào số lượng liên kết và độ đặc hiệu giữa vùng nhận diện kháng nguyên trên kháng thể và cấu trúc epitope tương ứng.

2 KHÁNG THỂ

18

• Ái lực của kháng thể đối với kháng nguyên là hợp lựccủa các lực liên kết yếu không đồng hóa trị (liên kếthydro, lực van der Waals và các liên kết ion ) Cáclực liên kết yếu này chỉ có tác dụng trong một bánkính nhỏ, do đó sự đặc hiệu (hay tính chất bổ sung)trong cấu trúc không gian 3 chiều của 2 vùng phân tử

có vai trò quyết định đối với ái lực của kháng thể vớikháng nguyên

2 KHÁNG THỂ

• Như vậy, một kháng nguyên có thể được nhận diệnbởi nhiều kháng thể với độ đặc hiệu khác nhau, dòngkháng thể nào phù hợp nhất về cấu trúc 3 chiều vớiepitope sẽ được khuếch trương mạnh nhất

2 KHÁNG THỂ

Các lớp kháng thể (hay isotype):

• Các kháng thể được phân thành 5 lớp hay isotype, tùy

theo cấu tạo của các domain hằng định của các chuỗinặng: các chuỗi γ, α, μ, ε và δ lần lượt tương ứng vớicác immunoglobulin (Ig) thuộc các lớp IgG, IgA,IgM, IgE ,IgD

20

2 KHÁNG THỂ

• IgG

IgG là loại immunoglobulin monomer (mono=1), làkháng thể phổ biến nhất trong máu, sữa non và cácdịch mô Đây là isotype duy nhất có thể xuyênqua nhau thai, qua đó bảo vệ con trong những tuần lễđầu đời sau khi sinh khi hệ miễn dịch của trẻ chưaphát triển Vai trò chính của IgG là hoạt hóa bổ

2 KHÁNG THỂ

• IgA

IgA chiếm khoảng 15 - 20% các immunoglobulin trongmáu, nó chủ yếu được tiết tại các mô niêm nhầy (chẳnghạn trong ống tiêu hóa và hệ hô hấp) Nó còn được tiếttrong sữa non, nước mắt và nước miếng nước bọt Lớpimmunoglobulin này chống lại (bằng cách trung hòa)các tác nhân gây bệnh tại những nơi chúng được tiết ra

Nó không hoạt hóa bổ thể, khả năng opsonise hóa cũngrất yếu Có hai dạng IgA là IgA1 (90%) và IgA2 (10%)

22

2 KHÁNG THỂ

• Khác với IgA1, các chuỗi nặng và nhẹ của IgA2không nối với nhau bằng các cầu disulfide mà bằngcác liên kết không đồng hóa trị IgA2 có ít tronghuyết thanh, nhưng nhiều trong các dịch tiết

2 KHÁNG THỂ

• Trong các dịch tiết, IgA có dạng dimer (di=2), nối với nhau bằng hai chuỗi phụ Thứ nhất là một chuỗi J

(join - nối; không phải là các gene J của

immunoglobulin), một polypeptide có khối lượng

phân tử 1,5 kDa, giàu cysteine và khác biệt hoàn toàn với các chuỗi immunoglobulin khác Thứ hai là một

chuỗi polypeptide có tên secretory component cùng

có khối lượng phân tử 1,5 kDa, do các tế bào biểu

mô tiết ra IgA còn tồn tại dưới dạng trimer (tri = 3)

và tetramer (tetra = 4)

24

2 KHÁNG THỂ

• IgM

IgM tạo nên các polymer (poly = đa, nhiều) do cácimmunoglobulin liên kết với nhau bằng các cầu nối đồnghóa trị disulfide, thường là với dạng pentamer (penta = 5)hoặc hexamer (hexa = 6) Khối lượng phân tử của nó khálớn, xấp xỉ 900 kDa Chuỗi J thường thấy gắn với nhiềupentamer, trong khi các hexamer lại không chứa chuỗi J docấu trúc không gian không phù hợp Do mỗi monomer có

2 KHÁNG THỂ

• Vì là một phân tử lớn, IgM không có khả năng xuyên thấm, nó chỉ tồn tại với lượng rất nhỏ trong dịch kẽ IgM chủ yếu ở trong huyết tương, chuỗi J rất cần cho dạng xuất tiết Nhờ tính chất polymer, IgM rất "háu" kháng nguyên và rất hiệu quả trong việc hoạt hóa bổ thể Nó còn được gọi là các "kháng thể tự nhiên" vì lưu hành trong máu ngay cả khi không có bằng chứng

về sự tiếp xúc với kháng nguyên

26

2 KHÁNG THỂ

• Ở các tế bào dòng mầm, segment gene mã hóa vùng μhằng định của chuỗi nặng được giải mã trước cácsegment khác Do đó, IgM là immunoglobulin đầutiên được sản xuất bởi tế bào B trưởng thành

2 KHÁNG THỂ

• IgE

IgE là loại immunoglobulin monomer trong

đó carbonhydrate chiếm tỷ lệ khá lớn Khối lượngphân tử của IgE là 190 kDa IgE có trên màng bàotương của bạch cầu ái kiềm và tế bào mast ở mô liênkết IgE giữ một vai trò trong phản ứng quá mẫn cấpcũng như trong cơ chế miễn dịch chống ký sinh trùng.Kháng thể loại IgE cũng có trong các dịch tiết, khônghoạt hóa bổ thể và là loại immunoglobulin dễ bị hủybởi nhiệt.

28

2 KHÁNG THỂ

• IgD

IgD là loại immunoglobulin monomer chiếm chưađầy 1% trên màng tế bào lympho B Chức năng củaIgD chưa được hiểu biết đầy đủ, nó thường biểu hiệnđồng thời với IgM và được xem như một chỉdấu (marker) của tế bào B trưởng thành nhưng chưa

tiếp xúc kháng nguyên Có lẽ nó tham gia vào cơ chế

2 KHÁNG THỂ

• Vai trò của kháng thể:

• Trong một đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chứcnăng chính: gắn với kháng nguyên, kích hoạt hệthống bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch

30

2.KHÁNG THỂ

• Có 2 loại kháng thể :

- Kháng thể đơn dòng: liên kết với một epitope đặc hiệu.

- Kháng thể đa dòng : là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên cùng một kháng nguyên.

2.1 KHÁNG THỂ ĐA DÒNG

• Kháng thể đa dòng:

Các kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể

tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng.

32

2 2 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn Theođịnh nghĩa, tất cả các kháng thể đơn dòng cùngmộtdòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởicùng một dòng tương bào

• Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinhhọc và y học, chúng vừa là phương tiện chẩn đoán,

2 2 KHÁNG THỂ

ĐƠN DÒNG

• Trước đây, việc sản xuất kháng thể đơn dòng in vitro rất khó khăn do đời sống ngắn ngủi của cáctương bào Kháng thể chỉ thu được in vivo bằng cáchtiêm một kháng nguyên cụ thể vào một động vật rồichiết lấy kháng thể trong máu Phương pháp này rấttốn kém nhưng chỉ thu được lượng kháng thể rất ít,không thuần nhất và bị ô nhiễm

34

2 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

• Một tiến bộ to lớn đã đạt được cuối nhữngnăm 1970 bởi Cesar Milstein và Georges Köhler với

kỹ thuật hybridoma (tế bào lai giữa 1 lympho B cókhả năng sản xuất kháng thể với 1 tế bào ung thư cóđời sống khá dài)

2 2 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

36

từ lympho B

38

2.3 KĨ THUẬT LAI TẠO KHÁNG THỂ

ĐƠN DÒNG

- Tiêm các tế bào khối u vào chuột để kích thích các tế bào lympho

B tạo ra các kháng thể.

- Hòa lẫn các tế bào myeloma bất hoại được chọn với các lympho B

- Sự kết hợp sẽ tạo ra tế bào lai (hybridomas) có khả năng sinh sản

vô hạn (nhận từ tế bào myeloma) và tiết ra kháng thể đặc hiệu (nhận

từ tế bào lympho B).

2.3 KĨ THUẬT LAI TẠO KHÁNG THỂ

ĐƠN DÒNG

40

2.4 ƯU ĐIỂM KHÁNG THỂ ĐƠN

2.5 HẠN CHẾ CỦA KHÁNG THỂ

ĐƠN DÒNG

- Hệ thống miễn dịch của con người nhận diện KTĐD (được sản

xuất từ tế bào B của chuột) như là protein lạ nên tạo ra các kháng thể chống lại chúng, thậm chí trung hòa chúng, làm hiệu quả của chúng suy giảm đáng kể Hơn nữa, một số KTĐD khi tiếp cận và bám được vào các kháng nguyên, chúng không trung hòa hoặc phá hủy được các kháng nguyên gây bệnh.

- Thành phần kết hợp với KTĐD được đưa vào cơ thể bệnh nhân có thể bị tách ra và đi khắp nơi, gây nên các phản ứng phụ và hậu quả khó lường Ngoài ra, với một số khối u được bao bọc chắc chắn bởi các lớp mạch máu nuôi dưỡng, KTĐD rất khó thâm nhập vào bên trong để phá hủy.

- Giá thành đắt

42

2.5 HẠN CHẾ CỦA KHÁNG THỂ

ĐƠN DÒNG

Để khắc phục những hạn chế trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu đưa tế bào lympho B của người vào cơ thể chuột, các tế bào B này sẽ tạo ra các KTĐD mà hệ thống miễn dịch của bệnh nhân sẽ chấp nhận như là của mình Các nghiên cứu mới đây còn dùng công nghệ gene và thay thế chuột bằng các vi khuẩn để tạo các KTĐD nhỏ hơn, hoạt động hữu hiệu hơn, gắn chặt các vật mang hơn, thâm nhập các khối u dễ dàng hơn và đặc biệt là giá thành rẻ hơn.

2.6 Ứng dụng của kháng thể đơn dòng

• Có thể được dùng để chẩn đoán và chữa trị các bệnh nhiễm

trùng, dùng để thử nghiệm miễn dịch để phát hiện các kháng nguyên với nồng độ thấp.

44

2.7 Chữa trị ung thư máu bằng kháng thể

đơn dòng Alemtuzumab

• - Bệnh ung thư máu CLL là bệnh lý ác tính của dòng limpho B tăng lên quá mức bình thường về số lượng (chỉ dưới 2% là của dòng limpho T)

• - Khi bị bệnh đa số các tế bào máu sẽ phát triển thành các tế bào bạch cầu limphocytes không bình thường và không thể

đảm nhiệm chức năng của một bạch cầu chống lại bệnh tật

2.7 Chữa trị ung thư máu bằng kháng thể

đơn dòng Alemtuzumab

- Alemtuzumab là một kháng thể đơn dòng tái tổ hợp dạng IgG1

đã được “người hóa”

- Là một kháng thể của người có với các phần CDR (vùng xác định bổ trợ) có nguồn gốc từ chuột quyết định khả năng kháng thể lk với kháng nguyên

- Có 95% là từ người và 5% là từ chuột nên giảm bớt được sự đáp ứng miễn dịch của người.

46

2.7.1 Quy trình sản xuất kháng thể đơn

dòng Alametuzumab

• Phân lập cDNA của chuỗi L và H từ dòng TB u tủy- lá lách chuột.

• Các CDR của cDNA khuếch đại bằng PCR

• Ghép CDR chuột vào khung kháng thể người.

• CDR với vùng thay đổi được nhân dòng biểu hiện

• Đưa vào tế bào đích (E.coli hoặc TB ĐV có vú).

• Kháng thể Alemtuzumab được “người hoá”.

2.7.2 Tác động của Alemtuzumab tới các

tế bào ung thư limpho B trong điều trị

bệnh CLL

• Kháng thể Alemtuzumab khi được đưa vào trong cơ thể người sẽ tìm

và liên kết đặc hiệu với CD52 (một glycoprotein trên bề mặt các tế bào limpho trưởng thành.

48

2.7.2 Tác động của Alemtuzumab tới các

tế bào ung thư limpho B trong điều trị

bệnh CLL

• Alemtuzumab đã lk với CD52 => gây ra các phản ứng đáp ứng miễn dịch trong cơ thể người bệnh tiêu diệt các tế bào ung thư có CD52 trên bề mặt.

• Tủy xương trước (trên) và sau (dưới) khi điều tri bằng kháng thể Alemtuzumab => mật độ tế bào ung thư giảm.

- Có thể gây viêm phổi, các cơn đau tim, các vấn đề về gan, thận,

và các vấn đề về tiêu hóa.

50

2.8 Các ứng dụng khác

- Thử thai: Khi một người nữ mang thai, hormon HCG (human

chorionic gonadotropin) được bài tiết qua nước tiểu Cho dung dịch KTĐD liên kết với một enzym, sẽ biến đổi màu khi có sự hiện diện của HCG, vào ống nghiệm đựng nước tiểu Nếu nước tiểu đổi màu thì có thai và ngược lại Que thử thai ứng dụng công nghệ này đã giúp chị em phụ nữ tự xác định mình

có thai hay không rất nhanh chóng và tiện lợi.

- Chẩn đoán bệnh Aids: Cũng với nguyên tắc trên, KTĐD giúp

2.8 Các ứng dụng khác

- Ghép tạng: KTĐD giúp xác định mô người cho có tương

thích với người nhận hay không và ngăn ngừa hệ thống miễn dịch của bệnh nhân thải loại mô ghép.

52

2.8 Các ứng dụng khác

• Trong bệnh tim mạch: Một loại protein cơ có tên myosin hiện diện với số lượng lớn trong các cơ bắp Một phần myosin ở cơ tim bị phá hủy sau cơn nhồi máu Bằng cách tiêm KTĐD đáp ứng với myosin, người ta có thể xác định được số lượng

myosin mất đi để đánh giá tình trạng của tim bệnh nhân.

• KTĐD cũng được dùng để xác định vị trí cục máu đông trong

cơ thể bệnh nhân bằng cách gắn vào sợi huyết (fibrin) phát

sinh khi có cục máu đông Việc này giúp các bác sĩ chẩn đoán

và xử lý kịp thời cho người bệnh.