Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng procestedon

Nghiên cứu tạo dòng tế bào llai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng procestedon

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-

   -

NGUYỄN HẢI ðĂNG

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ðƠN DÒNG KHÁNG PROGESTERON

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : CHĂN NUÔI

Người hướng dẫn khoa học : TS ðỖ THỊ THẢO

HÀ NỘI - 2008

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………i

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan các kết quả nghiên cứu của tôi trong luận văn này là hoàn toàn trung thực, do tôi thực hiện và chưa sử dụng ñể bảo

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………ii

LỜI CẢM ƠN!

Trong quá trình thực hiện ñề tài của luận văn tốt nghiệp này, ngoài

sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy, cô giáo trong khoa Chăn nuôi- Thuỷ sản cùng toàn thể bạn bè, sự giúp ñỡ tận tình của tập thể cán bộ công nhân viên Phòng công nghệ tế bào ñộng vật - Viện công nghệ sinh học

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS ðỗ Thị Thảo và PGS TS

ðỗ Khắc Hiếu, phòng Công nghệ tế bào ñộng vật - viện Công nghệ sinh học ñã tạo ñiều kiện, hướng dẫn và giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài này

Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS -TS Nguyễn Bá Mùi, cán bộ giảng dạy bộ môn sinh hoá - sinh lí ñộng vật - Khoa Chăn nuôi - Thuỷ sản - Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội ñã hướng dẫn và giúp ñỡ tôi tận tình ñể hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn ñối với gia ñình, bạn bè và những người thân ñã luôn thường xuyên chia sẻ, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 20 tháng 08 năm

2008

Tác giả

Nguyễn Hải ðăng

Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ẦẦẦiii

MỤC LỤC Lời cam ựoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các chữ vết tắt v

Danh mục các bảng vi

Danh mục các hình vii

Danh mục các sơ ựồ viii

1 MỞ đẦU 1

1.1 Tắnh cấp thiết của ựề tài 1

1.2 Mục ựắch của ựề tài là 3

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Miễn dịch và ựáp ứng miễn dịch 4

2.2 Hiểu biết về hormon sinh dục- Progesteron 28

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước thuộc lĩnh vực ựề tài 33

3 đÔI TƯỢNG, NỘi DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36

3.1 đỐI TƯỢNG 36

3.2 NỘI DUNG 37

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

4.1 đánh giá kết quả gây ựáp ứng miễn dịch bằng phương pháp ELISA 43

4.2 Lai tạo tế bào lai sản xuất kháng thể ựơn dòng kháng P3 - Al 48

4.3 Tách dòng tế bào lai sinh kháng thể ựơn dòng kháng progesteron 51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………iv

4.4 Gây báng cho chuột 59

4.5 Kiểm tra hiệu giá kháng thể 59

5 KẾT LUẬN 63

5.1 KẾT LUẬN 63

5.2 ðỀ NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………v

DANH MỤC CÁC TƯ VIẾT TẮT

P3- Al (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim)- Albumin

P3- BSA (Progesterone - 3-( O - carboxymethyl) - oxim) - BSA

BSA (Bovine Serum Albumin)

ATCC (American Type Culture Collection)

DMEM (Dulbeco 7s Modified Eagles Medium)

DMSO (Dimethyl Sulphoxide)

EIA (Enzyme Immuno Assay)

ELISA (Enzyme Linking Immuno Sorbent)

FBS (Fetal Bovine Serum)

FSH (Follicle Stimulating Hormone)

FDA (Food and Drug Adminitration)

GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone)

HPRT (Hypoxanthin - Phospho - Ribosyl- Transferase)

HAT (Hypoxanthin - aminopterin- thimidine) medium

LH (Luteinizing Hormone)

PBS (Photphate Buffered Saline)

PEG (Polyethylen glycol) FCA (Freund complex Adjuvant) RIA (Radio immuno assay)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………vi

DANH MỤC CÁC BẢNG Số bảng Tên bảng Trang 1 Kết quả ñáp ứng miễn dịch của chuột thí nghiệm 44

2 Sự có mặt của kháng thể kháng ñặc hiệu Progesteron trong các mẫu huyết thanh thu từ các chuột gây ñáp ứng miễn dịch với P3 – Al (n=5) 47

3 Tỷ lệ giếng có tế bào lai trên tổng số giếng thực hiện dung hợp. 50

4 Tỷ lệ giếng có kháng thể kháng progesteron trên tổng số giếng có tế bào lai 53

5 Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể ñơn dòng kháng Progesteron trên 2 dòng tế bào. 54

6 Hiệu quả tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 55

7: Giá trị OD của dịch nổi của các giếng dương tính kháng progesteron có 1 dòng tế bào 56

8 Tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng do 5 dòng tế bào tạo ra 58

9 So sánh hiệu giá kháng thể của dịch nổi và dịch báng. 60

10 Kết quả tinh sạch kháng thể ñơn dòng bằng (SAS) và Propur Kit. 61

11 Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thí nghiệm 62

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………vii

DANH MỤC CÁC HÌNH Số hình Tên hình Trang 1 Cấu trỳc ñiển hỡnh của khỏng thể 11

2 Bề mặt của khỏng thể IgG 12

3 Sơ ñồ cỏc chuỗi của một khỏng thể .12

4 Cỏc ñộc tố của vi khuẩn bờn cạnh một tế bào cơ thể .14

5 Cỏc ñộc tố trờn bị trung hoà bởi khỏng thể 15

6 Khỏng thể ñơn dũng liờn kết với một epitope ñặc hiệu 19

6 Cụng thức cấu tạo của progesteron 30

7 (A) Tế bào Sp2/0 ở ñộ phúng ñại 10ì20; (B) Tế bàoP3X ở ñộ phúng ñại 10ì20 49

8 (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder (B) Tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder; 51

9 (A) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng; (B) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng 53

10 Kiểm tra hiệu giá kháng thể ñơn dòng ở các ñộ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần 60

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………viii

DANH MỤC CÁC SƠ ðỒ

1 Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng 21 2a Quá trình hình thành progesteron 30 2b Quá trình thái biến của progesteron 30

1

1 MỞ ðẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Cơng nghệ sinh học là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực lâu dài chinh phục tự nhiên để nâng cao điều kiện sống của con người Thế giới cùng nhau chia sẻ những kiến thức khoa học, thực hành và cơng nghệ Bên cạnh những lĩnh vực đang phát triển rất cao như: cơng nghiệp điện tử, cơng nghệ thơng tin, chúng ta đang chứng kiến sự gia tăng phát triển ngày càng lớn mạnh của cơng nghệ sinh học (CNSH)

Cĩ nhiều lĩnh vực CNSH khác nhau theo đối tượng ứng dụng như CNSH phân tử, CNSH thực vật, CNSH động vật…CNSH cĩ ứng dụng rộng rãi trong y dược, lương thực, thực phẩm, năng lượng, hĩa chất, vật liệu mới, nơng lâm ngư nghiệp, bảo vệ mơi sinh và ngày nay trong thể thao đỉnh cao CNSH cũng được áp dụng một cách hiệu quả

Trong CNSH, tế bào được coi là đối tượng trung tâm vơ cùng quan trọng Chúng cĩ cấu trúc phức tạp và tinh vi, thực hiện quá trình trao đổi chất như một nhà máy hĩa học với nhiều ưu việt Do tế bào cĩ nhiều ưu thế nên CNSH đã sử dụng tế bào làm nhà máy sản xuất và là cơng cụ thử nghiệm CNSH tế bào người và động vật cĩ nhiều ứng dụng trực tiếp liên quan đến con người nên phát triển rất nhanh, nĩ đáp ứng nhiều nhu cầu cho phịng và chữa trị bệnh và nhiều ứng dụng trong nơng nghiệp nhất là trong lĩnh vực chăn nuơi…ðặc biệt, trong thế kỉ XX đã cĩ 3 phát minh nền tảng của CNSH động vật mà cả thế giới phải xơn xao và cơng nhận, đĩ là kháng thể đơn dịng,

tế bào gốc, và nhân bản vơ tính động vật

Sự ra đời của kháng thể đơn dịng là một bước tiến quan trọng, đặc biệt

là trong chẩn đốn và cĩ triển vọng lớn trong sản xuất thuốc hướng mục tiêu

2

Trong quá trình hội nhập kinh tế, phát triển ngành chăn nuơi là chiến lược trong phát triển ngành nơng nghiệp nước ta ðời sống người dân ngày càng được nâng cao, nhu cầu về các sản phẩm thịt, trứng, sữa tăng mạnh, do

đĩ cơng tác phát triển nhanh đàn gia súc, gia cầm cần được quan tâm, chú trọng Bên cạnh việc ứng dụng các kích dục tố để nâng cao khả năng sinh sản thì hướng nghiên cứu sử dụng kháng thể đơn dịng để chẩn đốn sớm cĩ thai, phát hiện các rối loạn sinh sản ở con cái…cĩ giá trị thực tiễn Do trong thời gian đầu của quá trình mang thai, bào thai cịn quá nhỏ, tồn bộ cơ quan sinh dục cịn biến đổi chưa nhiều nên rất khĩ chẩn đốn khi khám bằng phương pháp quan sát bên ngồi, sờ, nắn, gõ, nghe, khám qua trực tràng, khám qua

âm đạo…Mặt khác, cịn cĩ thể nhầm với triệu chứng một số bệnh ở cơ quan sinh dục nên càng khĩ khăn hơn Ngồi ra, do mối liên quan giữa hệ thống màng nhung của nhau thai và niêm mạc tử cung chưa chặt chẽ nên dễ gây xảy thai

Progesteron là hormon sinh sản được tiết ra chủ yếu từ thể vàng buồng trứng và một phần do nhau thai Hàm lượng progesteron cĩ liên quan chặt chẽ đến động thái của quá trình sinh sản Progesteron là hormon “chìa khĩa" để thiết lập và duy trì một chu kì sinh sản bình thường của con cái

Các nghiên cứu trong và ngồi nước về định lượng progesteron trong huyết thanh, sữa và nước tiểu đã cho kết quả trong ứng dụng chẩn đốn cĩ thai sớm và các bệnh sinh sản liên quan Tuy nhiên, các phương pháp hĩa lí địi hỏi nồng độ progesteron phải cao (mg/ml), tách chiết, tinh sạch phức tạp mới xác định được kết quả Phương pháp ELISA sử dụng kháng thể đơn dịng (monoclonal antibody) cho kết quả nhạy (µg/ml) khơng địi hỏi tách chiết và tinh sạch, độ chính xác cao hơn

Xuất phát từ những lí do trên chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài:

"Nghiên cứu tạo dịng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dịng kháng progesteron"

3

1.2 Mục ñích của ñề tài

- Sản xuất ñược kháng thể ñơn dòng kháng progesteron có thể ñược sử

dụng vào các mục ñích ñịnh lượng progesteron trong dịch sinh học (Huyết

thanh, nước tiểu, nước bọt v.v.)

4

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Miễn dịch và ựáp ứng miễn dịch

Sinh vật luôn luôn bị ựe dọa bởi các tác nhân gây bệnh và các tác nhân

có hại khác, do vậy phải có sự thắch ứng ựa dạng ựể bảo vệ mình

Miễn dịch là khả năng của cơ thể chống lại các kháng nguyên Kháng nguyên (KN) là những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như vi trùng, virus, chất ựộcẦ

đáp ứng miễn dịch (đƯMD) là phản ứng của cơ thể nhận ra vật lạ và loại trừ chúng ra khỏi cơ thể

Có hai loại đƯMD là: đƯMD tự nhiên và đƯMD thu ựược

a đƯMD tự nhiên tuyệt ựối

đây là đƯMD mà trong bất cứ ựiều kiện nào, hoàn cảnh nào cũng không

bị mất ựi, có thể tiêm vào cơ thể ựộng vật một lượng lớn mầm bệnh cũng không có khả năng gây bệnh, vắ dụ: Bất cứ dưới ựiều kiện nào, bò không bao giờ mắc bệnh tị thư của ngựa, bệnh dịch tả lợn, ngựa không bao giờ mắc bệnh dịch tả trâu bòẦ

b đƯMD tự nhiên tương ựối

Là tắnh miễn dịch có thể thay ựổi khi chịu một sự tác ựộng nào ựó trong một ựiều kiện và thời gian nhất ựịnh như khi chịu tác dụng cao của ựộc lực vi sinh vật, hoặc thay ựổi nhiệt ựộ hay sức ựề kháng của cơ thể giảm Ầ

5

Vắ dụ: bình thường gà không bao giờ mắc bệnh nhiệt thán nhưng khi ngâm chân gà trong nước lạnh cho thân nhiệt giảm xuống rồi gây nhiễm vi khuẩn nhiệt thán thì gà bị bệnh

2.1.2 đƯMD thu ựược

đƯMD thu ựược có hai loại: đƯMD thu ựược chủ ựộng và đƯMD thu ựược bị ựộng

Trong đƯMD thu ựược chủ ựộng, cơ thể tiếp nhận kháng nguyên và có thể tự tổng hợp ra kháng thể Trong đƯMD thu ựược bị ựộng, cơ thể ựược tiếp nhận trực tiếp kháng thể (vắ dụ: tiêm truyền kháng thể hay kháng huyết thanh)

a Miễn dịch thu ựược chủ ựộng tự nhiên

Là tắnh miễn dịch mà cơ thể có ựược sau khi mắc một số bệnh nhất ựịnh trong tự nhiên mà qua khỏi Loại miễn dịch này có thể kéo dài rất lâu có khi suốt ựời

Vắ dụ: Sau khi mắc bệnh ựậu mùa mà qua khỏi thì không bao giờ mắc lại nữa; hay nếu bị bệnh sởi mà qua khỏi thì không bao giờ mắc nữa

Ngoài ra trong quá trình sống của người và ựộng vật do tiếp xúc dần dần với vi sinh vật, mà không bị bệnh, nhưng nó ựã hình thành cho mình một khả năng miễn dịch với các bệnh do vi sinh vật ựó gây nên Vắ dụ miễn dịch hình thành ựối với bệnh bạch cầu, bệnh ho gà

b Miễn dịch thu ựược chủ ựộng nhân tạo

Là miễn dịch có ựược của cơ thể sau khi ựược tiếp nhận chủ ựộng những chế phẩm vi sinh vật như các vacxin, giải ựộc tốẦ lúc này cơ thể ựã huy ựộng các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch sản xuất ra các yếu tố chống lại mầm bệnh nếu chúng vào lần sau, ựó là các kháng thể ựặc hiệu đây là loại miễn dịch hình thành với mục ựắch làm cho cơ thể tập dượt trước, ựể khi vi sinh vật

có ựộc lực xâm nhập vào thì cơ thể sẽ chủ ựộng loại trừ chúng Chắnh ựây là

cơ sở cho việc tiêm phòng vacxin: Lao, Dịch tả lợn, đóng dấu lợnẦTiêm

c Miễn dịch thu ñược bị ñộng tự nhiên

Trẻ sơ sinh, gia súc non thu ñược các yếu tố miễn dịch, các kháng thể ñặc hiệu từ cơ thể mẹ truyền sang qua nhau thai hay kháng thể truyền qua sữa ñầu cho gia súc non ñược gọi là MDTð bị ñộng tự nhiên

d Miễn dịch thu ñược bị ñộng nhân tạo

Là ñáp ứng miễn dịch thu ñược từ bên ngoài ñưa vào giúp cơ thể chiến thắng ñược bệnh tật Trong trường hợp này, cơ thể không tham gia tạo kháng thể mà kháng thể ñược cung cấp cho cơ thể từ bên ngoài MDTð bị ñộng nhân tạo ứng dụng trong chữa bệnh Ví dụ: tiêm giải ñộc tố uốn ván cho người nhiễm uốn ván, tiêm kháng huyết thanh phòng dại…

2.1.3 Các cơ quan và tế bào tham gia vào ñáp ứng miễn dịch

Thực chất của quá trình ðƯMD là hoạt ñộng của hai loại tế bào lympho B và lympho T với sự tham gia của ñại thực bào và sự phối hợp ñiều khiển của các cơ quan dạng lympho

2.1.3.1 Các cơ quan dạng lympho

Các cơ quan dạng lympho trung tâm là nơi mà quá trình biệt hóa của lympho bào xảy ra không cần ñến sự kích thích của kháng nguyên, ñó là nơi biệt hoá của các tế bào nguồn thành các tế bào lympho T chín hoặc lympho B chín

Các cơ quan dạng lympho gồm có:

7

*Tủy xương (Bone narrow): là cơ quan tạo máu của cơ thể ñóng vai trò quan

trọng trong việc sản xuất ra các tế bào nguồn của các dòng lympho bào khác nhau và của ñại thực bào Các tế bào lympho nguồn (non) sẽ ñi ñến các cơ quan lympho khác ñể biệt hóa thành tế bào lympho B hoặc lympho T

*Tuyến ức (Thymus): nằm ngay sát sau xương ức, xuất hiện ở tháng thứ ba

của thời kì bào thai, hoàn thiện và ñạt tối ña về hoạt ñộng ở giai ñoạn trước tuổi dậy thì Tuyến ức có các nang làm nhiệm vụ sản xuất các tế bào lympho Các tế bào lympho ñược sinh ra từ tuyến ức hay từ tủy xương di tản xuống ñều ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tế bào lympho phụ thuộc tuyến ức hay còn gọi là lympho T (Thymus)

*Túi Fabricius (Brusa Fabricius)

Túi này chỉ có ở loài chim, nằm phía trên trực tràng, sát lỗ huyệt Túi

có cấu tạo gồm rất nhiều nang, các nang này là nơi sản xuất các tế bào lympho Các tế bào lympho một phần do túi Fabricius tiết ra, một phần di tản

từ tủy xương ñến, ñều ñược tập trung tại ñây ñể huấn luyện, biệt hóa trở thành

tế bào lympho B chịu trách nhiệm ñáp ứng miễn dịch dịch thể hay còn gọi là

tế bào không phụ thuộc tuyến ức

Ở người và ñộng vật có vú, (cá, bò sát…) không có túi fabricius, mọi chức năng của túi fabricius do các cơ quan tương ñương ñảm nhận, ñó là tủy xương và các cơ quan lympho ngoại vi (hạch, lá lách…)

Sau khi trở thành lympho B, các tế bào này ñến các cơ quan như lá lách , hạch … ñể ñón ñợi kháng nguyên, tiếp xúc với kháng nguyên và chúng ñược biệt hóa ñể trở thành tế bào sản xuất kháng thể dịch thể

* Các cơ quan dạng lympho ngoại vi

`*Hạch lâm ba: là một trong những nơi diễn ra ðƯMD chống lại kháng

nguyên khi chúng xâm nhập vào cơ thể

8

*Lá lách: là cơ quan lympho lớn, có ðƯMD ñối với các kháng nguyên vào

ñường máu, vùng tủy trắng của lá lách có chứa các nang lympho và quá trình ðƯMD diễn ra ở ñây

* Các cơ quan khác: Ngoài ra, các hạch hạnh nhân (cơ quan dạng lympho ở

vùng vòm họng, vùng gốc lưỡi), các ñảo nằm phân bố rải rác ở ruột non (mảng payer) hay ở các phế nang, phế quản, ñường sinh dục, tiết niệu cũng ñều có các nang lympho nằm ngay dưới lớp biểu mô có chức năng trong miễn dịch

2.1.3.2 Tế bào miễn dịch

Trong quá trình tạo kháng thể của cơ thể phải kể ñến vai trò của 3 loại tế bào:

* ðại thực bào: bắt nguồn từ tủy xương, vào máu và có khả năng thực bào, chúng có mặt ở các hạch, lá lách, gan, phổi, chúng tham gia vào miễn dịch thực bào, tiêu diệt các tế bào lạ bằng thực bào ðại thực bào có vai trò tiếp nhận, hoạt hóa, chuyển vận thông tin, duy trì kháng nguyên và phối hợp chặt chẽ với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch

* Lympho B: Các tế bào lympho nguồn từ tủy xương di tản ñến túi

fabricius (ở chim) hay lách (của thú) ñược huấn luyện, biệt hóa thành tiền lympho B, sau ñó tiếp tục ñược biệt hóa thành các lympho chưa chín Ở hệ máu ngoại vi, các lympho chưa chín ñược biệt hóa thành các lympho B chín, rồi trở thành tương bào plasma, chính các tương bào này mới là các tế bào trực tiếp sản xuất ra các kháng thể dịch thể (IgM, IgA, IgG, IgD, IgE) (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16] Kháng thể này ñi vào máu, tồn tại trong huyết thanh và dịch của cơ thể Tương bào (plasma) có vai trò chủ yếu trong ðƯMD dịch thể, một tỉ lệ nhỏ tế bào lympho B là những tế bào mang “trí nhớ miễn dịch” Ở người và ñộng vật không có túi fabricius thì tủy xương và các

cơ quan lympho khác như hạch, lá lách…ñảm nhận chức năng của túi Fabricius trong quá trình hình thành tế bào lympho B

9

* Lympho T: các tế bào lympho nguồn từ tủy xương di tản xuống

tuyến ức và ñược tuyến ức huấn luyện, biệt hóa trở thành tiền lympho T, chúng tiếp tục ñược biệt hóa ở vùng vỏ tuyến ức ñể trở thành lympho T chưa chín Các lympho T chưa chín ñược tiếp tục biệt hóa thành lympho T chín ñi vào hệ máu ngoại vi và ñi ñến các cơ quan, tổ chức khác tại các vùng phụ thuộc tuyến ức của hạch, lách Khi ñại thực bào ñưa thông tin kháng nguyên ñến, các lympho T tiếp nhận rồi biệt hóa trở thành nguyên bào lympho T rồi tiếp tục trở thành nhóm tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chứa kháng thể ñặc hiệu trên màng tế bào, gọi ñó là kháng thể tế bào Quá trình ðƯMD tế bào do quần thể lympho T phụ trách, thể hiện khả năng tự bảo vệ của cơ thể

Ví dụ: các bệnh nhiễm trùng gây bởi các vi sinh vật kí sinh trong nội bào (do virus, vi khuẩn, nấm, ñộng vật ñơn bào), các mầm bệnh này chỉ có thể bị tiêu diệt hoàn toàn khi có ðƯMD tế bào (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]

Kháng thể tế bào thường tồn tại trong các tổ chức mô và các cơ quan cơ thể

2.1.4 Kháng nguyên (Antigen)

Kháng nguyên là vật lạ khi xâm nhập vào cơ thể gây ra ðƯMD ñặc hiệu Không phải tất cả các vật lạ khi xâm nhập vào cơ thể ñều là kháng nguyên, chúng phải có kích cỡ ít nhất bằng kích cỡ của một epitope (nhóm quyết ñịnh kháng nguyên) mới có thể gây ra ðƯMD

Ví dụ: Nếu kháng nguyên là chuỗi polypeptit thì trọng lượng phân tử phải lớn hơn 1000 Dalton mới kích thích cơ thể sinh ra kháng thể

Tính ñặc hiệu kháng nguyên – kháng thể :

Có thể tạm ñịnh nghĩa kháng nguyên là những chất có ñặc tính sau:

- Tính miễn dịch: là khả năng kích thích cơ thể có một ñáp ứng miễn dịch

- Tính ñặc hiệu: là khả năng kết hợp ñặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng

thể ñặc hiệu tương ứng Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, kháng nguyên

có khả năng kết hợp ñặc hiệu với các thụ thể trên bề mặt lympho T mẫn cảm Tính chất này không phải do toàn bộ cấu trúc của các phân tử kháng nguyên

10

quyết ñịnh mà là các “nhóm quyết ñịnh kháng nguyên” (epitope) nằm trên bề mặt phân tử kháng nguyên

-Tính ña trị kháng nguyên: khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể các

tế bào trình diện bắt giữ và biến chúng thành các epitope khác nhau, vì thế mà kích thích cơ thể sinh ra nhiều kháng thể tương ứng ðiều này giải thích tại sao khi tiêm chủng vacxin vi khuẩn nhược ñộc A sẽ thu ñược huyết thanh chứa nhiều loại kháng thể chống lại A, ñược gọi là một họ kháng thể A (Vũ Triệu An và cộng sự, 1998) [02]

Căn cứ vào ñặc tính và ñiều kiện kháng nguyên mà chia kháng nguyên thành hai loại: kháng nguyên hoàn toàn (antigen) và kháng nguyên không hoàn toàn (hapten)

Kháng nguyên hoàn toàn có ñầy ñủ hai khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể và sự kết hợp ñặc hiệu với kháng thể do chính kháng nguyên kích thích sinh ra Hầu hết các kháng nguyên hoàn toàn có bản chất protein như các cấu phần của cơ thể ñộng vật, thực vật, vi sinh vật, nọc ñộc ñộng vật…

Kháng nguyên không hoàn toàn (hapten) còn gọi là bán kháng nguyên,

là những chất có trọng lượng phân tử thấp không có tính kích thích sinh miễn dịch nhưng có tính ñặc hiệu của kháng nguyên là khả năng kết hợp ñặc hiệu với kháng thể tương ứng (Lê Văn Hùng, 2002) [08] Hay nói cách khác là tự bản thân không có khả năng kích thích cơ thể sinh kháng thể ðể trở thành kháng nguyên hoàn toàn, kháng nguyên không hoàn toàn phải gắn với một chất mang (carrier), tạo thành phức hợp hapten- carrier và cơ thể phản ứng với phức hợp này sinh ra kháng thể

Carrier là những chất có trọng lượng phân tử lớn như BSA…dùng ñể kết hợp với hapten tạo ra kháng nguyên hoàn toàn

* ðiều kiện ñể kháng nguyên có tính miễn dịch:

- Kháng nguyên phải có kích thước phân tử lớn (Ngưỡng tối thiểu của

trọng lượng phân tử là 1000 Da) Tuy nhiên có chất có trọng lượng phân tử

11

nhỏ nhưng chúng tìm cách gắn với protein khác ñể trở thành kháng nguyên hoàn chỉnh; ngược lại một số chất có trọng lượng phân tử lớn như Dextran tới 200.000 Da nhưng không có tính sinh miễn dịch hoặc có nhưng rất yếu

- Kháng nguyên phải có ít nhất một epitope khác loài vì hệ thống miễn dịch không phản ứng với epitope cùng loài

Khái niệm epitope: là những cấu trúc trên bề mặt tác nhân gây bệnh, có khả năng tác dụng tương hỗ riêng biệt với những thụ thể ñặc hiệu trên bề mặt của một số tế bào lympho Như vậy toàn bộ cấu trúc (tác nhân gây bệnh, những hạt phân tử) mà trên ñó những epitope hiện diện ñược gọi là kháng nguyên

2.1.5 Kháng thể và phản ứng kháng nguyên- kháng thể

2.1.5.1 Kháng thể (Antibody)

a- ðịnh nghĩa: Kháng thể là các immunoglobulin (có bản chất glycoprotein) do các tế bào lympho B cũng như tương bào (biệt hoá từ lympho B) tiết ra ñể hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ như: vi khuẩn hoặc vi rút Mỗi kháng thể có thể nhận biết một hay một số epitope tương ñồng

Hình 1 Cấu trúc ñiển hình của kháng thể Hình 2 Bề mặt của kháng thể IgG

12

Hình 3 Sơ ñồ các chuỗi của một kháng thể

b- Cấu tạo của kháng thể

Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm hai chuỗi nặng

(H, heavy, màu tím trong hình 3) giống hệt nhau và hai chuỗi nhẹ (L, light,

màu xanh lá trong hình 3) cũng giống hệt nhau Có hai loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda), do ñó hai chuỗi nhẹ của mỗi phân tử immunoglobulin chỉ có thể cùng là κ hoặc cùng là λ Các chuỗi của immunoglobulin liên kết với nhau bởi các cầu nối disulfide và có ñộ ñàn hồi nhất ñịnh (hình 1 và 2) Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố ñịnh nhưng phần ñầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất biến thiên giữa các kháng thể khác nhau, ñể tạo nên các vị trí kết hợp có khả năng phản ứng ñặc hiệu với các kháng nguyên tương ứng, ñiều này tương tự như một enzyme tiếp xúc với cơ chất của nó Có thể tạm so sánh

sự ñặc hiệu của phản ứng kháng thể - kháng nguyên như ổ khóa và chìa khóa

Các domain hằng ñịnh (C, constant,) ñặc trưng bởi các chuỗi amino

acide khá giống nhau giữa các kháng thể Domain hằng ñịnh của chuỗi nhẹ ký hiệu là CL Các chuỗi nặng chứa 3 hoặc 4 domain hằng ñịnh, tùy theo lớp kháng thể CH1, CH2, CH3 và CH4

Các domain hằng ñịnh không có vai trò nhận diện kháng nguyên, chúng làm nhiệm vụ cầu nối với các tế bào miễn dịch cũng như các bổ thể Do ñó,

13

phần "chân" của chữ Y còn ñược gọi là Fc (tức là phần hoạt ñộng sinh học

của kháng thể F: fragment, c: cristallisable)

Các domain biến thiên mỗi immunoglobulin có 4 domain biến thiên (V,

variable) ở ñầu tận hai "cánh tay" của chữ Y Sự kết hợp giữa 1 domain biến thiên trên chuỗi nặng (VH) và 1 domain biến thiên trên chuỗi nhẹ (VL) tạo nên

vị trí nhận diện kháng nguyên (còn gọi là paratope) Như vậy, mỗi immunoglobulin có hai vị trí gắn kháng nguyên Hai vị trí này giống nhau như ñúc, qua ñó một kháng thể có thể gắn ñược với 2 kháng nguyên giống nhau Hai "cánh tay" của chữ Y còn gọi là Fab (tức là phần nhận gắn kháng

nguyên, F: fragment, ab: antigen binding) Domain kháng nguyên nơi gắn vào

kháng thể gọi là epitope

Các domain sở dĩ gọi là biến thiên vì chúng khác nhau rất nhiều giữa các kháng thể Chính sự biến thiên ña dạng này giúp cho hệ thống các kháng thể nhận biết ñược nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nhau

Trong miễn dịch dịch thể, cơ thể sau khi chịu sự kích thích của tác nhân gây bệnh, các tế bào lympho B ñược biệt hóa sản xuất kháng thể dịch thể ñặc hiệu, ñây là chất dịch sinh học hòa tan trong huyết thanh và trong dịch của cơ thể

Kháng thể dịch thể có tính ñặc hiệu với kháng nguyên mức ñộ ñặc hiệu của kháng nguyên phụ thuộc vào tính riêng biệt của epitope mà nó phân biệt

Trong huyết thanh có nhiều thành phần, ñó là α, β,F γ globulin và albumin,

trong ñó chủ yếu là γ globulin, vì vậy người ta thường gọi kháng thể là globulin miễn dịch hay imunoglobulin, kí hiệu là Ig Hiện nay, người ta ñã biết có 5 loại kháng thể dịch thể ñặc hiệu là IgG, IgM, IgA, IgD, IgE Chúng có cấu trúc gần giống nhau gồm chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, cấu trúc chuỗi nhẹ của các loại kháng thể này nói chung là như nhau, chúng chỉ khác nhau ở cấu trúc chuỗi nặng Cả hai chuỗi ñều có vùng ổn ñịnh (constant region) và vùng dễ biến ñổi (variable

Liên kết với kháng nguyên

Hình 4 Các ñộc tố của vi khuẩn bên cạnh một tế bào cơ thể

Các immunoglobulin có khả năng nhận diện và gắn một cách ñặc hiệu với 1 kháng nguyên tương ứng nhờ các domain biến thiên Một thí dụ ñể miêu

tả lợi ích của kháng thể là trong phản ứng chống ñộc tố vi khuẩn Kháng thể gắn với ñộc tố và qua ñó trung hòa ñộc tố, ngăn ngừa sự bám dính của các ñộc tố trên lên các thụ thể tế bào Như vậy, các tế bào cơ thể tránh ñược các rối loạn do các ñộc tố ñó gây ra (hình 4 và 5)

Tương tự như vậy, nhiều virus và vi khuẩn chỉ gây bệnh khi bám ñược vào các tế bào cơ thể Vi khuẩn sử dụng các phân tử bám dính là adhesine, còn virus sở hữu các protein cố ñịnh trên lớp vỏ ngoài Các kháng thể kháng-adhesine và kháng-proteine capside virus sẽ ngăn chặn các vi sinh vật này gắn vào các tế bào ñích của chúng

15

(2) tạo ñiều kiện cho hiện tượng thực bào, (3) thanh lọc các phức hợp miễn

dịch và (4) phóng thích các phân tử hóa hướng ñộng

Hình 5 Các ñộc tố trên bị trung hoà bởi kháng thể

Hoạt hóa các tế bào miễn dịch

Sau khi gắn vào kháng nguyên ở ñầu biến thiên (Fab), kháng thể có thể liên kết với các tế bào miễn dịch ở ñầu hằng ñịnh (Fc) Những tương tác này

có tầm quan trọng ñặc biệt trong ñáp ứng miễn dịch Như vậy, các kháng thể gắn với một vi khuẩn có thể liên kết với một ñại thực bào và khởi ñộng hiện

tượng thực bào Các tế bào lympho NK (Natural Killer) có thể thực hiện chức

năng ñộc tế bào và ly giải các vi khuẩn bị opsonine hóa bởi các kháng thể (http://vi.wikipedia.org/wiki/khangthe) [40]

Quy luật hình thành kháng thể ñặc hiệu

Kháng thể không sản sinh ra ngay sau khi kháng nguyên xâm nhập vào

cơ thể mà kháng thể chỉ xuất hiện sau 6 – 7 ngày, rồi sau ñó tăng dần, ñạt mức

ñộ tối ña sau từ 2 ñến 3 tuần, sau ñó từ từ giảm dần và biến mất sau vài tuần, vài tháng hoặc vài năm

Sau khi có kháng nguyên kích thích, các tế bào có thẩm quyền miễn dịch tiếp nhận kháng nguyên và phải mất một thời gian biệt hóa, phân chia

16

thành tế bào sản xuất kháng thể, lúc ñó mới có kháng thể xuất hiện, sớm nhất

là IgM nối tiếp là IgG

Nếu ñưa kháng nguyên thêm một lần nữa vào cơ thể có tính chất nhắc nhở, thì thời gian xuất hiện kháng thể sẽ sớm hơn và kháng thể sinh ra cũng nhiều hơn, bởi vì khi bị kháng nguyên lần ñầu kích thích một số tế bào có thẩm quyền miễn dịch ñã biệt hóa trở thành tế bào tiếp nhận thông tin kháng nguyên, cất giữ lại trở thành tế bào nhớ Khi KN vào lần sau và tiếp xúc ñược với các tế bào này, chúng chỉ việc “nhớ lại” ñể sản xuất kháng thể ðây là cơ

sở của hiện tượng trí nhớ miễn dịch (Nguyễn Như Thanh, 1997) [16]

Sự hình thành và tồn tại của kháng thể chịu ảnh hưởng của nhiều yếu

tố, ñặc biệt là ñặc tính, bản chất của kháng nguyên kích thích, khả năng ñáp ứng miễn dịch của cơ thể và ñiều kiện ngoại cảnh cơ thể ñó tồn tại

Những phản ứng kháng nguyên – kháng thể quan sát được thì ứng dụng rộng rãi trong chẩn đốn thú y học, sinh học …

Những phản ứng kháng nguyên – kháng thể khơng nhìn thấy được thì phải dùng các kĩ thuật đánh dấu để phát hiện:

+ Dùng enzyme gắn với kháng thể rồi cho kết hợp với kháng nguyên, sau đĩ dùng cơ chất hiện màu thích hợp để phát hiện và đánh giá bằng đo màu

sử dụng quang phổ kế hoặc quang kế (máy đo mật độ quang học…) Phương pháp này gọi là phương pháp miễn dịch đánh dấu enzyme (phản ứng ELISA)

+ Dùng thuốc nhuộm huỳnh quang để nhuộm kháng thể cho kết hợp với kháng nguyên (trực tiếp hoặc gián tiếp) và phát hiện phức hợp kháng nguyên- kháng thể bằng kính hiển vi huỳnh quang Phương pháp này được gọi phương pháp miễn dịch huỳnh quang

+ Dùng các đồng vị phĩng xạ để đánh dấu kháng thể kháng nguyên rồi cho kết hợp kháng nguyên kháng thể và đo mức phĩng xạ Phương pháp này được gọi là phương pháp miễn dịch phĩng xạ (RIA: Radio Immuno Assay)

Nhưng khi nĩi đến nền tảng của kỹ thuật này, chúng ta phải kể đến các cơng trình của Nossal và Lederberg (1958) về thuyết chọn lọc đơn dịng ( một tế bào - một kháng thể), của Okada dùng virut Sendai để lai các tế bào (1958) và Barski (1960) vì sự liên hợp ngẫu nhiên của các tế bào Nhưng tất cả các cơng trình nghiên cứu trên đều khơng thu được kháng thể đơn dịng cĩ đặc tính mong muốn Năm 1975 Kohler và Milstein cho là cĩ thể thu được kháng thể đơn dịng cĩ tính đặc hiệu cao từ các dịng tế bào thường trực bằng cách lai tế bào u tuỷ với tế bào sản xuất kháng thể Thí nghiệm này đã dùng tế bào lách của chuột đã được miễn dịch với hồng cầu cừu và lai với tế bào u tuỷ của chuột dịng P3- X63- Ag8 và dùng virut Sendai là chất tạo liên hợp Tế bào lai thu được cĩ khả năng sản xuất kháng thể chống hồng cầu cừu và cĩ thể nuơi

cấy dài ngày in vitro

Trong hơn 30 năm qua, kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dịng đã cĩ thể ảnh hưởng nhiều tới các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau của miễn dịch học, vi sinh vật y học, ký sinh trùng, sinh hố, sinh lý, và sinh học tế bào Cho đến nay, người ta đã thu được nhiều kháng thể đơn dịng từ nhiều phương pháp sản xuất khác nhau, tuy nhiên về nguyên lý cơ bản các phương pháp này khơng khác nhau nhiều (Nguyễn ðỗ Quyên, 2004) [13]

Việc ứng dụng kháng thể đơn dịng trong thử nghiệm miễn dịch ngày càng nhiều và giúp cho chẩn đốn miễn dịch cũng như chẩn đốn lâm sàng cĩ bước tiến bộ đáng kể Nĩ đã trở thành một phương pháp duy nhất giúp chúng

ta cĩ thể thu được một lượng lớn khơng hạn định kháng thể mong muốn với tính đặc hiệu cao

19

Có thể hiểu kháng thể ñơn dòng như sau: Khi một kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể sẽ ñược ñại thực bào tiếp nhận phân chia thành các quyết ñịnh kháng nguyên (epitope) Một kháng nguyên có thể có một hay nhiều epitope Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch (tế bào lympho B và lympho T) khác nhau lại phản ứng khác nhau với cùng một loại epitope và cho ra các loại kháng thể khác nhau Cũng vì vậy, một loại kháng nguyên xâm nhập cơ thể, ñáp ứng miễn dịch của cơ thể sẽ sản xuất ra nhiều loại kháng thể khác nhau, ñược gọi là kháng thể ña dòng hay một họ kháng thể Một tế bào miễn dịch (lympho B) chỉ ñáp ứng (mẫn cảm) một quyết ñịnh kháng nguyên (epitope) và sản xuất ra một loại kháng thể

Hình 6 Kháng thể ñơn dòng liên kết với một epitope ñặc hiệu

Các kháng thể ñơn dòng chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn (hình 6) Theo ñịnh nghĩa, tất cả các kháng thể ñơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và ñược sản xuất bởi cùng một dòng tương bào…

2.1.6.1 Nguyên lý và quy trình sản xuất KTðD

Nguyên lý: Cơ sở của kỹ thuật sản xuất kháng thể ñơn dòng là làm sao thu ñược tế bào dưới dạng thể lai giữa tế bào lỵmpho B và tế bào u tuỷ Các tế bào này vừa mang các ñặc tính của tế bào lympho (có khả năng hình thành kháng thể) và vừa mang ñặc tính của tế bào u tuỷ (có khả năng phát triển khi

nuôi cấy dài ngày in vitro)

u tuỷ HPRT¯ bị chết Trong khi ñó các tế bào lympho ñã mẫn cảm kháng nguyên có trong lách của ñộng vật ñã ñược gây miễn dịch (chuột nhắt trắng, chuột cống vv) tuy có khả năng tiết ra kháng thể nhưng lại không có khả năng

nhân lên khi nuôi cấy dài ngày in vitro Tuy vậy tế bào lách khi nuôi cấy trong

môi trường HAT chúng có khả năng tận dụng hypoxanthin ñể tổng hợp ADN

vì chúng có men HPRT+

Khi trộn các tế bào u tuỷ HPRT - không sản xuất kháng thể với tế bào lách ñộng vật ñã ñược gây miễn dịch, dưới tác dụng của polyethylen glycol (PEG) thì chúng có khả năng dung hợp với nhau thành các dạng:

- Tế bào u tuỷ với tế bào u tuỷ

- Tế bào u tuỷ với tế bào lympho

- Tế bào lympho với tế bào lympho

Sau ñó chúng ñược nuôi cấy trong môi trường chon lọc HAT Trong môi trường này chỉ có cặp tế bào lai: tế bào u tuỷ với tế bào lympho mới có khả năng phát triển, còn các loại liên hợp khác như lympho với lympho hoặc

tế bào u tuỷ với tế bào u tuỷ ñều chết ở những ngày ñầu nuôi cấy (Nguyễn ðỗ Quyên 2004) [13]

21

Tiêm chủng

Sơ ñồ 1 Quy trình sản xuất kháng thể ñơn dòng

Dung hợp tế bào in vitro

Quần thể tế bào lai BM

Một tế bào lai BM sinh khỏng

thể khỏng KNA

Dũng tế bào lai BM

Khỏng thể ñơn dũng khỏng KNA

Dịch nổi, tỏch chiết

Nhõn lờn

Nuụi in vitro Nuụi in vitro Chọn lọc (cloning)

22

Năm 1975 Kohler và Milstein ñã ñưa ra kỹ thuật sản xuất kháng thể ñơn dòng bao gồm các bước sau:

* Bước 1: Gây miễn dịch (tạo ra các tế bào lympho sinh kháng thể)

* Bước 2: Dung hợp các tế bào Lympho ñã ñược gây mẫn cảm với tế bào u

tuỷ Myeloma (HPRT-) ñể tạo tế bào lai

* Bước 3: Nuôi cấy và phát triển các tế bào lai trong môi trường chọn lọc và

phát triển các dòng tế bào lai sản sinh ra kháng thể mong muốn

* Bước 4: Sản xuất kháng thể ñơn dòng in vitro và in vivo

Nguyên lý của các bước ñược thực hiện như sau:

Bước 1: Gây miễn dịch

Muốn sản xuất thành công kháng thể ñơn dòng trước hết ñòi hỏi ñộng vật phải ñược gây miễn dịch tốt với kháng nguyên mong muốn Số lượng lympho B có khả năng hình thành kháng thể tăng lên sau khi gây miễn dịch là một trong các biểu hiện thành công trong quá trình sản xuất thành công kháng thể ñơn dòng

Gây miễn dịch in vivo: quá trình gây miễn dịch ñược thực hiện ở ñộng

vật ñã chọn thường là chuột nhắt trắng, chuột cống thuần chủng Nhiều sơ ñồ gây miễn dịch cho nhiều loại kháng nguyên khác nhau: ðối với kháng nguyên hoà tan, sơ ñồ ñơn giản nhất là tiêm 0,05- 0,1mg kháng nguyên với tá chất Freund hoàn chỉnh Mũi thứ hai thường ñược thực hiện sau 2 tuần với cùng lượng kháng nguyên ðộng vật ñược lấy máu ở tuần thứ tư ñể ñịnh lượng kháng thể nếu con vật nào có hàm lượng kháng thể cao sẽ ñược tiêm nhắc lại vào tĩnh mạch với ½ lượng kháng nguyên Nếu các con vật có lượng kháng thể chưa cao, người ta có thể tiêm nhắc lại một lần nữa Tế bào lách (Lympho

B mẫn cảm) ñược thu sau 3 ngày kể từ lần tiêm vào tĩnh mạch

Gây miễn dịch in vitro: ñây là phương pháp gây miễn dịch thích hợp

cho quá trình sản xuất kháng thể ñơn dòng có nguồn gốc từ người hoặc những chất có tính kháng nguyên yếu Tế bào lành ñược nuôi cấy rồi gây miễn dịch

23

in vitro Phương pháp này chỉ cần một lượng nhỏ kháng nguyên, thời gian gây miễn dịch ngắn

* Xét về dòng tế bào ung thư tuỷ:

Có ba ñiều kiện chủ yếu ñể chọn dòng tế bào ung thư tuỷ ñể lai với tế bào lympho ñã ñược gây miễn dịch Trước tiên tế bào ung thư tuỷ phải có dấu

ấn ñể kháng aminopterin, nhằm loại trừ những tế bào u tuỷ không dung hợp trong môi trường chọn lọc Thứ hai, tế bào u tuỷ phải không sản xuất chuỗi nặng và chuỗi nhẹ và cuối cùng là tế bào u tuỷ phải khoẻ mạnh và ổn ñịnh

Bước 2: Dung hợp các tế bào Lympho ñã ñược gây mẫn cảm với tế bào u tuỷ (HPRT - )

ðể thu ñược các tế bào lai (hybridoma), tế bào lympho và tế bào u tuỷ ñược trộn với nhau theo tỷ lệ thích hợp Những thí nghiệm ñầu tiên thường dùng vi rút Sendai ñể tạo sự kết hợp giữa các tế bào Sau này người ta dùng các chất hoá học như polyethylen glycol (PEG) ñể lai các tế bào So với vi rút Sendai, PEG làm tăng ñáng kể số lượng các tế bào lai, PEG có khả năng tạo nhiều ñiểm ngưng kết hơn trên bề mặt tế bào Lympho B Nồng ñộ thích hợp của PEG khoảng 50% Với nuôi cấy tế bào một lớp PEG có trọng lượng phân

tử 1000 Da là tốt nhất, còn các tế bào nuôi trong hỗn dịch, trọng lượng phân

tử là 4000 Da của PEG có hiệu quả tốt hơn

Sharon (1980) cho rằng: tần số tạo các tế bào lai phụ thuộc nhiều vào

pH của dung dịch PEG Số lượng tế bào lai nhận ñược nhiều nhất khi dung dịch PEG có pH từ 8,2 -8,4

PEG có tác dụng làm thay ñổi cấu trúc màng tế bào, tạo ñiều kiện cho 2

tế bào dễ dính và kết hợp với nhau Thời gian cho các tế bào tiếp xúc với PEG phải vừa ñủ (khoảng 1 ñến 2 phút) ñể các tế bào ngưng tụ lại với nhau, nhưng không gây tổn thương tế bào Neuraminidaza cũng ñã ñược dùng ñể xử lý tế bào trước khi cho dung hợp, có tác dụng làm tăng hiệu suất dung hợp Theo

24

Norwood thì dimethyl sulfoxide có tác dụng tạo thuận lợi cho sự liên hợp dưới tác dụng của PEG

Bước 3: Nuôi cấy và phát triển các tế bào lai trong môi trường chọn lọc

Có 3 môi trường cơ bản thường ñược dùng trong quá trình sản xuất kháng thể ñơn dòng: môi trường RPMI 1640, môi trường Dulbeccos và môi trường Iscoves Những chi tiết về việc nuôi cấy tế bào lai ñã ñược viết trong nhiều tài liệu Nói chung là sau khi dung hợp, hỗn dịch tế bào ñược nuôi trong môi trường chọn lọc (HAT) Trong môi trường này có aminosterin ức chế quá trình tổng hợp ADN Tất cả các tế bào u tuỷ và các tế bào lách không dung hợp sẽ chết trong vài ngày sau ñó Chỉ có các tế bào lai với hai ñặc trưng cần thiết cho sự phát triển trong môi trường chọn lọc sẽ sống và nhân lên Quá trình chọn lọc hoàn tất trong 5-7 ngày sau khi dung hợp, có thể thấy rõ những

tế bào lai trên nền các tế bào chết Nuôi cấy cần ñược bổ sung thêm môi trường khi nó chuyển sang mầu vàng Việc này thường ñược thực hiện bằng cách hút bỏ 20 - 50% môi trường cũ và thay bằng môi trường mới không có aminopterin (môi trường HT) Sau ñó một vài ngày tế bào lai ñược nuôi cấy bằng môi trường bình thường

Trong những ngày ñầu phát triển của tế bào lai cần có một số chất hỗ trợ, thường ñược dùng nhiều nhất là huyết thanh bào thai bê (FCS) và tế bào cuống rốn của người (HUCS) FCS thường ñược dùng nhiều nhất trong nuôi cấy tế bào ðối với các tế bào lai, các tác giả thường bổ sung 10 -20% FCS trong môi trường nuôi cấy Nồng ñộ FCS có thể cho các hoạt tính hỗ trợ sinh trưởng khác nhau, cho nên cần phải thử nghiệm khả năng hỗ trợ phát triển của mỗi loại FCS

Một số nhà nghiên cứu ưa dùng lớp tế bào nuôi cấy trong nuôi cấy các

tế bào lai Chúng là các tế bào của dịch phúc mạc, các tế bào lách, tế bào tuyến ức Các tế bào này thường ñược nuôi cấy một vài ngày trước khi dung hợp tế bào

25

Bước 4: Chọn lọc và tạo dòng các tế bào sản xuất kháng thể

Mục ñích của việc kiểm tra và sớm ñịnh loại ñược các tế bào lai sản xuất kháng thể mong muốn ñể ñỡ tốn công sức và nguyên liệu duy trì và phát triển các tế bào không cần thiết Phương pháp kiểm tra sự sản xuất kháng thể của tế bào cần ñược ñịnh rõ trước khi lai các tế bào Có rất nhiều thử nghiệm

ñể phát hiện kháng thể trong môi trường nuôi cấy các tế bào lai Tuy nhiên khi chọn thử nghiệm nào người ta thường quan tâm ñến hai ñiều kiện sau: trước tiên là bản chất của kháng nguyên dùng phát hiện kháng thể và ñiều kiện thứ hai là ñiều kiện thuận lợi của thử nghiệm (nó cần cho kết quả nhanh

và có thể thực hiện hằng ngày) Vì các tế bào lai thường phát triển với các tốc

ñộ khác nhau cho nên ELISA là một trong các kỹ thuật ñược dùng nhiều ñể phát hiện kháng thể trong kỹ thuật sản xuất kháng thể ñơn dòng, vì nó dễ thực hiện, có ñộ nhạy cao và có thể kiểm tra một lượng mẫu lớn trong cùng một lúc Phương pháp này cũng có thể cho biết trực tiếp lớp, phân lớp của kháng thể ñược phát hiện bằng cách dùng các kháng huyết thanh ñặc hiệu

Kiểm tra các tế bào lai ñược tiến hành khi các quần thể tế bào lai mọc

rõ và môi trường nuôi cấy ngả màu vàng Các quần thể tế bào dương tính phải ñược tách dòng ñể sản xuất ra một loại kháng thể ñặc hiệu Hơn nữa, việc tách dòng nhanh còn giúp cho việc tách biệt các tế bào lai dương tính ra khỏi sự phát triển quá mạnh của các tế bào lai không sản suất kháng thể Trước ñây việc tách dòng tế bào lai thường ñược thực hiện trong lớp thạch mềm, gần ñây phương pháp pha loãng tới hạn thường ñược dùng nhiều hơn Phương pháp này thực hiện dễ dàng bằng cách: pha loãng và phân phối với các nuôi cấy tế bào sao cho có 1 tế bào trong một giếng nuôi cấy

* Phát hiện tính ñặc hiệu của kháng thể ñơn dòng

Những ñòi hỏi về ñặc tính của kháng thể ñơn dòng phụ thuộc vào mục ñích ngiên cứu ðặc tính quan trọng nhất của kháng thể ñơn dòng là tính ñặc hiệu của chúng ðiều này có thể ñược thực hiện bằng cách cho kháng thể liên

26

kết với các kháng nguyên khác nhau đánh giá bằng kỹ thuật ELISA hoặc kỹ thuật thấm miễn dịch với kháng nguyên là các protein hoặc các kháng nguyên hoà tan Một số ựặc tắnh quan trọng khác của kháng thể ựơn dòng cần ựược xác ựịnh như khả năng gây kết tủa, ngưng kếtẦ, lớp và phân lớp Ig, ựiều này

có liên quan chặt chẽ với mục ựắch sử dụng kháng thể

* Nhân nuôi tế bào lai sản xuất kháng thể ựơn dòng in vitro

Sản xuất kháng thể ựơn dòng trong môi trường nuôi cấy thường dễ hơn

và kháng thể sản xuất ra thường tinh khiết Tuy nhiên phương pháp này chỉ nhận ựược một hàm lượng nhỏ kháng thể 10 - 100ộg/ml Môi trường nuôi cấy phải dùng hệ thống hút liên tục ựể hút 80 - 90% môi trường nuôi cấy khi ngả vàng hoặc phải dùng một lượng lớn chai nuôi cấy tế bào và gặt khi tế bào chết Ngoài ra FCS trong môi trường nuôi cấy là nguồn nhiễm các immunoglobulin không ựặc hiệu để khắc phục ựược nhược ựiểm này ựã có một phương pháp loại trừ kháng thể không ựặc hiệu trong FCS trước khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy Thêm vào ựó, nhiều môi trường không có huyết thanh dùng cho kỹ thuật lai tế bào ựã ựược sử dụng

* Tinh chế kháng thể ựơn dòng

Mặc dù kháng thể ựơn dòng có thể dùng không cần tinh chế, nhưng quá trình tinh chế vẫn cần ựược thực hiện phụ thuộc vào mục ựắch sử dụng điều quan trọng là phải biết lớp hoặc phân lớp kháng thể vì không phải tất cả các lớp kháng thể ựều gắn với protein A IgG2a và IgG2b và IgG3 của chuột gắn tốt với protein A, nhưng IgG1, IgA và IgM không gắn Kỹ thuật này ưu ựiểm hơn phương pháp ái lực trên cột sepharose- protein A ở chỗ tất cả các phân lớp kháng thể có nguồn gốc từ chuột có thể thu ựược

* Tắnh ổn ựịnh của tế bào lai và kháng thể ựơn dòng

Một trong những vấn ựề cần ựược nghiên cứu trong quá trình sản xuất kháng thể ựơn dòng là tắnh không ổn ựịnh của tế bào lai Trong qúa trình liên hợp tế bào lai, tế bào lai ựược hình thành một cách ngẫu nhiên giữa các tế bào

27

ở các giai đoạn phân bào khác nhau Cĩ thể tế bào ở giai đoạn phân kỳ (interphase) là các giai đoạn duy nhất thích hợp cho sự liên hợp các tế bào và cho tế bào lai với đặc tính ổn định Sự tập trung quá sớm các nhiễm sắc thể thường sảy ra trong quá trình liên hợp và sau đĩ là một trong các quá trình gây nên sự mất nhiễm sắc thể trong các tế bào lai ðiều này thường thấy ở các

tế bào lai cĩ nguồn gốc từ người Mất nhiễm sắc thể ở các tế bào lai ở chuột thường ít sảy ra

Sự thay đổi các điều kiện vật lý như trong quá trình tinh chế, bảo quản cũng cĩ thể thay đổi hoạt tính của kháng thể đơn dịng Ngồi ra sự nhiễm các

vi sinh vật khác cũng cĩ thể gây thối hố các kháng thể đơn dịng do hoạt tính của các men proteasa của vi sinh vật nhiễm.(Nguyễn ðỗ Quyên, 2004) [13]

2.1.6.2 Ứng dụng của KTðD

Hiện nay, ứng dụng của KTðD rất đa dạng do chúng cĩ nhiều ưu điểm (phương pháp sản xuất cơng nghiệp, kháng thể tinh khiết và cĩ tính đặc hiệu cao) như:

+ Xác định mức hormon trong máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đốn các bệnh liên quan đến tuyến nội tiết như định lượng các nội tiết tố như LH, FSH, progesteron, estrogen…

+ Xác định các type vi khuẩn, virut, nấm gây bệnh, gây dịch cho người, động vật và thực vật

+ Phát hiện các thuốc bị cấm (doping, ma túy), các chất độc đối với cơ thể trong lương thực, thực phẩm

+ Ức chế phản ứng loại thải mảnh ghép: sau khi ghép mơ, cơ quan, người ta cần uống thuốc chống đào thải và kèm theo đĩ là ức chế hệ miễn dịch, làm cho hệ thống phịng ngự của cơ thể yếu đi, dễ gây nhiễm kế phát Với kháng thể đơn dịng, khi vào cơ thể chúng chỉ ức chế các yếu tố gây hiện tượng đào thải mảnh ghép mà khơng ức chế hệ thống miễn dịch của cơ thể vì

28

vậy mà hệ thống miễn dịch của cơ thể không bị suy giảm Ngoài ra, KTðD hiệu quả hơn các loại dược phẩm thông thường trong việc ñiều trị bệnh do các dược phẩm tấn công không chỉ với mầm bệnh mà với cả các tế bào trong cơ thể Do ñó, dược phẩm thông thường hay gây phản ứng phụ như buồn nôn, dị ứng còn KTðD chỉ tấn công vào phần tử mục tiêu và không gây nên phản ứng phụ hay phản ứng phụ không ñáng kể (htpp://www.accessexcellence.org/RC/AB/MonoclonalAntibody.html) [39] + Hiện nay, người ta ñưa ra liệu pháp KTðD ñể nâng cao hiệu quả hệ thống miễn dịch của người bệnh Có hai loại KTðD:

- KTðD có gắn thuốc hoặc chất phóng xạ: KTDD ñược dùng như phương tiện chuyên chở mang các loại thuốc chống ung thư hoặc chất phóng

xạ ñi thẳng ñến tế bào ung thư hoặc tế bào ñích nào ñó mà không làm tổn thương ñến các tế bào bình thường khác

- KTðD trơn: Hiện nay có hai loại KTDD ñã ñược FDA (Mỹ) cho dùng là Rituxan (rituximab) và herceptin (trastuzumab) Rituxan ñược dùng

ñể ñiều trị một loại ung thư lympho, herceptin ñiều trị ung thư vú giai ñoạn nặng (Nguồn: Access Excellence @ the Natinonal Health Museum) [39]

2.2 Hiểu biết về hormon sinh dục- Progesteron

2.2.1 Tầm quan trọng của hormon sinh dục ñối với sinh sản của gia súc

Hormon (nội tiết tố) do tuyến nội tiết sinh ra ñược ñi thẳng vào máu ñi khắp cơ thể Có thể hiểu hormon là những chất truyền thông tin hóa học ñi theo ñường máu từ cơ quan sản sinh ñến cơ quan tiếp nhận, phát huy tác dụng sinh học cao (Nguyễn Xuân Tịnh và cộng sự, 1996) [14]

Hormon có tác dụng ñiều hòa quá trình sinh lí quan trọng như sinh trưởng, phát dục, sinh sản…ðặc biệt các hormon sinh dục do tuyến sinh dục sản xuất ra tham gia vào quá trình ñiều tiết ñảm bảo chức năng sinh sản

29

Chúng ñiều tiết tính kế tiếp và diễn biến của các phản ứng sinh hóa học mà sự thành thục của nang trứng, sự phát triển của trứng, tinh trùng, sự thụ tinh, sự phát triển của thai…phụ thuộc vào các phản ứng sinh hóa học ñó

2.2.2 Bản chất của hormon steroid, cơ chế tác dụng

Bản chất

Hormon steroid là những hormon hòa tan trong dung môi hữu cơ (dầu, mỡ) các hormon này lưu thông trong máu dưới dạng kết hợp với một protein vận chuyển ñặc hiệu, chỉ có một lượng nhỏ ở trạng thái tự do Chỉ có hormon

ở trạng thái tự do mới có hoạt tính sinh học

Cơ chế tác dụng của hormon steroid

Về bản chất là quá trình truyền thông tin hóa học từ ngoài tế bào vào trong tế bào ñích Tế bào ñích mang thể nhận (recepter - bản chất là protein) ñặc hiệu cho từng loại hormon Hormon ñến tế bào ñích và gắn vào các thể nhận tạo thành phức hợp hormon - thể nhận, từ ñó tạo ra một loạt phản ứng nhằm truyền thông tin từ bề mặt tế bào ñích vào trong nhân tế bào Tuy nhiên,

cơ chế tác dụng của từng loại hormon là khác nhau, phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng

Cơ chế tác dụng của hormon steroid (progesteron, estradiol, testosterone) là cơ chế hormon - gen

2.2.3 Progesteron

a- Nguồn gốc progesteron

Progesteron do thể vàng tiết ra Ngoài ra nó còn ñược sản xuất một ít ở tinh hoàn, vỏ thượng thận và nhau thai Progesteron ñược tổng hợp ñược từ acetat qua các khâu trung gian là cholesterol và 5A- pregnenolon

Progesteron ñược qua gan bị biến thành pregnandiol (20%) và một ít dưới dạng glucuronat prenanetriol Lượng glucuronat prenanetriol tăng trong