Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên a (nhóm máu a) trên màng tế bào hồng cầu người

i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết công bố luận văn hồn tồn trung thực, xác chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hằng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân tơi TS Nguyễn Thị Trung chủ nhiệm đề tài KC04.13/11-15 hết lòng giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu để hồn thành luận văn tốt nghiệp Tiếp theo, tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy, cô trường Đại học Thái Nguyên, Viện Sinh thái Tài Nguyên sinh vật thầy, cô Viện Cơng nghệ sinh học nhiệt tình giảng dạy cho tơi suốt thời gian tham gia khóa học Tơi xin chân thành cảm ơn TS Lê Văn Phan, ThS Vũ Thị Thu Hằng, BSTY Thân Đức Dương cán phòng kiểm nghiệm – Cơng ty cổ phần phát triển công nghệ nông thôn tạo điều kiện để thực luận văn tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn đến GS TS Trương Nam Hải cán phòng Kỹ thuật di truyền, người thân gia đình bạn bè hỗ trợ, động viên, khuyến khích tơi suốt q trình học tập Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Nguyễn Thị Hằng Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ix MỞ NỘI DUNG Chương Tổng quan 1.1 Tổng quan miễn dịch 1.1.1 Hệ miễn dịch 1.1.2 Hệ thống miễn dịch bẩm sinh 1.1.3 Hệ thống miễn dịch thích ứng 1.1.3.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào 1.1.3.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể 1.1.4 Kháng nguyên 1.1.5 Kháng thể 10 1.2 Khái quát hệ thống nhóm máu người 12 1.2.1 Phân loại hệ thống nhóm máu người 12 1.2.2 Hệ thống nhóm máu ABO 13 1.2.3 Vai trò máu y học 14 1.2.4 Truyền máu nguyên tắc truyền máu 14 1.2.5 Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO 15 1.3 Kháng thể đơn dòng 16 1.3.1 Cơng nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 16 1.3.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng cơng nghệ tế bào lai 19 1.3.3 Vai trò kháng thể đơn dòng 20 1.3.4 Tình hình sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng ngun nhóm máu hệ ABO 21 1.4 Động lực học sinh trưởng sản xuất tế bào động vật 21 Chương Vật liệu phương pháp 25 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẦU iv 2.1 Vật liệu 25 2.1.1 Động vật 25 2.1.2 Hồng cầu mẫu 25 2.1.3 Dòng tế bào myeloma 25 2.1.3 Hóa chất 25 2.1.4 Máy móc thiết bị 26 2.2 Phương pháp 26 2.2.1 Gây miễn dịch 26 2.2.2 Chuẩn bị tế bào 27 2.2.3 Nuôi cấy tế bào myeloma 28 2.2.4 Dung hợp tạo dòng tế bào lai 29 2.2.5 Tách dòng tế bào lai 31 2.2.6 Phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa 96 giếng 32 2.2.7 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến kính 33 2.2.8 Phương pháp đếm tế bào 33 2.2.9 Xây dựng đường cong sinh trưởng để nghiên cứu sinh trưởng sản xuất kháng thể dòng tế bào lai 33 2.2.10 Xác định loại globulin miễn dịch 34 2.2.11 Loại bỏ phenol ammonium sulfate 35 2.2.12 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A 36 2.2.13 Xác định độ đặc hiệu 36 2.2.14 Xác định hiệu giá 36 2.2.15 Xác định cường độ tính 36 Chương Kết 38 + 3.1 Đánh giá hiệu gây miễn dịch hồng cầu mẫu A 38 3.2 Dung hợp tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A 39 3.3 Sàng lọc hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 41 3.4 Tạo dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên A 43 3.5 Xác định phân lớp kháng thể dòng tế bào A6G11C9 sản xuất 44 3.6 Sự sinh trưởng sản xuất kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 tiết kháng thể kháng kháng nguyên A 45 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v 3.7 Hiệu giá kháng thể dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 49 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất 50 3.9 Loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 phương pháp tủa ammonium sulfate 52 3.10 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A 55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Thành phần đáp ứng miễn dịch bẩm sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Hình 1.2 Quá trình thực bào Hình 1.3 Cách tế bào NK protein bổ thể tạo lỗ màng để têu diệt tế bào lây nhiễm tác nhân gây bệnh Hình 1.4 Tế bào T bám vào kháng nguyên lạ liên kết với protein MHC Hình 1.5 Kháng nguyên diện protein MHC Hình 1.6 Hàng rào miễn dịch tế bào T Hình 1.7 Hàng rào miễn dịch tế bào B Hình 1.8 Cấu trúc phân tử kháng thể 11 Hình 1.9 Kháng ngun nhóm máu người 13 Hình 1.10 Sơ đồ truyền máu 15 Hình 1.11 Các phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng 19 Hình 1.12 Cơng nghệ tế bào lai 20 Hình 1.13 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 21 Hình 1.14 Đường cong sinh trưởng tế bào 24 Hình 2.1 Tế bào đại thực bào nuôi cấy tnh…………………………………… 28 Hình 2.2 Sơ đồ pha lỗng tới hạn 31 Hình 2.3 Phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa đáy chữ V 32 Hình 2.4 Cách đọc kết của phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa 96 đáy chữ V 32 Hình 2.5 Buồng đếm tế bào 33 Hình 2.6 Cơ chế cách đọc kết phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể 35 Hình 3.1 Phản ứng ngưng kết huyết chuột gây miễn dịch với hồng + + + cầu mẫu A , B , O 38 Hình 3.2 Lách hạch vùng kheo thu từ chuột gây miễn dịch với hồng cầu mẫu A+ 39 Hình 3.3 Tế bào sau dung hợp 40 Hình 3.4 Tế bào lai hình thành sau ngày dung hợp 40 Hình 3.5 Tế bào lai sau ngày dung hợp giếng khác 41 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii Hình 3.6 Sự phát triển tế bào lai 42 Hình 3.7 Sàng lọc giếng chứa hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 43 Hình 3.8 Sàng lọc dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng ngun A 44 Hình 3.9 Chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A tốt 44 Hình 3.10 Phản ứng ELISA xác định isotye kháng thể 45 Hình 3.11 Đường cong sinh trưởng dòng tế bào lai A6G11C9 môi trường DMEM + 10% FBS 47 Hình 3.12 Đường cong sinh trưởng dòng tế bào lai A6G11C9 ni cấy mơi trường có nồng độ huyết thấp DMEM + 1%FBS 48 Hình 3.13 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dòng tế bào A6G11C9 ni cấy mơi trường DMEM + 10% FBS 49 Hình 3.14 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dòng tế bào A6G11C9 nuôi cấy môi trường DMEM + 1% FBS 49 Hình 3.15 Xác định hiệu giá kháng thể phương pháp ngưng kết hồng cầu 50 Hình 3.16 Phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc hiệu kháng thể 51 Hình 3.17 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến kính xác định tính kháng thể cường độ phản ứng ngưng kết 52 Hình 3.18 Dịch ni cấy trước sau tủa ammonium sulphate 53 Hình 3.19 Độ đặc hiệu kháng thể trước sau tủa 54 Hình 3.20 Hiệu giá kháng thể trước sau tủa ammonium sulfate 54 Hình 3.21 Sinh phẩm A phản ứng ngưng kết hồng cầu sinh phẩm với panel hồng cầu hệ ABO 56 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii viiiv DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Hưỡng dẫn đọc kết phương pháp huyết mẫu 16 Bảng Hưỡng dẫn đọc kết phương pháp hồng cầu mẫu 16 Bảng Môi trường sử dụng……………………………………………………… .25 Bảng 2 Một số dung dịch 26 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ix DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ MHC Major histocompatibility complex APC Antgen presentng cell ISBT Internatonal society of blood transfusion EDTA Ethylenediaminetetraacetc acid EBV Epstein – Barr virus scFv Variable Single chain fragment variable VH domains of the heavy VL Variable domains of the light RT-PCR Reverse transcripton polymerase chain reaction ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay hmAb Human monoclonal antibody HGPRT Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase PEG Polyethylene glycol HAT Hypoxanthyl aminoteptrin thymidine DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium FBS Fetal bovine serum FCA Freund’s complete adjuvant FIA Freund’s incomplete adjuvant HT Hypoxanthine thymine DMSO Dimethylsulfoxide Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Máu xem loại thuốc đặc biệt sử dụng điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp ghép tạng, mổ tim, lọc máu ngồi thận Tuy nhiên, có nhiều tai biến nguy hiểm xảy sử dụng máu điều trị bệnh có ngưng kết kháng nguyên màng hồng cầu người cho với kháng thể huyết người nhận Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế thống kê có 35 hệ nhóm máu với 300 kháng nguyên nhóm máu khác Hầu hết kháng nguyên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu dùng để nghiên cứu di truyền quan hệ huyết thống, có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây phản ứng ngưng kết truyền máu dẫn đến tai biến kháng nguyên A, B hệ nhóm máu ABO kháng nguyên D hệ nhóm máu Rh Để truyền máu thành cơng phải có tương thích máu người cho người nhận Do đó, trước truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu Nhóm máu xác định phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu huyết mẫu Huyết mẫu kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng ngun nhóm máu, có loại huyết mẫu anti-A, anti-B, ant-AB sử dụng xác định nhóm máu hệ ABO huyết mẫu ant-D để xác định nhóm máu hệ Rh Nhiều phương pháp phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng cơng nghệ lai tế bào, cơng nghệ tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp Phương pháp lai tế bào được ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hiện nay, thuốc thử xác định nhóm máu có chất kháng thể đơn dòng sản xuất thành cơng Blood Grouping (Prestige Diagnostcs U.K.), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Ant – A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad)… Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu điều trị bệnh ngày lớn nhu cầu sử dụng huyết mẫu ngày gia tăng Tuy nhiên, Việt Nam chưa sản xuất kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu mẫu thu thập từ tnh nguyện viên kháng thể đơn dòng nhập ngoại Việc sử dụng thuốc thử xác định nhóm máu hồng cầu mẫu tốn chi phí lại nhiều Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 3.12 Đường cong sinh trưởng dòng tế bào lai A6G11C9 ni cấy mơi trường có nồng độ huyết thấp DMEM + 1%FBS Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 thu hàng ngày sau xác định hiệu giá kháng thể để đánh giá khả sản xuất kháng thể dòng tế bào Sự hình thành kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 tăng suốt pha lũy thừa q trình ni cấy, hiệu giá kháng thể đạt cực đại sau khoảng 100 nuôi cấy không thay đổi tế bào chết hoàn toàn Dữ liệu quan sát ni cấy dòng tế bào A6G11C9 môi trường DMEM + 10% FBS mơi trường có nồng độ huyết thấp DMEM + 1% FBS Khi nuôi cấy môi trường DMEM + 10% FBS hiệu giá đạt cực đại mơi trường DMEM + 1% FBS (hình 3.13, hình 3.14) Trong khoảng thời gian sau 50-100 ni hàm lượng kháng thể tăng mạnh, đạt cực đại sau khoảng 100 trì không thay đổi Điều cho thấy sau tế bào đạt đến mật độ tối đa tế bào bắt đầu chết, sau khoảng 100 ni cấy số lượng tế bào giảm mạnh chứng tỏ kháng thể giải phóng hồn tồn tế bào bị phân giải Mặt khác, hàm lượng kháng thể hình thành ni tế bào hai mơi trường có nồng độ huyết khác khác Điều lý giải sau: mật độ tế bào tối đa mơi trường có nồng độ huyết cao so với mơi trường có nồng độ huyết thấp hàm lượng kháng thể hình thành cao Như vậy, hàm lượng kháng thể sản xuất tế bào A6G11C9 có liên quan đến số lượng tế bào sống Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Hình 3.13 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dòng tế bào A6G11C9 nuôi cấy môi trường DMEM + 10% FBS Hình 3.14 Đồ thị biểu thị hình thành kháng thể dòng tế bào A6G11C9 nuôi cấy môi trường DMEM + 1% FBS Như vậy, tiến hành nghiên cứu ni cấy dòng tế bào lai A6G11C9 nhận thấy tế bào sinh trưởng sản xuất kháng thể tốt nuôi cấy tế bào mơi trường có 10% huyết với mật độ tế bào ban đầu 10 tế bào/ml Mật độ tế bào đạt cực đại 11x10 tế bào/ml sau khoảng 50 nuôi cấy hiệu giá kháng thể đạt cực đại sau khoảng 100 ni cấy đối Do đó, ni cấy tế bào tiến hành cấy chuyển tế bào sau khoảng 40-50 nuôi cấy với tỷ lệ cấy truyền 1/10 để mật độ nuôi cấy ban đầu đạt 10 tế bào/ml nuôi tế bào để thu lượng kháng thể nhiều tến hành thu dịch nuôi cấy sau khoảng 100 nuôi cấy 3.7 Hiệu giá kháng thể dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Dòng tế bào lai A6G11C9 ni cấy in – vitro tiết kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A môi trường nuôi cấy Tùy thuộc vào loại dòng tế bào lai mà hàm lượng kháng thể tết môi trường nuôi cấy nhiều Hiệu giá kháng thể sử dụng để đánh giá tương đối hàm lượng kháng thể Hiệu giá cao hàm lượng kháng thể nhiều Hiệu giá kháng thể độ pha lỗng kháng thể lớn mà phản ứng ngưng kết hồng cầu xảy Dòng tế bào lai A6G11C9 nuôi cấy môi trường DMEM + 10%FBS, sau ngày thu dịch nuôi cấy để xác định hiệu giá Độ pha loãng lớn kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất mà ngưng kết xảy 1/512 Hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên A dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất 512 (2 ) cao so với kháng thể kháng A dòng A907 báo cáo Fouad Sadiq năm 2005 10 256 (2 ) thấp so với huyết mẫu hãng Biorad 1024 (2 ) [28] Như vậy, hiệu giá kháng thể dịch ni cấy dòng tế bào A6G11C9 sản xuất tương đối cao tức hàm lượng kháng thể dịch ni cấy tương đối nhiều khả sản xuất kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 tốt Hình 3.15 Xác định hiệu giá kháng thể phương pháp ngưng kết hồng cầu 3.8 Độ nhạy độ đặc hiệu kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất Độ đặc hiệu đề cập đến khả vị trí liên kết kháng nguyên kháng thể phản ứng với loại kháng nguyên Nếu dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên A màng hồng cầu làm phản ứng ngưng kết với + + + panel hồng cầu nhóm máu hệ ABO (nhóm máu A , nhóm máu B , nhóm máu O ) + ngưng kết quan sát phản ứng dịch nuôi cấy với hồng cầu A mà không quan + sát phản ứng dịch nuôi cấy tế bào với hồng cầu B + phản ứng dịch nuôi cấy với hồng cầu O Khi tiến hành xác định độ đặc hiệu Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn kháng thể dòng tế bào A6G11C9 sản xuất kháng thể ngưng kết với Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn + + + hồng cầu mẫu A mà không ngưng kết với hồng cầu mẫu B O kháng thể kháng nguyên A dòng tế bào lai A6G11C9 đặc hiệu cho kháng nguyên A Hình 3.16 Phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa 96 giếng đáy chữ V xác định độ đặc hiệu kháng thể Độ nhạy kháng thể đánh giá thông qua tính kháng thể cường độ phản ứng kháng nguyên – kháng thể Ái tính tổng độ mạnh nhiều định kháng nguyên với kháng thể đa hóa trị đánh giá thời gian cần thiết để quan sát mắt thường dấu hiệu đầu tên phản ứng ngưng kết hồng cầu Ái tính kháng thể có dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 xác định phản ứng ngưng kết dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 hồng cầu mẫu A + 10% khoảng giây để nhận biết dấu hiệu đầu tên phản ứng ngưng kết huyết mẫu A Biorad khoảng giây Cường độ đánh giá độ mạnh phản ứng ngưng kết kháng nguyên – kháng thể xác định phản ứng ngưng kết dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 hồng cầu mẫu A 10% thủy tnh, kết đánh giá sau phút tạo cụm ngưng kết: 4+) hạt dịch trong, (3+) vài hạt dịch trong, (2+) vài hạt nhỏ dịch đục, (+1) nhiều hạt nhỏ dịch đục, (-) không ngưng kết Cường độ phản ứng ngưng kết dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 hồng cầu mẫu A 10% 3+ có vài cụm ngưng kết dịch cường độ phản ứng ngưng kết huyết Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn mẫu A Biorad hồng cầu mẫu A 10% 4+ Thông qua đánh giá tính kháng thể cường độ phản ứng ngưng kết hồng cầu nhận thấy kháng thể có dịch ni cấy dòng tế bào lai A6G11C9 có độ nhạy cao Hình 3.17 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến kính xác định tính kháng thể cường độ phản ứng ngưng kết 3.9 Loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 phương pháp tủa ammonium sulfate Dịch ni cấy tế bào lai A6G11C9 có chứa kháng thể kháng kháng nguyên A với protein kháng thể có nguồn gốc từ huyết bò (Fetal Bovine Serum – FBS) Tuy nhiên, kiểm tra độ đặc hiệu kháng thể có dịch ni cấy tế bào lai + + + A6G11C9 với hồng cầu mẫu A , B , O kháng thể dịch nuôi cấy nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A màng hồng cầu Do dịch nuôi cấy chứa kháng thể kháng kháng nguyên A có lẫn tạp với protein huyết bò khơng ảnh hưởng đến độ đặc hiệu kháng thể kháng nguyên A Như vậy, sử dụng trực tếp dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 để làm thuốc thử xác định nhóm máu A Tuy nhiên sinh phẩm xác định nhóm máu thương mại, kháng thể kháng A, kháng B kháng AB pha với chất màu khác để phân biệt tránh nhầm lẫn xảy xác định nhóm máu Đối với kháng thể kháng A, sản phẩm thương mại có màu xanh Để tạo màu cho sản phẩm cần tến hành pha dịch nuôi cấy tế bào với chất màu Tuy nhiên, môi trường ni cấy tế bào có sử dụng chất thị môi trường phenol đỏ để tạo màu xanh cho sản phẩm trước hết cần phải tến hành loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy tế bào Để loại bỏ phenol đỏ phương pháp đơn giản tủa ammonium sulfate Như vậy, Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn tnh kháng thể phương pháp tủa với ammonium sulfate bão hòa 50% với mục đích loại bỏ phenol đỏ khỏi dịch nuôi cấy Để thấy rõ khả loại bỏ phenol phương pháp tủa ammonium sulfate, tiến hành nuôi cấy thu lượng nhỏ dịch nuôi cấy sau tế bào phát triển đến pha log Thu dịch ni cấy lúc nhìn rõ màu phenol đỏ thu sau tế bào chết hồn tồn lúc mơi trường chuyển vàng Sau dịch nuôi cấy tủa với ammonium sulfate, tiến hành ly tâm để thu cặn có chứa kháng thể loại bỏ dịch có chứa phenol đỏ Tủa sau rửa để loại bỏ hoàn toàn phenol đỏ tái huyền phù vào đệm PBS 1X Không quan sát thấy diện phenol đỏ sau tái huyền phù tủa vào đệm Như vậy, loại bỏ thành công phenol đỏ khỏi kháng thể Hình 3.18 Dịch ni cấy trước sau tủa ammonium sulphate Sau tnh sạch, kháng thể làm phản ứng ngưng kết phiến kính với hồng + + cầu mẫu A B để đánh giá lại độ đặc hiệu kháng thể có thay đổi sau tủa muối hay khơng Nhận thấy rằng, kháng thể trước sau tủa muối (cơ đặc lần hòa với thể tích ban đầu) nhận diện đặc hiệu kháng nguyên A Như vậy, độ đặc hiệu kháng thể sau tủa muối không thay đổi cường độ ngưng kết thay đổi Kháng thể đặc lần cường độ ngưng kết mạnh so với dịch ni cấy ban đầu kháng thể sau tủa hòa thể tích với thể tích ban đầu cường độ ngưng kết giảm Điều hàm lượng kháng thể bị thay đổi, q trình tủa khơng phải tồn kháng thể mong muốn tủa mà thể bị phần hàm lượng kháng thể giảm dẫn đến Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn cường độ ngưng kết giảm, đặc hàm lượng kháng thể tăng lên từ cường độ ngưng kết tăng theo Hình 3.19 Độ đặc hiệu kháng thể trước sau tủa Để xem xét có phải hàm lượng kháng thể bị giảm sau tủa hay không chúng tơi tến hành xác định hiệu giá kháng thể trước sau tủa (cô đặc hòa thể tích thể tích ban đầu) Kết hiệu giá cho thấy, kháng thể sau tủa có hàm lượng tương đương với với hàm lượng có dịch nuôi cấy ban đầu (hiệu giá ), đặc (thể tích giảm 1/5 so với ban đầu) hàm lượng kháng thể tăng lên lần đạt Hình 3.20 Hiệu giá kháng thể trước sau tủa ammonium sulfate Mặc dù hàm lượng kháng thể trước sau tủa không thay đổi cường độ ngưng kết kháng thể lại giảm Điều thành phần dịch ni cấy tế bào có ảnh hưởng đến cường độ phản ứng ngưng kết hồng cầu bị loại bỏ Trong môi trường ni cấy tế bào có bổ sung thêm huyết bò Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn mà thành phần huyết BSA, BSA lại có tác động làm tăng tương tác kháng nguyên kháng thể mà sau tủa hàm lượng BSA giảm ảnh hưởng đến cường độ ngưng kết phản ứng kháng nguyên – kháng thể [9] 3.10 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu A Các thuốc thử thử anti-A thương mại có màu xanh chúng tơi cần xác định chất màu bổ sung vào sinh phẩm Theo patent WO 2012083361, màu xanh thuốc thử anti-A thương mại patent blue V Patent blue V chất màu axit với nhóm sulphonic, phân ly nước tích điện âm hòa tan nhanh vào nước [3] Để tạo màu tương ứng sản phẩm thương mại tiến hành xác định hàm lượng chất màu bổ sung vào sinh phẩm Hàm lượng patent blue V bổ sung vào sinh phẩm 0,000035 g/ml Thuốc thử nhóm máu sử dụng điều kiện bình thường khơng vơ trùng mà kháng thể có chất protein dễ bị phân cắt protease Trong khơng khí có nhiều vi khuẩn, để tránh nhiễm khuẩn vào mẫu kháng thể dẫn đến sản xuất protease làm kháng thể bị phân cắt hoạt tính tến hành bổ sung chất bảo quản sodium azide với hàm lượng 0,01% để ngăn cản tạp nhiễm vi sinh vật vào sinh phẩm Phản ứng ngưng kết hồng cầu xảy hiệu mơi trường muối có nồng độ ion thấp, thơng thường sử dụng saline sử dụng đệm phosphate (PBS) để làm đệm pha kháng thể sau tnh Kháng thể sử dụng để xác định nhóm máu chúng tơi bổ sung thêm thành phần chống đông cho máu EDTA với nồng độ cuối 10 mM EDTA Như xác định thành phần bổ sung vào sinh phẩm chúng tôi: chất màu (Paten blue V sodium salt), chất chống vi sinh vật (sodium azide), môi trường vật lý cho phản ứng ngưng kết hồng cầu (đệm PBS 1X) chất chống đông (EDTA) Dịch nuôi cấy tế bào lai A6G11C9 tnh phương pháp tủa với ammonium sulfate để loại bỏ phenol đỏ Sau tủa, tủa kháng thể rửa lần với ammonium sulfate bão hòa 50% Tủa sau rửa huyền phù lại với đệm pha sinh phẩm với thể tích 1/5 thể tích ban đầu Thành phần đệm pha sinh phẩm A (0,0035% Patent blue V sodium salt + 0,01% sodium azide + 10mM EDTA PBS 1X, pH=7,8) Sau tạo sinh phẩm làm phản ứng ngưng kết hồng cầu Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn phiến kính để đánh giá độ đặc hiệu, cường độ ngưng kết tính sinh phẩm Kết cho thấy sinh phẩm xác định nhóm máu A mà tạo đảm bảo yêu cầu thuốc thử xác định nhóm máu A thương mại: sinh phẩm có màu xanh, sinh phẩm đặc hiệu kháng nguyên A với cường độ (4+) ≥3+, tính (2 giây) ≤10 giây, hiệu giá (512) ≥128 [18] Hình 3.21 Sinh phẩm A phản ứng ngưng kết hồng cầu sinh phẩm với panel hồng cầu hệ ABO Số hoá Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Chúng thành công việc xây dựng phương pháp để tạo tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A: thu nhận hỗn hợp tế bào lai 12 dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A, chọn dòng A6G11C9 dòng sản xuất kháng thể tốt - Đánh giá vài tính chất kháng thể dòng tế bào lai A6G11C9 sản xuất: kháng thể có phân lớp chuỗi nặng IgM, chuỗi nhẹ kappa, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên A với cường độ ngưng kết 3+ tính 2s, hiệu giá kháng thể đạt - Đã tạo sinh phẩm A xác định nhóm máu Kiến nghị - Tiếp tục hồn thiện quy trình sản xuất kháng thể quy mơ phòng thí nghiệm Số hố Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng anh Abhyankar A.V (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific for human blood group B” Journal of Hematological Malignancies, (2), pp.24-18 ATTC (2011), Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for continuous cell line Ballerini D.R., Li X., Shen W (2012), Method and system for detection of blood types, Patent number WO 2012083361 A1 Costabile M (2010), “Determining the reactvity and tter of serum using a haemagglutinaton assay”, Journal of Visualized Experiments, (35), pp.1752 Dean L (2005), “Chapter Blood and the cells it contains”, Blood groups and red cell antigens, Natonal Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) Dean L (2005), “Chapter Blood group antgen are surface marker on the red blood cell membrane”, Blood groups and red cell antigens, Natonal Center for Biotechnology Informaton, Bethesda (MD) Dean L (2005), “Chapter Blood transfusionand the immune system”, Blood groups and red cell antigens, National Center for Biotechnology Informaton, Bethesda (MD) Edward A.G (2014), Antibodies: A laboratory manual, second editon, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Fitzsimmons J.M and Morel P.A (2003), “The efects of red blood cell suspending media on hemagglutnaton and the antglobulin test”, Transfution, (19), pp.85-81 10 Fulle A., Takahashi M and Hurrell J.G.R (1992), “Immunizaton of Mice”, Current Protocols in Molecular Biology 11 Grodzki A.C and Berenstein E., (2010), “Antbody Purificaton: Ammonium sulfate fractonation or gel filtraton”, Springer 12 Hayter P.M (1989), An Investigation into factors that affect monoclonal antibody production by hybridomas in culture, Department of microbiology university of Surrey Guildford Surrey 13 Insttutional Animal Care and Use Committee (2012), Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats, the University of North Carolina at Chapel Hill 14 Iyer Y.S., Vasantha K., Manisha P., Jadhav S., Gupte S.C and Mohanty D (2006), “Producton of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal Medicin Research, (123), pp 561564 15 John B Z (2009), Essential Clinical Immunology, Cambridge University Press, United Kingdom 16 Kamala T (2007), “Hock immunization: A humane alternatve to mouse footpad injectons”, Journal Immunol Methods 17 Kanrko M., Kato Y., Horiuchi H and Osawa M (2003), “Molecular characterization of a human monoclonal antibody to B antgen in ABO blood type”, Immunology Letters, (86), pp.51-45 18 Kathy D B and Paula R.H (2013), Basic & Applied Concepts of Blood Banking and transfusion practices 19 Khan F., Khan RH., Sherwani A., Mohmood S., Azfer MA., (2002) “Lectns as markers for blood grouping”, Medical Science Monitor, (8), pp 300-293 20 Kumagai I and Tsumoto K., (2001), “Antgen–Antibody Binding”, Encyclopedia of life science 21 Lee GM, Huard TK and Palsson BO (1989), “Efect of serum concentration on hybridoma cell growth and monoclonal antibody producton at various inital cell densites”, Hybridoma, (8), pp.75-369 22 Levy M., Edelman L and Dighiero G (2001), “Molecular characterizaton of a monoclonal murine anti-blood group A antbody”, Immunology Letters, (76), pp.2315 23 Natonal Research Council (1999), Monoclonal Antibody Production, Natonal Academy Press, Washington 24 Ozzturk S S and Palsson O B (1990), “Effect of inital cell density on hybridoma growth, metabolism, and monoclonal antbody producton”, Journal Biotechnology, (16), pp 278-259 25 Pandey S (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal antbodies”, International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, (1), pp 94 – 88 26 Parham P (2009) The Immune System, third editon, Garland Science, London and NewYork 27 Peter J.D and Ivan M.R (2000), “The Immune System”, The New England Journal of Medicine, (343), pp.49-37 28 Sadiq F., Tissent A , Habt N., Radallah D., Amrani N E., Benchemsi N (2005), “Producton of a new anti-A monoclonal reagent”, African Journal of Bioteachnology, (4), pp 846-844 29 Shimizu S (2004), “Routes of Administraton”, The Laboratory Mouse, National Insttute of Animal Health, Tsukuba, Japan 30 Wang S (2011), “Advances in the producton of human monoclonal antbodies”, Antibody Technology Journal, 1, pp 4-1 Tài liệu tiếng việt 31 Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (2), Tr 203– 208 32 Nguyễn Hải Đăng (2008), Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone, Luận văn thạc sỹ, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Hà Nội 33 Pham Văn Ty Nguyễn Lân Dũng (2004), “Miễn dịch học”, Nhà xuất đại học quốc gia, Hà Nội Tài liệu Web 34 Bioatla (2015), Antbody Isotypes, http://bioatla.com/educational- appendix/antbodyisotypes, ngày 7/12/2015 35 Bộ y tế (2013), Thông tư hướng dẫn hoạt động truyền máu, http://thuvienphapluat.vn/van-ban/The-thao-Y-te/Thong-tu-26-2013-TT-BYT-nam2013-huong-dan-hoat-dong-truyen-mau-214176.aspx, ngày 12/7/2015 36 Immunology Module (2015), The innate and adaptive immune systems, http://missinglink.ucsf.edu, ngày 12/7/2015 37 Internatonal Society of Blood Transfusion (2014), Table of blood group systems v4.0, http://www.isbtweb.org, ngày 12/7/2015 38 Jerry R B (2015), Blood transfusion, http://www.medicinenet.com, ngày 7/12/2015 39 Wikipedia (2015), Blood transfusion, https://en.wikipedia.org, ngày 7/12/2015 40 http://medical-dictionary.thefreedictonary.com/phagocytosis, ngày 7/12/2015 41 http://www.novimmune.com/science/antibodies.html, ngày 7/12/2015 42 http://www.buzzle.com/artcles/blood-types-chart.html, ngày 7/12/2015 43 http://www.nature.com/nbt/journal/v25/n12/fg_tab/nbt1363_F1.html, ngày 7/12/2015 44 http://www.whatsthebiotechnology.com/blog/hybridoma-technology/, ngày 7/12/2015 ... pháp sản xuất kháng thể đơn dòng [43] 1.3.2 Sản xuất kháng thể đơn dòng công nghệ tế bào lai Tế bào lai tế bào tạo để sản xuất lượng lớn kháng thể đặc hiệu kháng nguyên (kháng thể đơn dòng) Để sản. .. dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên A 43 3.5 Xác định phân lớp kháng thể dòng tế bào A6 G11C9 sản xuất 44 3.6 Sự sinh trưởng sản xuất kháng thể dòng tế bào. .. dịch hồng cầu mẫu A 38 3.2 Dung hợp tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên A 39 3.3 Sàng lọc hỗn hợp tế bào lai sản xuất kháng thể kháng kháng nguyên A 41 3.4 Tạo