Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới sự hình thành vi thể (microvesicle) từ tế bào hồng cầu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE) TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LƯU THẢO LINH NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN ẢNH HƯỞNG TỚI SỰ HÌNH THÀNH VI THỂ (MICROVESICLE) TỪ TẾ BÀO HỒNG CẦU CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60 42 02 01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN ĐỨC BÁCH HÀ NỘI, NĂM 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2015 Tác giả luận văn Lưu Thảo Linh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp ngồi cố gắng thân tơi nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cơ, bạn bè người thân Trước tiên, tơi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS Nguyễn Đức Bách người định hướng nghiên cứu, tận tình bảo, giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận văn tốt nghiệp Tôi xin cám ơn chân thành TS Nguyễn Hữu Đức Th.S Phạm Thu Giang, Bộ môn Công nghệ sinh học động vật, Khoa Công nghệ Sinh học tạo điều kiện thuận lợi việc sử dụng trang thiết bị, kính hiển vi huỳnh quang, máy ly tâm q trình tơi thực luận văn Bộ mơn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy, Cô Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam người trực tiếp giảng dạy, trang bị kiến thức bổ ích suốt khoảng thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Quỹ phát triển Khoa học Công nghệ (NAFOSTED) tài trợ cho đề tài nghiên cứu mã số 106-YS.06-2013.16 để tơi có điều kiện thuận lợi thực luận văn Cuối cùng, với tất lòng kính trọng biết ơn vô hạn, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên giúp đỡ trình học tập thực đề tài Hà Nội, ngày 28 tháng năm 2015 Học viên Lưu Thảo Linh Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU vii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi thể 1.1.1 Giới thiệu vi thể 1.1.2 Vi thể khả truyền tín hiệu tế bào 1.1.3 Sự tương tác vi thể với tế bào 1.1.4 Khả vận chuyển protein vi thể 1.1.5 Khả vận chuyển nucleic acid vi thể 1.1.6 Tương tác vi thể với màng tế bào đích 1.2 Nghiên cứu hình thành vi thể tế bào 1.2.1 Sự hình thành tiết vi thể 1.2.2 Sự hình thành vi thể tế bào hồng cầu 10 1.3 2+ Vai trò sinh học Ca 12 2+ 1.3.1 Vai trò Ca điều kiện sinh lý bình thường 12 2+ 1.3.2 Vai trò Ca việc hình thành vi thể 14 Chương NỘI DUNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu 16 2.2 Phạm vi nghiên cứu 16 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2.3 Nội dung nghiên cứu 16 2.4 Phương pháp nghiên cứu 16 2.4.1 Chuẩn bịcác dung dịch hóa chất 16 2.4.2 Chuẩn bị mẫu hồng cầu 20 2.4.3 Chuẩn bị tế bào hồng cầu mang Fluo-4 20 2+ 2.4.4 Xác định nồng độ Ca nội bào huỳnh quang Fluo-4 21 2.4.5 Xác định xuất vi thể bề mặt tế bào 22 2.4.6 Xác định kích thước vi thể 23 2.4.7 Xử lý phân tích số liệu 23 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 2+ 3.1 Xây dựng thang chuẩn Ca nội bào 24 3.2 Xác định nồng độ Ca nội bào điều kiện sinh lý 25 3.3 Ảnh hưởng A23187 đến nồng độ Ca nội bào 26 3.4 Ảnh hưởng LPA đến nồng độ Ca nội bào 28 3.5 Ảnh hưởng PMA đến nồng độ Ca nội bào 31 3.6 Xác định ảnh hưởng Ca nội bào đến hình thành vi thể 33 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 3.6.1 Ảnh hưởng A23187 Ca nội bào đến hình thành vi thể 33 2+ 3.6.2 Ảnh hưởng LPA Ca nội bào đến hình thành vi thể 34 2+ 3.6.3 Ảnh hưởng PMA Ca nội bào đến hình thành vi thể 35 3.7 Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể 36 3.8 Xác định kích thước vi thể 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kích thước vi thể 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng cấu trúc màng tiết từ tế bào Hình 1.2 Sự tương tác MV với tế bào thông qua hai chế Hình 1.3 Quá trình hình thành vi thể 12 Hình 3.1 Thang chuẩn Ca nội bào 24 Hình 3.2 Tế bào hồng cầu điều kiện sinh lý 25 Hình 3.3 Nồng độ Ca nội bào điều kiện sinh lý 26 Hình 3.4 Sự thay đổi cường độ huỳnh quang Fluo-4 27 Hình 3.5 Ảnh hưởng A23187 đến nồng độ Ca nội bào 28 Hình 3.6 Ảnh hưởng LPA tới nồng độ Ca nội bào 29 Hình 3.7 Biến động Ca nội bào LPA 30 Hình 3.8 Nồng độ Ca nội bào khoảng thời gian 30 Hình 3.9 Ảnh hưởng LPA tới nồng độ Ca nội bào 32 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ Hình 3.10 Biến động Ca nội bào PMA 32 2+ Hình 3.11 Ảnh hưởng PMA tới nồng độ Ca nội bào 33 2+ Hình 3.12 Cảm ứng hình thành vi thể A23187 Ca 33 2+ Hình 3.13 Cảm ứng hình thành vi thể LPA Ca 34 2+ Hình 3.14 Cảm ứng hình thành vi thể PMA Ca 35 Hình 3.15 Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 36 Hình 3.16 Kích thước vi thể đo máy Zetasizer Nano 37 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Kí hiệu tắt Nội dung AM Acetoxymethyl Cai 2+ 2+ Ca nội bào DMSO Dimethyl sulfoxide ESCs Tế bào gốc phôi (Embryonic stem cells) GFP Green fluorescent protein HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid LPA Lysophosphatidic acid MV Vi thể (microvesicle) PBS Đệm phosphate – Phosphate-buffered saline PKC Protein kinase C PMA Phorbol myristate acetate PS Phosphatydilserine PSGL-1 P-selectin glycoprotein ligand-1 TFs Các yếu tố mô (Tissue Factors) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hiện để chuyển gene vào tế bào động vật người ta sử dụng biện pháp vật lý, hóa học vi tiêm, dung hợp màng có mặt calcium phosphate, xung điện chất kích thích có chất phospholipid gọi liposome hay lipofectin thông qua hoạt động virus để chuyển gene Trong số biện pháp này, cấu trúc liposome tích điện dương thường dùng để mang chuyển gene Tùy thuộc vào loại tế bào điều kiện khác loại kỹ thuật áp dụng Tuy nhiên, kỹ thuật có hạn chế chẳng hạn hiệu chuyển gene thấp, khơng ổn định, gây đáp ứng miễn dịch gây độc tế bào áp dụng điều kiện in vitro Chính cần thiết phải phát triển hệ thống có khả mang DNA để chuyển gene hiệu Vi thể (microvesicle/MV) cấu trúc có nguồn gốc từ màng tế bào có kích thước từ 100 nm-1 µ m, hình thành từ nhiều loại tế bào khác (Anderson et al., 2005, Barteneva et al., 2013) Nghiên cứu năm gần cho thấy điều kiện in vivo, vi thể mang phân tử protein, nucleic acid bao gồm DNA, mRNA miRNA đến tế bào đích thơng qua chế dung hợp màng (EL Andaloussi et al., 2013, Lee et al., 2011, van Doormaal et al., 2009, Yuan et al., 2009) Chính vi thể có vai trò quan trọng giao tiếp tế bào chuyển gene Vi thể hình thành hầu hết tế bào kể tế bào hồng cầu Do tế bào hồng cầu có số lượng lớn, có khả vận chuyển khắp mô, tế bào thể dễ dàng thu nhận ni cấy, vi thể có nguồn gốc từ tế bào hồng cầu người dùng để mang axit nucleic chuyển gene Để nghiên cứu khả mang DNA chuyển gene vi thể từ tế bào hồng cầu cần xác định điều kiện để tạo thành vi thể Chính vậy, chúng tơi tiến Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2+ 3.5 Ảnh hưởng PMA đến nồng độ Ca nội bào PMA chất kích hoạt cho họ protein kinase C (PKC) PKC họ lớn protein tham gia vào điều khiển chức nhiều protein khác thơng q phosphoryl hóa nhóm hydroxyl serine threonine protein Vì PKC đóng vai trò quan trọng chuỗi truyền tín hiệu tế bào ảnh hưởng đến nhiều trình sinh học khác Để khảo sát ảnh hưởng PMA tới nồng độ Ca 2+ nội bào, thí nghiệm tiến hành với tế bào hồng cầu có chứa Fluo-4 Huyền phù tế bào dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca 2+ 2mM Tương tự thí nghiệm với LPA, sau tế bào lắng xuống đáy, PMA bổ sung vào với nồng độ khác (2-10 µ M) Cường độ huỳnh quang đo sau PMA bổ sung Kết cho thấy PMA có tác động làm tăng nồng độ Ca 2+ nội bào, nhiên tác động khơng rõ ràng nhanh chóng A23187 LPA Tuy nhiên, PMA không gây tượng tan vỡ tế bào LPA nồng độ tương đối cao (10 µ M) (Hình 3.9) Thời gian cảm ứng để tăng Ca 2+ nội bào diễn chậm, đồng thời cường độ huỳnh quang tế bào sử dụng PMA thấp đáng kể so với cường độ huỳnh quang đo tiến hành thí nghiệm với A23187 LPA (Hình 3.10) Sự khác chế tác động PMA PMA khơng kích hoạt kênh vận chuyển Ca 2+ mà kích hoạt protein kinase C PMA khơng trực tiếp tham gia vào đường vận chuyển Ca 2+ từ bên ngồi vào tế bào mà có tác động gián tiếp thơng qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa protein khác Hàm lượng Ca 2+ nội bào xử lý tế bào PMA µ M trình bày Hình 3.11 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 31 2+ Hình 3.9.Ảnh hưởng LPA tới nồng độ Ca nội bào Bên trái: Trước bổ sung PMA Bên phải: Sau bổ sung PMA µ M 10 phút 2+ Hình 3.10 Biến động Ca nội bào PMA Mỗi đường thể dao động nồng độ Ca 2+ nội bào tế bào đơn Thí nghiệm đo liên tục 20 phút Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 2+ Hình 3.11 Ảnh hưởng PMA tới nồng độ Ca nội bào 2+ 3.6 Xác định ảnh hưởng Ca nội bào đến hình thành vi thể 2+ 3.6.1 Ảnh hưởng A23187 Ca nội bào đến hình thành vi thể Sự hình thành vi thể kèm với phá vỡ phân bố bất đối xứng thành phần lipid màng Phosphatidyl serine (PS) vốn phân bố lớp màng chuyển lớp màng hoạt động phospholipid scramblase Khi cảm ứng tế bào A23187, trình hình thành vi thể quan sát huỳnh quang protein Annexin V-FITC gắn đặc hiệu với PS bề mặt tế bào 2+ vi thể Sau đưa vào điều kiện cảm ứng khác bao gồm Ca mM có mặt A23187 nồng độ µ M Ảnh hưởng thời gian cảm ứng khảo sát sau khoảng thời gian khác từ 30, 60, 90, 120 240 phút Sau khoảng thời gian cảm ứng, tế bào ủ với Anexin V-FITC dung dịch đệm Annexin binding buffer Kết quan sát thấy vi thể bắt đầu hình thành sau 30 phút, sau lượng vi thể xuất nhiều nhiều sau sau thời điểm bắt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 đầu cảm ứng Việc phát hình thành vi thể bề mặt màng tế bào Annexin V-FITC thể Hình 3.12 2+ Hình 3.12 Cảm ứng hình thành vi thể A23187 Ca Mũi tên đỏ vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu Hình ảnh chụp sau 60 phút cảm ứng tế bào hồng cầu A23187 µ M Ca 2+ mM 2+ 3.6.2 Ảnh hưởng LPA Ca nội bào đến hình thành vi thể Để xác định ảnh hưởng LPA tới hình thành vi thể từ tế bào hồng cầu, tiến hành thí nghiệm với tế bào hồng cầu nhuộm Anexin VFITC Với tế bào hồng cầu dung dịch sinh lý với nồng độ Ca 2+ 2mM, sau bổ sung LPA có nồng độ dung dịch 2,5 µ M phút có hình thành vi thể từ số tế bào hồng cầu Sau 15 phút, cường độ huỳnh quang từ tế bào cực đại, số lượng tế bào hồng cầu hình thành vi thể tăng nhiều (Hình 3.13) Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nơng nghiệp Page 34 2+ Hình 3.13 Cảm ứng hình thành vi thể LPA Ca Mũi tên đỏ vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu Hình ảnh chụp sau 15 phút 2+ cảm ứng tế bào hồng cầu LPA 2,5 µ M Ca mM 2+ 3.6.3 Ảnh hưởng PMA Ca nội bào đến hình thành vi thể Tương tự,ảnh hưởng Ca 2+ nội bào đến hình thành vi thể PMA xác định Trong thí nghiệm này, nồng độ PMA sử dụng µ M Tế bào hồng cầu sau cảm ứng PMA khoảng thời gian khác ủ với Anexin V-FITC Kết cho thấy, cảm ứng PMA, hình thành giải phóng vi thể diễn chậm Sau 60 phút cảm ứng vi thể bắt đầu xuất bề mặt màng tế bào số lượng thấp nhiều so với cảm ứng A23187 LPA (Hình 3.14) Sự khác chế tác động PMA tới nồng độ Ca 2+ nội bào PMA khơng kích hoạt kênh vận chuyển Ca 2+ mà kích hoạt protein kinase C PMA khơng trực tiếp tham gia vào đường vận chuyển Ca 2+ từ bên ngồi vào tế bào mà có tác động gián tiếp thơng qua kích hoạt protein kinase C dẫn đến hoạt hóa protein khác Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 2+ Hình 3.14 Cảm ứng hình thành vi thể PMA Ca Mũi tên đỏ vi thể hình thành từ tế bào hồng cầu Hình ảnh chụp sau 60 phút 2+ cảm ứng tế bào hồng cầu PMA µ M Ca mM 3.7 Nghiên cứu phương pháp thu nhận vi thể Tế bào hồng cầu cảm ứng hình thành vi thể dung dịch đệm sinh lý có nồng độ Ca 2+ mM có mặt chất cảm ứng A23187 µ M LPA 2,5 µ M PMA µ M Sau mẫu ly tâm lần tốc độ 3000 g 4ºC để loại bỏ tế bào thể apoptosis Sau vi thể thu nhận siêu ly tâm 50.000 g 4ºC Vi thể thu sau gửi phân tích kích thước máy Zetasizer Nano ZS Dựa vào kết phân tích, chúng tơi xây dựng phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu (Hình 3.15) Học viện Nơng nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36 Hình 3.15 Phương pháp thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu 3.8 Xác định kích thước vi thể Hiện việc xác định kích thước cấu trúc nano thiết bị thơng thường khó khăn Do vi thể nhỏ có kích thước phạm vi 0,1 đến µ M nên sử dụng máy chuyên dụng kính hiển vi điện tử SEM, AFM Trong nghiên cứu này, mẫu vi thể gửi phân tích máy Zetasizer Nano ZS (Đại học Aston, Vương quốc Anh) Kết phân tích cho thấy kích thước vi thể thu có khác Kích thước trung bình vi thể thu dao động khoảng từ 150 đến 500 nm tùy thuộc vào điều kiện cảm ứng thời gian cảm ứng (Bảng 1) Bảng Kích thước vi thể Ch ạm Kíc ất v h Ac 190 L 168 P 276 M Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 37 Trong số trường hợp vi thể giải phóng khỏi tế bào phân bố thành phân đoạn có kích thước khác Tuy nhiên, phần lớn kết thu vi thể có đỉnh nằm phạm vi từ 100 đến 200 nm (Hình 3.16) Hình 3.16 Kích thước vi thể đo máy Zetasizer Nano Cho đến nay, thí nghiệm chuyển gene sử dụng cấu trúc có chất phospholipid liposome dạng lipofectin, kích thước tốt cấu trúc mang axit nucleic (DNA, mRNA miRNA) cần phạm vi 100 nm Với kích thước này, vi thể thu được sử dụng để nghiên cứu khả mang axit nucleic, đánh giá khả dung hợp màng chuyển gene vào tế bào Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Khi xử lí tế bào hồng cầu người với A23187 µ M LPA 2,5 µ M PMA µ M dẫn đến gia tăng Ca khác thời gian làm nồng độ Ca LPA nồng độ Ca 2+ 2+ 2+ nội bào Với chất cảm ứng nội bào tăng khác nhau, cụ thể với tăng diễn tức thời (sau 45-60 giây đạt cực đại) thời gian phản ứng chậm xử lý tế bào hồng cầu với PMA (sau 20 phút đạt cực đại) Bằng cách sử dụng kỹ thuật đánh dấu huỳnh quang, kính hiển vi huỳnh quang nồng độ Ca 2+ nội bào, hình thành giải phóng MV khỏi tế bào hồng cầu nghiên cứu Các vi thể thu nhận phương pháp ly tâm Kích thước trung bình vi thể tạo thành tương ứng với chất cảm ứng kèm theo Ca 2+ mM là: 190 ± 42 nm (A23187 2µ M); 168 ± 34 nm (LPA 2,5 µ M); 276 ± 35 nm (PMA µ M) Điều kiện cảm ứng tối ưu để tạo vi thể từ tế bào hồng cầu phục vụ cho nghiên cứu xử lí tế bào hồng cầu với LPA 2,5 µ M, Ca 2+ 2mM Ở điều kiện cảm ứng này, thời gian vi thể tạo thành ngắn kích thước trung bình vi thể tạo thành nhỏ (168 ± 34 nm ) Bởi nay, thí nghiệm chuyển gene sử dụng cấu trúc có chất phospholipid liposome dạng lipofectin, kích thước tốt cấu trúc mang axit nucleic (DNA, mRNA miRNA) cần phạm vi 100 nm Kiến nghị Các kết thu từ đề tài hữu ích cho nghiên cứu sinh học bản, góp phần giải thích chế dẫn đến hình thành vi thể hồng cầu dạng tế bào khác trình sinh lý bệnh Dựa kết thu được, vi thể giải phóng từ tế bào hồng cầu thu Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 39 thập cho nghiên cứu xác định đặc tính chức từ sử dụng vi thể làm cơng cụ vận chuyển protein, nucleic acid vận chuyển thuốc đến tế bào đích Do hạn chế thời gian, điều kiện trang thiết bị, cần có nghiên cứu để làm rõ ảnh hưởng Ca 2+ tới hình thành cấu trúc vi thể, xác định đặc điểm vi thể, khả mang protein, nucleic acid dung hợp với tế bào khác Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Role of intracellular Ca2+ on the formation of microvesicle in human red blood cells TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 67-74 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Anderson, H C., Garımella, R & Tague, S E 2005 The role of matrix vesicles in growth plate development and biomineralization Front Biosci, 10, 822-37 Andrews, R K & Berndt, M C 2004 Platelet physiology and thrombosis Thromb Res, 114, 447-53 Antwı-Baffour, S., Kholıa, S., Aryee, Y K., Ansa-Addo, E A., Stratton, D., Lange, S & Inal, J M 2010 Human plasma membrane-derived vesicles inhibit the phagocytosis of apoptotic cells possible role in SLE Biochem Biophys Res Commun, 398, 278-83 Barry, O P., Kazanıetz, M G., Pratıco, D & Fıtzgerald, G A 1999 Arachidonic acid in platelet microparticles up-regulates cyclooxygenase-2-dependent prostaglandin formation via a protein kinase C/mitogen-activated protein kinase-dependent pathway J Biol Chem, 274, 7545-56 Barry, O P., Pratıco, D., Lawson, J A & Fıtzgerald, G A 1997 Transcellular activation of platelets and endothelial cells by bioactive lipids in platelet microparticles J Clin Invest, 99, 2118-27 Barteneva, N S., Fasler-Kan, E., Bernımoulın, M., Stern, J N., Ponomarev, E D., Duckett, L & Vorobjev, I A 2013 Circulating microparticles: square the circle BMC Cell Biol, 14, 23 Bevers, E M., Comfurıus, P., Dekkers, D W & Zwaal, R F 1999 Lipid translocation across the plasma membrane of mammalian cells Biochim Biophys Acta, 1439, 317-30 Buckı, R., Bachelot-Loza, C., Zachowskı, A., Gıraud, F & Sulpıce, J C 1998 Calcium induces phospholipid redistribution and microvesicle release in human erythrocyte membranes by independent pathways Biochemistry, 37, 15383-91 Cocuccı, E., Racchettı, G & Meldolesı, J 2009 Shedding microvesicles: artefacts no more Trends Cell Biol, 19, 43-51 D'souza-Schorey, C & Clancy, J W 2012 Tumor-derived microvesicles: shedding light on novel microenvironment modulators and prospective cancer biomarkers Genes Dev, 26, 1287-99 Dasgupta, S K., Abdel-Monem, H., Nıravath, P., Le, A., Bellera, R V., Langloıs, K., Nagata, S., Rumbaut, R E & Thıagarajan, P 2009 Lactadherin and clearance of platelet-derived microvesicles Blood, 113, 1332-9 De Vooght, K M., Lau, C., De Laat, P P., Van Wıjk, R., Van Solınge, W W & Schıffelers, R M 2013 Extracellular vesicles in the circulation: are erythrocyte microvesicles a confounder in the plasma haemoglobin assay? Biochem Soc Trans, 41, 288-92 Del Conde, I., Shrımpton, C N., Thıagarajan, P & Lopez, J A 2005 Tissue-factorbearing microvesicles arise from lipid rafts and fuse with activated platelets to initiate coagulation Blood, 106, 1604-11 Deregıbus, M C., Cantaluppı, V., Calogero, R., Lo Iacono, M., Tetta, C., Bıancone, L., Bruno, S., Bussolatı, B & Camussı, G 2007 Endothelial progenitor cell derived Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42 microvesicles activate an angiogenic program in endothelial cells by a horizontal transfer of mRNA Blood, 110, 2440-8 Elmore, S 2007 Apoptosis: a review of programmed cell death Toxicol Pathol, 35, 495516 Fackler, O T & Peterlın, B M 2000 Endocytic entry of HIV-1 Current Biology, 10, 1005-1008 Fevrıer, B., Vılette, D., Archer, F., Loew, D., Faıgle, W., Vıdal, M., Laude, H & Raposo, G 2004 Cells release prions in association with exosomes Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 9683-8 Graham, T R 2004 Flippases and vesicle-mediated protein transport Trends in Cell Biology, 14, 670-677 Gyorgy, B., Szabo, T G., Pasztoı, M., Pal, Z., Mısjak, P., Aradı, B., Laszlo, V., Pallınger, E., Pap, E., Kıttel, A., Nagy, G., Falus, A & Buzas, E I 2011 Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles Cell Mol Life Sci, 68, 2667-88 Holoch, D & Moazed, D 2015 RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression Nat Rev Genet, 16, 71-84 Huebner, A R., Somparn, P., Benjachat, T., Leelahavanıchkul, A., Avıhıngsanon, Y., Fenton, R A & Pısıtkun, T 2015 Exosomes in urine biomarker discovery Adv Exp Med Biol, 845, 43-58 Hugel, B., Martınez, M C., Kunzelmann, C & Freyssınet, J M 2005 Membrane microparticles: two sides of the coin Physiology (Bethesda), 20, 22-7 Kaestner, L., Tabellıon, W., Weıss, E., Bernhardt, I & Lıpp, P 2006 Calcium imaging of individual erythrocytes: problems and approaches Cell Calcium, 39, 13-9 Knowles, D W., Tılley, L., Mohandas, N & Chasıs, J A 1997 Erythrocyte membrane vesiculation: Model for the molecular mechanism of protein sorting Proc Natl Acad Sci U S A, 94, 12969-74 Kotowıcz, K., Dıxon, G L., Kleın, N J., Peters, M J & Callard, R E 2000 Biological function of CD40 on human endothelial cells: costimulation with CD40 ligand and interleukin-4 selectively induces expression of vascular cell adhesion molecule-1 and P-selectin resulting in preferential adhesion of lymphocytes Immunology, 100, 441-8 Lang, K S., Duranton, C., Poehlmann, H., Myssına, S., Bauer, C., Lang, F., Wıeder, T & Huber, S M 2003 Cation channels trigger apoptotic death of erythrocytes Cell Death Differ, 10, 249-56 Lee, T H., D'astı, E., Magnus, N., Al-Nedawı, K., Meehan, B & Rak, J 2011 Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer the emerging science of cellular 'debris' Semin Immunopathol, 33, 455-67 Losche, W., Scholz, T., Temmler, U., Oberle, V & Claus, R A 2004 Platelet-derived microvesicles transfer tissue factor to monocytes but not to neutrophils Platelets, 15, 109-15 Ludwıg, A K & Gıebel, B 2012 Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication Int J Biochem Cell Biol, 44, 11-5 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43 Mandal, D., Mazumder, A., Das, P., Kundu, M & Basu, J 2005 Fas-, caspase 8-, and caspase 3-dependent signaling regulates the activity of the aminophospholipid translocase and phosphatidylserine externalization in human erythrocytes J Biol Chem, 280, 39460-7 Manno, S., Takakuwa, Y & Mohandas, N 2002 Identification of a functional role for lipid asymmetry in biological membranes: Phosphatidylserine-skeletal protein interactions modulate membrane stability Proc Natl Acad Sci U S A, 99, 1943-8 Mıyamoto, S., Kowalska, M A., Marcınkıewıcz, C., Marcınkıewıcz, M M., Mosser, D., Edmunds, L H., Jr & Nıewıarowskı, S 1998 Interaction of leukocytes with platelet microparticles derived from outdated platelet concentrates Thromb Haemost, 80, 982-8 Mohandas, N., Clark, M R., Jacobs, M S & Shohet, S B 1980 Analysis of factors regulating erythrocyte deformability J Clin Invest, 66, 563-73 Nguyen, D B., Wagner-Brıtz, L., Maıa, S., Steffen, P., Wagner, C., Kaestner, L & Bernhardt, I 2011 Regulation of phosphatidylserine exposure in red blood cells Cell Physiol Biochem, 28, 847-56 Orrenıus, S., Zhıvotovsky, B & Nıcotera, P 2003 Regulation of cell death: the calciumapoptosis link Nat Rev Mol Cell Biol, 4, 552-65 Ouyang, L., Shı, Z., Zhao, S., Wang, F T., Zhou, T T., Lıu, B & Bao, J K 2012 Programmed cell death pathways in cancer: a review of apoptosis, autophagy and programmed necrosis Cell Prolif, 45, 487-98 Polgar, J., Matuskova, J & Wagner, D D 2005 The P-selectin, tissue factor, coagulation triad J Thromb Haemost, 3, 1590-6 Raposo, G & Stoorvogel, W 2013 Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends J Cell Biol, 200, 373-83 Ratajczak, J., Wysoczynskı, M., Hayek, F., Janowska-Wıeczorek, A & Ratajczak, M Z 2006 Membrane-derived microvesicles: important and underappreciated mediators of cell-to-cell communication Leukemia, 20, 1487-95 Reınhardt, T A., Lıppolıs, J D., Nonnecke, B J & Sacco, R E 2012 Bovine milk exosome proteome J Proteomics, 75, 1486-92 Romero, P J & Romero, E A 1999 The role of calcium metabolism in human red blood cell ageing: a proposal Blood Cells Mol Dis, 25, 9-19 Sarkar, A., Mıtra, S., Mehta, S., Raıces, R & Wewers, M D 2009 Monocyte Derived Microvesicles Deliver a Cell Death Message via Encapsulated Caspase-1 PLoS One, Steffen, P., Jung, A., Nguyen, D B., Muller, T., Bernhardt, I., Kaestner, L & Wagner, C 2011 Stimulation of human red blood cells leads to Ca2+-mediated intercellular adhesion Cell Calcium, 50, 54-61 Templeton, N S 2002 Cationic liposome-mediated gene delivery in vivo Biosci Rep, 22, 283-95 Tıffert, T., Etzıon, Z., Bookchın, R M & Lew, V L 1993 Effects of deoxygenation on active and passive Ca2+ transport and cytoplasmic Ca2+ buffering in normal human red cells J Physiol, 464, 529-44 Tıffert, T & Lew, V L 1997 Apparent Ca2+ dissociation constant of Ca2+ chelators incorporated non-disruptively into intact human red cells J Physiol, 505, 403-10 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44 Thomas, S L., Bouyer, G., Cueff, A., Egee, S., Glogowska, E & Ollıvaux, C 2011 Ion channels in human red blood cell membrane: actors or relics? Blood Cells Mol Dis, 46, 261-5 Trams, E G., Lauter, C J., Salem, N., Jr & Heıne, U 1981 Exfoliation of membrane ectoenzymes in the form of micro-vesicles Biochim Biophys Acta, 645, 63-70 Van Doormaal, F F., Kleınjan, A., Dı Nısıo, M., Buller, H R & Nıeuwland, R 2009 Cellderived microvesicles and cancer Neth J Med, 67, 266-73 Vıdal, M 2010 Exosomes in erythropoiesis Transfus Clin Biol, 17, 131-7 Wıllıamson, P., Kulıck, A., Zachowskı, A., Schlegel, R A & Devaux, P F 1992 Ca2+ induces transbilayer redistribution of all major phospholipids in human erythrocytes Biochemistry, 31, 6355-60 Wolf, P 1967 The nature and significance of platelet products in human plasma Br J Haematol, 13, 269-88 Woon, L A., Holland, J W., Kable, E P & Roufogalıs, B D 1999 Ca2+ sensitivity of phospholipid scrambling in human red cell ghosts Cell Calcium, 25, 313-20 Yuan, A., Farber, E L., Rapoport, A L., Tejada, D., Denıskın, R., Akhmedov, N B & FARBER, D B 2009 Transfer of microRNAs by embryonic stem cell microvesicles PLoS One, 4, e4722 Zhou, Q., Lı, M., Wang, X., Lı, Q., Wang, T., Zhu, Q., Zhou, X., Wang, X., Gao, X & Lı, X 2012 Immune-related microRNAs are abundant in breast milk exosomes Int J Biol Sci, 8, 118-23 Zwaal, R F., Comfurıus, P & Bevers, E M 2004 Scott syndrome, a bleeding disorder caused by defective scrambling of membrane phospholipids Biochim Biophys Acta, 1636, 119-28 Zwaal, R F & Schroıt, A J 1997 Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells Blood, 89, 1121-32 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45 ... định điều kiện ảnh hưởng tới hình thành vi thể thu nhận vi thể từ tế bào hồng cầu Mục đích nghiên cứu - Xác định điều kiện để cảm ứng để hình thành vi thể tế bào hồng cầu - Phát xuất vi thể thông... vi thể 1.1.6 Tương tác vi thể với màng tế bào đích 1.2 Nghiên cứu hình thành vi thể tế bào 1.2.1 Sự hình thành tiết vi thể 1.2.2 Sự hình thành vi thể tế bào hồng cầu. .. 1.2.2 Sự hình thành vi thể tế bào hồng cầu Các thành phần màng tế bào hồng cầu đóng vai trò quan trọng vi c hình thành giải phóng vi thể, xác định vai trò thành phần màng tế bào hỗ trợ nhiều cho vi c