Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành củ từ vảy củ hoa Lily (Lilium longiflorum) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Sau khi tạo được cây con có thể tiếp tục nhânbằng cách tách các vảy củ đã được tạo thành đem cấy vào môi trường nhân.[16].Năm 1995, Dương Tấn Nhựt cũng đã thành công trong nghiên cứu nhâ

đó mà một nghề mới đã được ra đời và đem lại lợi nhuận lớn đó là nghề trồng vàkinh doanh hoa.

Cùng với sự phát triển không ngừng của xã hội, nhu cầu hoa ngày càng lớnđòi hỏi nghề trồng hoa phải có giống hoa mới lạ, hấp dẫn để đáp ứng được thị

hiếu của thị trường Hoa lily (Lilium longoflorum) là một loài hoa cao cấp có vẻ

đẹp quyến rũ, màu sắc phong phú, có hương thơm và độ bền hoa cắt cành cao

(10-15 ngày), dễ thu hoạch và bảo quản đã và đang chiếm lĩnh thị trường hoatươi trên thế giới và ở Việt Nam Hoa Lily không chỉ để trang trí mà còn được sửdụng để điều chế nước hoa, mỹ phẩm, kem chống lão hoá Do đó hoa Lily làmột loại cây hoa mang lại lợi nhuận rất lớn Hiện nay, ở nước ta giá trung bìnhtrên thị trường một cành hoa Lily là từ 15.000 đến 30.000 VN đồng/cành, thậmchí là 60.000 VN đồng/cành vào các ngày lễ tết.

Ở Việt Nam hoa Lily đã trồng thành công ở nhiều tỉnh như Lâm Đồng, LàoCai, Hà Nội Tuy nhiên, chúng ta phải thường xuyên nhập giống từ nước ngoàivới chí phí khá cao (10.000-15.000đồng/củ giống) và không chủ động đượcnguồn giống Kỹ thuật nhân giống vô tính in-vitro với ưu điểm nhân nhanhnhững cá thể đồng nhất về mặt di truyền, sinh trưởng và phát triển một cách đồngđều và cho hệ số nhân giống cao Chỉ cần một lượng nhỏ nguyên liệu ban đầu,nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện thích hợp có thể thu đượcmột lượng lớn cây (hoặc củ) giống trong thời gian ngắn hơn rất nhiều so với các

phương pháp truyền thống khác

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“ Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành củ từ vảy củ hoa Lily (Lilium longiflorum) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào ”.

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tạo củ cây hoa Lily từ nuôi cấy vảy củ bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào

3 Nội dung của đề tài

- Nghiên cứu các phương pháp khử trùng mẫu nuôi cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ saccharose đến khả năng tạo củ in vitro của cây hoa Lily.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng

tạo củ in-vitro của cây hoa Lily.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến khả năngnhân nhanh củ in-vitro cây hoa Lily.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến khả năng tạo củ củacây hoa Lily

Phần hai TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 Giới thiệu về cây Lily

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại thực vật của hoa Lily

Cây hoa Lily có tên khoa học là Lilium longiflorum Thumb., họ Liliaceae,

bộ phụ của thực vật một lá mầm Cây hoa Lily có nguồn gốc từ Nhật Bản và cácnước ở Châu Âu Hoa Lily được trồng tại Đà Lạt từ năm 1945 với các giống ở

Hà Nội Từ 1970, Đà Lạt đã nhập giống Lily từ Hàn Quốc, Nhật Bản Hiện nay,hoa Lily đang được trồng phổ biến nhiều nơi như Hà Nội, Đà Lạt

Theo hệ thống phận loại của Takhtajan cây Lily thuộc ngành hạt kín

Angiospermae, lớp một lá mầm Monocotyledoneae hay lớp loa kèn Liliopsida,

phân lớp loa kèn Liliae, bộ loa kèn Liliales, họ loa kèn Liliaceae (Hoàng Thị Sản, 2003; Nguyễn Nghĩa Thìn, Đặng Thị Sy, 2001) Họ Liliaceae là một trong những

họ lớn nhất với 200 chi và hơn 3000 loài Chi Lilium gồm khoảng 220 loài, trong

đó có một số loài đã được trồng cách đây 3000 năm Sau năm 1950, khoảng 100giống Lily mới đã được lai tạo và đăng ký tên trên thế giới với nhiều giống lai có

nguồn gốc từ hai loài Nhật Bản L.auratum và L.speciosum (Pelkonen, 2005) [1],

[5]

Trung Quốc là nước có nhiều chủng loại Lily nhất và cũng là trung tâm,nguồn gốc Lily trên thế giới Theo kết quả điều tra, ở Trung Quốc có khoảng 460giống, 280 biến chủng (chiếm trên 1/2 tổng giống hoa Lily trên thế giới), trong

đó có 136 giống, 52 biến chủng do Trung Quốc tạo ra Nhật, Hàn Quốc có 110giống trong đó có 30 giống mang đặc trưng của nước này Hà Lan có khoảng 320giống, trong đó 805 là các giống do chính Hà Lan tạo ra…

Cuối thế kỷ XVI, các nhà thực vật học người Anh đã phát hiện và đặt têncho các cây giống Lily Đầu thế kỷ XVII Lily được di thực từ Châu Âu đến Châu

Mỹ Sang thế kỉ XVIII các giống Lily của Trung Quốc được di thực sang Châu

Âu do vẻ đẹp và mùi thơm hấp dẫn nên cây Lily đã nhanh chóng phát triển vàđược coi là cây hoa quan trọng của Châu Âu, Châu Mỹ.

Vào cuối thể kỷ thứ XIX bệnh virut ở Lily lây lan mạnh, tưởng chừng câyLily bị hủy diệt Đến đầu thế kỷ XX khi người ta phát hiện ra giống Lily thơm ở

Trung Quốc (L.regane) có khả năng chống chịu tốt với bệnh virut, giống này

được nhập vào Châu Âu và chúng đã được dùng vào việc lai tạo giống mới để tạo

ra rất nhiều giống có tính thích ứng rộng, khả năng chống chịu sâu bệnh tốt, câyLily lại được phát triển mạnh mẽ

2.1.2 Đặc điểm hình thái

Lily là loài cây thân ngầm dưới đất có nhiều vảy bao bọc lại nên người tacòn gọi là hoa bách hợp Lily là cây thân thảo lâu năm Phần dưới mặt đất gồmthân vảy, rễ Phần trên mặt đất gồm lá, thân, mầm hạt (một số không có mầmhạt)

- Thân vảy (củ): là phần phình to của thân tạo thành, màu trắng hoặc màu

hồng nhạt, phía ngoài không có màng bao bọc nên gọi là thân vảy trần (không vỏ,thân vảy là củ giống để trồng).[14]

- Rễ: có hai tầng, rễ mọc ở gốc của thân vảy gọi là rễ gốc, to, mềm, có ngay

trên củ giống hoặc mọc ra ngay sau khi trồng Rễ mọc ở nơi tiếp giáp giữa củ vàthân trên mặt đất gọi là rễ thân

- Lá: mọc rãi rác thành vòng thưa, hình kim, xoè hoặc hình thuôn, hình giải,

đầu lá hơi nhọn, dài 10 - 15cm, rộng từ 1,5 - 2cm, có cuống hoặc không cócuống, trên lá có từ 1 - 7 gân, gân giữa rõ ràng hơn, lá mềm màu xanh bóng

- Thân: trên trục thân mang nhiều lá, trong các nách lá có thể mọc lên các

mầm hạt (củ con)

- Củ con và mầm hạt: đại bộ phận Lily có nhiều củ con ở gần thân rễ, có

chu vi từ 0,5 - 3cm, số lượng củ tuỳ thuộc giống và điều kiện trồng trọt

- Hoa: hoa đều, lưỡng tính, hoa mẫu ba Hoa lớn có khi mọc đơn độc hoặcmọc thành cụm ở trên ngọn Bao hoa đơn, dạng cánh, không phân hoá thành đài

và tràng rõ rệt, gồm sáu cánh xếp xen kẽ nhau, cánh hợp lại thành hai vòng khácnhau và không dính nhau Bộ nhị gồm có 6 nhị, giữa có cuống màu xanh nhạt,gắn với nhau thành hình chữ T Trục hoa nhỏ dài, đầu trục phình to, có 3 khía, tủphòng ở phía trên Màu sắc hoa phong phú, đẹp Có màu trằng, màu vàng, màutím và nhiều màu Màu cánh thường là đơn sắc hoặc có chấm màu nâu, màu tím,

có hương thơm

- Quả: hình trứng dài, mỗi quả có vài trăm hạt, bên trong có ba ngăn Hạt

hình dẹt, xung quanh có cánh mỏng, hình bán cầu, hoặc ba góc, vuông dài

2.1.3 Phân loại các giống hoa Lily

Do việc mua bán Lily trên thế giới phát triển, nên công tác lai tạo giống mớiluôn được chú ý và mở rộng, giống mới ngày càng nhiều Để tiện cho việc muabán, hiệp hội làm vườn Hoàng gia Anh (Royal Horticultural society Lilycommitie) năm 1963 đưa ra hệ thống phân loại Lily Hệ thống này chủ yếu căn

cứ vào nguồn gốc bố mẹ con lai, tác giả tạo ra giống và năm tạo giống từ đóngười ta chia giống Lily trồng trọt làm 4 nhóm:

- Nhóm 1: Nhóm Lily Phương Đông: gồm các chủng: L.auratum,

L.spucicsum, L.faponicum, L.rubellum chủ yếu là các giống lai có nguồn gốc

khác nhau

- Nhóm 2: Nhóm Lily Á châu: gồm L.lancipollium, L.lechttini var

maximwicgii, L.caculamabel, L.pumilum, L.bulboerem, L.dacidu, L.wiblanotiac

chủ yếu là nhóm Carotuoid là chính

- Nhóm 3: Nhóm Lily thơm: với các chủng L.langflorcum, Lily Đài Loan

(L.porosanum), Lily trắng (L.candidum), Lily Vương (L.regala) là chính.

- Nhóm 4: Nhóm Lily Tinh Diệp: gồm Lily Hán Lâm (L.hansoni), Lily

Tinh Diệp (L.martagou) là chính cùng với L.chalcudonicum, Lily ốc đan lai

tạo chọn lọc ra

Năm 1982, Hiệp hội Lily quốc tế đề ra hệ thống phân loại Lily trên cơ sở

Hệ thống phân loại của Anh năm 1963 Hệ thống này dựa vào nơi nguyên sản

của bố mẹ, quan hệ huyết thống, đặc trưng hình thái, màu sắc hoa và quy cácgiống Lily vào 8 nhóm:

- Nhóm Lily lai Á châu (Asiatic hybrids)

Do loại Lily Châu Á lai với chính con lai của nó (lai giữa các con lai bố mẹ

chủ yếu là Lily triển tiêu (L.mabile), Lily thân vảy (L.bullierum var croceum),

L.xhollamdicum, L.xmaculatum, L.xelegans, Lily lông (L.danricum), Lily ốc đan

(L.aoncoor, L.lancipolium, L.dacicii, L.cernum) Nhóm này có đặc điểm là hoa

hướng ra, màu hoa rất phong phú

Dựa vào hình dáng hoa nhóm này lại được phân làm 3 loại:

+ Loại hoa hướng lên trên: Mọc đơn hoặc trên hoa tự, hoa ra sớm Cácgiống thường thấy là: Apeldoora, Enchatmemt, Conmicticusking

+ Loại hoa hướng ra ngoài: các giống thường thấy là: Braudwine,Corsage, Proopierity

+ Loại hoa chúc xuống: các giống thường thấy là BlackButtylly,Conneticutyan, Wtonella

- Nhóm Lily lai Tinh Diệp (Martagon hybrids)

Do lai giữa L.martagon x L.hansonii Các giống thường thấy là Marhan,

Achievement, Graylights, Baollerina, Dairy, Maid

- Nhóm Lily lai hoa trắng (Condidum hybrids)

Các giống thường thấy là: Beerensiik, Prankfonce, Hughes Apiricot, WhitoMight

- Nhóm lai Lily Châu Mỹ (American hybrids)

Bắt nguồn từ L.paradalinum, L.parrue, sinh trưởng ở Châu Mỹ Các giống

thường thấy là: Shuksau, Belliungham, Bellauaud

- Nhóm lai Lily thơm (Longgiflorum hybrids)

Còn gọi là Lily pháo do Lily thơm (L.longiflỏum), Lily Đài Loan (L.porosanum) lai tạo ra, đặc điểm là hoa có hình dáng giống loa kèn, các giống

thường thấy là: Avita Come, Gelria, Snow Qeen

- Nhóm Lily lai loa kèn (Trumpet hybrids)

Bắt nguồn từ Lily Thông Giang (L.sargeutac), Lily Nghi Xương (L.lecauthum), Lily Hồ Bắc, Lily Vương lai với nhau Dựa vào hình dạng hoa có

+ Hình mặt trời mọc, cành hoa cong lại, các giống thường thấy là:Brightstar, Golden sunburst, Magic

- Nhóm lai Phương Đông (Oriental hybrids)

L.aurtum, L.spociosum, Lily đỏ (L.rubellum), Lily Nhật (L.piponcum) lai

với Lily Hồ Bắc tạo ra Căn cứ vào hình dáng hoa, nhóm này lại được phân làm 3loại:

+ Loại hình hoa loa kèn (hiện nay chưa có giống đăng ký)

+ Loại hình hoa hình bát, các giống thường thấy là: Bonpire, CasaBlanca, Empiress, Opchina

+ Loại hình hoa bằng dài là cánh hoa cong ngược lại

- Nhóm Lily nguyên chủng

Bao gồm tất cả các loại, các biến chủng biến hình nguyên bản xuất xứ của

nó [5]

Ở Việt Nam, ngoài giống hoa Loa kèn màu trắng được trồng, mới chỉ phát

hiện hai loài là cây Bách Hợp (L.Brownii F.E Brown var oldiesterri wils) mọc hoang dại trên núi đá Lạng Sơn, Cao Bằng và loài L.poilanei Gagenep có ở đồi

cỏ Sa Pa, Hoàng Liên Sơn [20]

2.1.4 Điều kiện sinh thái

Cây Lily chỉ sinh trưởng, phát triển tốt khi đáp ứng đầy đủ các yêu cầu vềđiều kiện sinh thái Trong đó các yếu tố như ánh sáng, nhiệt độ, nước, không khí,đất và dinh dưỡng là những yếu tố quan trọng nhất, ảnh hưởng trực tiếp đến sinhtrưởng và phát dục của cây Các yếu tố này không thể thay thế cho nhau và tácđộng tương hỗ lẫn nhau, và cũng không thể thiếu một yếu tố nào cho sự sinhtrưởng và phát triển của cây Lily

- Nhiệt độ

Nói chung Lily là cây chịu rét khá, chịu nóng kém, ưa khí hậu mát ẩm, nhiệt

độ thích hợp ban ngày là 20 - 250C, ban đêm là 120C Các giống thuộc nhóm tạpgiao Phương Đông thời kỳ đầu thích hợp nhiệt độ ban ngày 200C, ban đêm là

150C Nhóm Lily thơm chịu nóng tốt, nhiệt độ thích hợp: ban ngày 25- 280C, banđêm 18 - 200C Dưới 120C cây sinh trưởng kém, hoa dễ bị mù, thời gian đầu nhiệt

độ thấp có lợi cho sự ra rễ và phân hoá hoa

Nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát dục của Lily, quantrọng nhất ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, sự phát dục của thân và sự sinhtrưởng của lá, điều tiết sự phân hoá hoa và sự ra hoa

Ngược lại trồng trong nhà kính vào mùa Đông, ánh sáng không đủ, nhị đực

sẽ sản sinh etylen, dẫn đến sự rụng nụ Đặc biệt là nhóm Á châu rất mẫn cảm vớithiếu ánh sáng, do vậy cần bỏ bớt lưới hoặc nilon che phủ để tăng cường ánhsáng tự nhiên cho cây

Lily là cây dài ngày, chiếu sáng nhiều hay ngắn không những ảnh hưởng tới

sự phân hoá hoa, mà còn ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát dục của hoa.Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và phát dục của củ

- Nước

Đất quá khô hoặc quá nhiều nước đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phátdục của Lily Thời kỳ đầu cây cần nhiều nước, thời kỳ ra hoa nhu cầu về nướcgiảm bớt vì nước nhiều củ dễ bị thối và rụng nụ Lily thích không khí ẩm uớt, ẩm

độ thích hợp nhất là 80 - 85% Nếu ẩm độ biến động lớn dễ dẫn đến thối củ

- Không khí

Lily là cây khá mẫn cảm với khí etylen, tuy nhiên độ mẫn cảm của cácgiống khác nhau thì không giống nhau: giống Á châu mẫn cảm nhất, các dònggiống khác yếu hơn

- Đất

Lily có thể trồng ở mọi loại đất, nhưng đất nhiều mùn, đất thịt nhẹ là tốtnhất Lily là loại cây có rễ nông vì vậy đất thoát nước rất quan trọng Lily rất mẫncảm với muối, đất nhiều muối cây không hút được nước, ảnh hưởng đến sinhtrưởng, phân hoá hoa và ra hoa Nói chung hàm lượng muối không được vượtquá 15mg/cm2, chất oxy hoá không cao quá 1,5mmol/l

Đất quá chua cây hút ion sắt, nhôm, magie nhiều gây hại cho cây; đất kiềmquá, lượng hút sắt, magie, lân không đủ sẽ dẫn đến thiếu các sắc tố Các giốngthuộc nhóm tạp giao Á châu và Lily thơm yêu cầu độ pH thích hợp từ 6 - 7,giống thuộc nhóm Phương Đông lại yêu cầu thấp hơn (pH từ 5,5 - 6,5)

- Dinh dưỡng

Lily yêu cầu mức độ phân bón cao nhất trong ba tuần đầu kể từ sau khitrồng Tuy nhiên, lúc này rễ non dễ bị ngộ độc muối Muối trong đất có từ banguồn: phân bón, nước tưới và hàm lượng dinh dưỡng của cây trồng trước vụtrước Vì vậy để tránh tác hại của muối trong đất, trước khi trồng 6 tuần cần phân

tích đất để biết hàm lượng muối Lily cũng mẫn cảm với hợp chất chứa Clo, yêucầu lượng Clo trong đất không vượt quá 1,5 mmol/l, nếu không sẽ hại rễ.

Lily cũng mẫn cảm với Flo, nếu hàm lưọng Flo trong không khí cao dễ gâycháy lá Vì vậy không được bón phân có chứa Flo như muối Flophotphat mà phảibón loại phân có hàm lượng Flo thấp như CaHPO4 Đất thiếu Ca, Lily dễ bị vàng

lá, lá phát triển không gọn [14]

2.1.5 Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới và Việt Nam

2.1.5.1 Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới

Hoa Lily cắt cành là một loại hoa đẹp, hiện đang là một trong 6 loại hoa cắtphổ biến và có giá trị nhất (Hồng, Cúc, Phăng, Layơn, Đồng tiền, Lily) Hoa Lilyđược nhiều người biết đến và ưa chuộng bởi vẻ đẹp sang trọng, quyến rũ vàhương thơm thanh nhã cũng như độ bền của hoa (9 - 15 ngày) Trên thế giới, câyhoa Lily được trồng ở nhiều nước Châu Âu như: Hà Lan, Pháp, Đức, Bỉ, Nga Hiện nay cây hoa Lily cũng đã xuất hiện nhiều ở Nhật Bản, Trung Quốc, HànQuốc, Việt Nam, Kenia

Ở Hà Lan, cây hoa Lily được phát triển mạnh, diện tích trồng hoa Lily đứngthứ 2 trong tổng số diện tích hoa trồng bằng củ, đặc biệt nguồn cung cấp giống từnuôi cấy mô đã đạt đến 8.020.133.000 cây (1986) so với 1982 là 802.585.000cây Lượng hoa này năm 1986 cũng vượt xa cây hoa Lan (chỉ đạt 1.053.709.000cây) Sở dĩ có được sự tăng vọt này là do người Hà L an đã tạo ra rất nhiều giốngmới có hoa đẹp chống chịu sâu bệnh tốt, năng suất cao Ngoài ra do kỹ thuậttrồng hoa rất tiên tiến nên có thể trồng hoa quanh năm và giá thành giảm; vì vậy,hiệu quả kinh tế mang lại từ việc trồng hoa Lily cao hơn hẳn trước đây Hiện nay,

Hà Lan mỗi năm trồng 18.000 ha hoa Lily, trong đó xuất khẩu 70%.[5], [11].Nhật Bản là một trong nhưng nước tiêu thụ và nhập khẩu hoa lớn nhất Châu

Á (mỗi năm khoảng 500 triệu USD) Hiện nay, cây hoa Lily đã xuất hiện nhiều ởNhật Bản Theo số liệu thống kê của Nhật Bản, trong tổng số 1558 ha trồng cácloại hoa có củ (hoa Lily, hoa Tulip, hoa Layơn ), hoa Lily đã chiếm diện tích

508 ha, cho sản lượng hoa cắt cao đạt doanh thu lớn (15068 triệu Yên Nhật sovới tổng doanh thu các loại hoa củ là 33047 triệu Yên Nhật của năm 1991) [4].Cùng với Nhật Bản, Hàn Quốc cũng là một nước phát triển nghề trồng hoamạnh, lượng hoa xuất khẩu của Hàn Quốc lớn nhất khu vực Đông Bắc Á Theothống kê năm 2000, Hàn Quốc có 15.000 ha trồng hoa, giá trị sản lượng đạt 700triệu USD, gấp 8 lần năm 1989 Trong đó, Lily là loại cây có giá trị hiệu quả kinh

tế cao nhất trong các loại hoa

Ở Châu Phi, Kenia là nước sản xuất hoa chủ yếu và là nước xuất khẩu hoatươi lớn nhất châu lục này Hiện nay, Kenia có 3 vạn nông trường chủ yếu trồnghoa Phăng, Hoa Hồng, Hoa Lily Mỗi năm nước này xuất khẩu sang Châu Âu 65triệu USD, trong đó riêng Lily chiếm 35%

Ngoài ra một số nước khác cũng có lượng hoa Lily xuất khẩu và diện tíchtrồng hoa Lily tương đối cao như Đài Loan: năm 2001 có 490 ha trồng Lily,trong đó xuất khẩu đạt 7,4 triệu USD [5]

2.1.5.2 Tình hình sản xuất hoa Lily ở Việt Nam

Theo dự án sản xuất hoa thương mại, hoa Lily được xem là một trong 4 loạihoa quan trọng, được đưa vào nghiên cứu Tuy nhiên, ở nước ta diện tích trồnghoa Lily chiếm rất ít và tập trung chủ yếu ở Đà Lạt, Sa Pa, Hà Nội Tại Đà Lạt,hàng năm sản xuất được hàng triệu cành hoa cắt phục vụ cho nhu cầu trong nước

và xuất khẩu Lily là một trong những loại hoa đem lại hiệu quả kinh tế cao nhấtcho một số công ty hoa tại Đà Lạt Với lượng hoa sản xuất ra còn hết sức hạn chế

so với nhu cầu thị trường, nên việc mở rộng quy mô sản xuất hoa Lily là rất cầnthiết

Thực tế cho thấy ở nước ta, hoa Lily có giá trị kinh tế cao Trên thị trườnghiện nay đang bán phổ biến các loại hoa Lily với giá khá đắt so với các loại hoakhác và so với cả thu nhập của người Việt Nam (khoảng 20.000 - 30.000 đồng/cành) Vì vậy, nếu chúng ta chú trọng đầu tư và nhanh chóng mở rộng diện tích

trồng hoa Lily sẽ đem lại hiệu quả kinh tế cao, tăng thu nhập đáng kể cho ngườitrồng hoa, nâng cao mức sống giải quyết vấn đề việc làm cho người lao động.

2.1.6 Các phương pháp nhân giống hoa Lily

Để nhân giống hoa Lily thì có thể thực hiện theo con đường hữu tính và vôtính

2.1.6.1 Phương pháp nhân giống hoa Lily bằng con đường nhân giống hữu tính.

Nhân giống hữu tính là dùng hạt đã được thụ phấn để trồng Nhân giống

Lily bằng hạt được áp dụng trong thực tế trên vài loài như L.regale,

L.longiflorum, L.pumilum, L.henryi và L.martagon (Baardse, 1977) Ở Nhật Bản,

hoa cắt cành được sản xuất chủ yếu từ các hạt của L.longiflorum x L.formosarum vào thời điểm hè thu Hạt có thể nảy mầm trên mặt đất (L.regale, L.longiflorum,

L.pumilum, L.henryi, L.formosarum) hoặc nảy mầm dưới mặt đất (L.speciosum, L.martagon) (Hartmann và Kester, 1975) [1].

Nhân giống bằng phương pháp hữu tính có ưu điểm là có thể thu đượcnhiều hạt trong một thời gian ngắn từ một vài cây mẹ có chất lượng cao, đặc biệt

là ở chi Lilium thì virus không thể lây lan từ cây mẹ sang cây con bằng hạt Do

vậy, mức độ nhiễm virus của các cây nhân giống bằng hạt là khá thấp Tuy nhiên,

do cây nảy mầm từ hạt thường không đồng nhất và hay xuất hiện các biến dị ditruyền và mất nhiều thời gian, từ gieo hạt đến khi cây ra hoa có chất lượng tốtphải mất 3 - 4 năm, vì vậy phương pháp nhân giống này ít được ứng dụng.[1],[5]

2.1.6.2 Phương pháp nhân giống hoa Lily bằng con đường nhân giống vô tính.

a, Giâm vảy (cắm vảy)

Đây là phương pháp nhân giống cổ truyền Trên thân vảy (củ) của Lily có

rất nhiều vảy, mỗi vảy có thể sinh ra vài vảy nhỏ ở gốc, mỗi thân vảy nhỏ sẽ hình

thành một cơ thể mới

b, Nhân giống bằng cách tách củ

Tách củ là phương pháp nhân giống bằng cách tách củ con được sinh ra từ

củ mẹ Có thể trồng cây chuyên để nhân giống Cũng có thể kết hợp với sản xuấthoa vụ hè để nhân giống, nhưng do trong thời điểm này, khí hậu nóng nên chấtlượng củ loại này kém Mỗi củ mẹ đều có thể có 3 - 5 củ con tương đối lớn (chu

vi 5cm trở lên) và 4 - 8 củ nhỏ (chu vi 1 - 3cm) Những củ có chu vi 5cm trở lênđem trồng sau một vụ có thể thành củ nhỡ để sản xuất hoa (10cm trở lên), củ cóchu vi 1 - 3cm thì phải trồng hai vụ mới thành củ sản xuất hoa được

c, Nhân giống bằng mầm hạt

Có một số Lily nách lá có thể sinh ra nhiều mầm hạt màu đen tím Mầm hạt

là do một số vảy hợp lại, nó có thể ra rễ, ra lá; nếu hái xuống rồi trồng có thểthành cây con, cách trồng tương tự như trồng bằng hạt

Tóm lại, các phương pháp nhân giống trên có rất nhiều ưu điểm nhưng nếunhân giống liên tục nhiều năm thì virus tích luỹ lại và truyền từ thế hệ này sangthế hệ khác, làm hoa sinh trưởng, phát triển yếu, hoa nhỏ và hệ số nhân giốngchưa có thể đáp ứng nhu cầu trồng và sản xuất hoa Lily trong nước ta Đặc biệt làquy mô sản xuất công nghiệp đang phát triển mạnh Hiện nay, nếu phải nhập nội

củ giống từ Hà Lan, Hàn Quốc, Trung Quốc với giá thành 10.000 - 12.000đồng/củ thì chi phí bỏ ra cho sản xuất là rất cao Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

là phương pháp nhân giống mới hiện nay trên thế giới và rất mới ở Việt Nam,phương pháp này có thể khắc phục được các nhược điểm trên và đáp ứng đượcnhu cầu của sản xuất.[5]

2.1.7 Các kết quả nghiên cứu về nhân giống In vitro cây hoa Lily

sung các nguyên tố vi lượng (theo Heller) + vitamin (theo Morel) + 100mg/lInositol + 20g sacaroza +15g/l agar [12].

Năm 1994, Dương Tấn Nhựt đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa huệtây bằng phương pháp nuôi cấy vảy củ Vảy củ được khử trùng bằng HgCl2 0,2%trong thời gian 5 phút, sau đó cấy trên MS có bổ sung các thành phần vitamin,chất hữu cơ, và đường sacaroza Sau khi tạo được cây con có thể tiếp tục nhânbằng cách tách các vảy củ đã được tạo thành đem cấy vào môi trường nhân.[16].Năm 1995, Dương Tấn Nhựt cũng đã thành công trong nghiên cứu nhângiống hoa loa kèn bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được tách từ chồi phát triểnđến khi thân chính phân đốt thì tiến hành cắt thân chính thành nhiều đốt nhỏ vàtiến hành nhân nhanh

Năm 1996, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Nhẫn, Nguyễn Phương Thảo

đã nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitrio trên giống hoa Lily màu

tím mới nhập nội từ Pháp và đưa ra quy trình nhân giống kể từ khi đưa mẫu vàođến khi sản xuất ra củ giống.[18]

Năm 1997, Hoàng Minh Tấn và Cao Ngọc Thuý đã khẳng định hiệu quảkinh tế của việc xử lý nhiệt độ thấp cho củ hoa Lily Xử lý giống ở điều kiện 50Ctrong 20 ngày đã giúp cho củ nảy mầm trước 1 tháng và rút ngắn thời gian sinhtrưởng từ 193 xuống 114 ngày

Năm 2000, Dương Tấn Nhựt đã ứng dụng thành công kỹ thuật cắt lát mỏng

tế bào đoạn thân vào nuôi cấy in vitro giống hoa Lily L.longiflorum.

Năm 2001, Nguyễn Thị Nhân, Nguyễn Quang Thạch đã thành công trong

lĩnh vực nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống

Năm 2005, Nguyễn Thị Lý Anh; Nguyễn Thị Hương; Nguyễn Quang Thạch

đã nghiên cứu tạo củ Lily bằng in vitro và sự sinh trưởng của cây Lily trồng từ củ bằng phương pháp in vitro.[2]

Năm 2006, Cao Thị Huyền Trang, Dương Minh Nga nghiên cứu tạo củ trực

tiếp từ lát cắt vảy củ Lily in vitro [22].

Năm 2007, Dương Tấn Nhựt đứng đầu nhóm các nhà khoa học của Phânviện Công nghệ sinh học Đà Lạt thuộc Viện KH&CN Việt Nam cùng với Trường

ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh vừa nhân giống thànhcông cây hoa Lily bằng kỹ thuật nuôi cấy bioreactor

Qua đây, ta có thể thấy ở nước ta việc nghiên cứu nhân giống in vitro câyhoa Lily chủ yếu tập trung vào việc tạo củ in vitro từ vảy củ, còn phương pháptạo cây con in vitro từ vảy củ ít được đề cập đến

Niimi và Onozwa đã sử dụng lá để làm vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy tạocallus.[8]

Khi nuôi cấy chồi đỉnh giống hoa Lily (Lilium formllongihrot.R) trên môi

trường sử dụng các loại đường khác nhau: Sacaroza, glucoza, fructoza, vàSorbitol (30g/l) và nghiên cứu sự nảy mầm của củ Lily trên các môi trường đó,Matsui - K và cộng sự cho biết hiệu quả hình thành cây cao nhất đạt được 73,7%trên môi trường có chứa glucoza Ngoài ra hàm lượng đường sử dụng trong môitrường nuôi cấy còn liên quan chặt chẽ đến sự ngủ nghỉ của củ sau khi nuôi cấy.Theo Tapayma và Takashige (1982) nếu môi trường chứa 30g/l sacaroza, để phángủ nghỉ của củ cần xử lý nhiệt độ thấp khoảng 70 ngày Nếu hàm lượng đườnglên tới 90g/l thì cần đến 120 - 140 ngày để phá sự ngủ nghỉ của củ

Năm 1981, Van và Blom đã xác định được vai trò của BAP phối hợp với NAA trong sự tái sinh chồi Ngoài ra BAP cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng vàphát triển của chồi.

-Năm 1986, một số tác giả đã nghiên cứu quy trình nhân nhanh củ cây hoa

Lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường bổ sung axit Abcisic.

Kết quả cho thấy rằng axit Abcisic có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo, kích thíchquá trình hình thành củ và làm mập chồi

Năm 1993, Stanilova.M và Zagorska (Bungari) cũng khẳng định vảy củ lànguyên liệu tốt cho việc tái sinh chồi từ mô nuôi cấy trên môi trường MS có bổsung 0,5mg/l -NAA +0,1mg/l Kinetin tạo ra các giống cây trồng đồng đều vềchất lượng

Năm 1995, các nhà nghiên cứu người Mỹ Wicksemesinhe - E, Holcomb - E,Arteca - R đã tạo ra được mô sẹo từ mô lá non của Easter Lily khi nuôi cấy trênmôi trường MS có bổ sung B5 + 20g/l Gelrite trong điều kiện bóng tối hoặc cóchiếu sáng 16h/ngày ở nhiệt độ 250C Sau 3 tuần và được cấy chuyển sang môitrường 0,1ppm 2,4D + 0,5 ppm BAP thì các mô sẹo bắt đầu phát sinh các cơquan

Năm 1995, Verron và cộng sự đã thành công khi tiến hành nuôi cấy đoạnthân, chồi đỉnh, chồi nách của cây hoa Lily trên môi truờng MS có bổ sungvitamin và 0,1 - 10,7 ppm -NAA +1,3 - 8,0 ppm BAP = 30g/l glucoza

Năm 1997, Takayama và Misawa đã nghiên cứu khả năng tái sinh chồi Lilynuôi cấy từ cánh hoa Lily

Hà Lan là nước thành công nhiều trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro cây hoa

Lily trên môi trường đặc (agar), chồi phát triển mạnh, cho hệ số nhân chồi cao

Trong những năm 1986 - 1992 nguồn giống hoa Lily in vitro ở Hà Lan đã đạt gấp

10 lần so với các loại cây hoa khác như: hoa Cúc, Layơn

Hiện nay, Nhật Bản đã thành công trong việc tạo giống cây hoa Lily in vitro

bằng kỹ thuật di truyền (năm 1994, Miyoshi - H, Tanaka - I đã chuyển gen bằngphương pháp sốc điện vào tế bào của cây hoa Lily)

Ngoài lĩnh vực nuôi cấy in vitro, cũng có nhiều nghiên cứu khác trên câyhoa Lily của nhiều tác giả trong và ngoài nước như: Kéo dài thời gian bảo quảnhoá bằng chất kháng etylen (Swart, 1981), ngâm củ giống trong dung dịch khángetylen làm tăng chất lượng hoa (Vanmeeteren và Proft, 1982), phá ngủ cho củgiống bằng nhiệt độ (Nhật Bản, 1998) Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấplàm tăng khả năng phát triển và rút ngắn thời gian ra hoa (Nguyễn Quang Thạch

và cộng sự, 1986) Năm 1992, Nguyễn Mạnh Khải và cộng sự nghiên cứu làmtăng chiều cao cây và tăng số bông bằng cách tăng thời gian chiếu sáng và phun

GA3 nhiều lần lên cây hoa trái vụ Như vậy bằng cách tổng hợp các biện phápvật lý, hóa học cho củ giống và trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây ta

có thể điều khiển sự ra hoa trái vụ hoa Lily Ở Việt Nam, Bộ môn Sinh lý - Khoahọc Nông học - Trường ĐH nông nghiệp I đã thành công trong tạo hoa Lily trái

vụ, được ứng dụng trong sản xuất, cho phép cung cấp hoa Lily vào các dịp tết, lễ

mà trước đó chưa hề có ở miền Bắc Việt Nam

Trong lĩnh vực chọn giống, mục tiêu nghiện cứu hiện nay đối với hoa Lily

là chọn tạo được các giống mới mang các đặc tính chống chịu bệnh (các bệnhnấm (Fusarium oxysporum, Pythium) và virus), các tính trạng chất lượng (hoa cótuổi thọ kéo dài, có khả năng mọc mầm tốt), lai khác loài và biến nạp gen Ngoài

ra, hệ thống các marker phân tử cũng được phát triển nhằm phát hiện các marker

di truyền liên kết với các đặc tính kháng bệnh, nấm, virus và góp phần xâydựng bản đồ di truyền của cây hoa Lily (van Tuyl và CS, 1996) Các nghiên cứu

về hệ thống thụ phấn in vitro, cứu phôi cũng đã nghiên cứu ứng dụng nhằm khắc

phục các hạn chế của kỹ thuật lai khác loài, từ đó tạo ra một loạt các nhóm hoaLily mới hiện nay

Tóm lại, tình hình nghiên cứu hoa Lily đã được thực hiện ở nhiều nước trênthế giới cũng như ở nước ta Việc nghiên cứu nhân giống hoa Lily đã được thựchiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như: nuôi cấy mô tế bào, chuyển gen,biến nạp di truyền và đã mang lại những kết quả thành công góp phần ứng dụngvào thực tiễn sản xuất hoa Lily nhằm phục vụ cho nhu cầu thị trường

2.2 Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật - Ứng dụng của nuôi cấy

mô, tế bào thực vật trong công tác giống cây trồng

2.2.1 Khái niệm chung về nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Nuôi cấy mô, tế bào thực vật hay nhân giống vô tính in vitro là các phương

thức nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xácđịnh ở điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau Mội trường có chứa cácchất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng, vitamin, các hoocmon tăng trưởng

và đường

2.2.2 Lịch sử phát triển của nuôi cấy mô, tế bào thực vật.

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã trải qua hơn một trăm năm pháttriển Có thể chia quá trình phát triển thành 4 giai đoạn: [24]

a, Giai đoạn khởi xướng (1898 - 1930)

Bắt đầu từ những thí nghiệm đầu tiên của Haberlandt (1898) khi ông đềxướng ra tính toàn năng của tế bào và tìm cách nuôi cấy tế bào phân lập từ tầng

tế bào lược, tế bào tầng nhu mô, tầng biểu bì và lông hút của thực vật để chứngminh cho luận điểm của ông, nhưng ông đã không thành công Vì ông đã táchnhững mô đã qua chuyên hoá hoàn toàn vào môi trường dinh dưỡng quá đơngiản

Winkler (1902, Thielman (1924), Kuster (1928) cũng đã tiến hành tương tựnhư ông nhưng không nhận được tế bào phân chia nào Winkler đã có nhữngquan sát rất tinh tế Ông nhận thấy: tế bào noãn trương lên khi hạt phấn nảy mầm

và đề nghị nuôi tế bào phân lập cùng với ống phấn trong một giá treo để bắt ốngphấn kích thích tế bào dinh dưỡng phân chia Ngoài ra ông còn đề nghị bổ sungvào môi trường dinh dưỡng dịch chiết từ các mô dinh dưỡng khác, ví dụ như dịchlấy từ túi phôi và ông tin rằng bằng con đường đó có thể nuôi thành công một tếbào dinh dưỡng phân lập thành phôi

Phải đến năm 30 của thế kỷ XX người ta mới đạt được những tiến bộ thực

sự Schmucker (1929), Schettrer (1931), Pfeifer (1931), Larue (1933) đã thànhcông trong việc nuôi cấy mô tế bào tực vật từ đầu rễ tách rời của cây hoà thảo

trên môi trường dinh dưỡng gồm có đường glucoza và muối khoáng Đây là tiến

bộ đánh dấu một giai đoạn phát triển mới

b, Giai đoạn nghiên cứu sinh lý (1930 - 1950)

Năm 1934, White đã thành công khi nuôi cấy rễ cà chua Tế bào của mônuôi cấy đã sinh trưởng và phân chia liên tục trong 4 tháng trên môi trường lỏng

có chứa muối khoáng, glucoza, và dịch chiết nấm men

Cùng năm đó, Gauthret thông báo thành công trong việc nuôi cấy mô tách

từ tượng tầng của cây Salix apraea và cây Populus nigra Mô nuôi cấy đã liên

tục phân chia trong nhiều tháng trên môi trường Knop bổ sung glucoza vàcysteinhyochloride

Trong thời kỳ này, Went và Thiman (1937) đã phát hiện ra IAA (Indoaxeticaxit) là một auxin tồn tại trong tự nhiên trong cơ thể thực vật IAA được côngnhận là một hoocmon thực vật, có chức năng như một chất điều khiển sinhtrưởng tác động lên quá trình phân chia tế bào và hình thành rễ Gautheret đã sửdụng IAA vào môi trường nuôi cấy, kết quả thu được mới chỉ hạn chế ở mô

tượng tầng của cây Salix.

Năm 1938, Nobecout nhận được phân bào ở mô củ cà rốt Daucus carota.

White nuôi cấy mô tượng tầng của cây thuốc lá lai

Thành công quan trọng của thời kỳ này là đã xây dựng và sử dụng có kếtquả một số loại môi trường bán nhân tạo, đồng thời phát hiện được vai trò củamột số vitamin đảm bảo sự thành công đối với việc nuôi cấy cơ quan (rễ) và mô(tượng tầng) ở thực vật

c, Giai đoạn nghiên cứu phát triển hình thái (1950 -1960).

Đại diện cho giai đoạn này là: Miler, Skoog, Steward, Reinet

Năm 1949, Camus đã ghép chồi trên mô nuôi cấy và quá trình phân hoá ốngmạch trong khối mô Đây là tiền đề để nghiên cứu về sự điều khiển quá trìnhphân hoá trong mô nuôi cấy

Tiếp theo là công trình của Miler và Skoog (1956) tạo chồi thành công từ

mô thuốc lá nuôi cấy

Trong giai đoạn này, Skoog đã phát hiện ra Kinetin là một chất điều khiểnquá trình phân bào (thuộc nhóm Cytokinin) và phân hoá mầm chồi.

Năm 1958 - 1959, Steward và Retnet đã sử dụng nước dừa (có chứa cácchất thuộc nhóm Cytokinin) vào nuôi cấy tế bào cà rốt và đã thu được phôi từnuôi cấy tế bào cà rốt

Năm 1960, Bergmann đã phát triển kỹ thuật tế bào đơn lên một bước mớitạo được khối mô sẹo từ một tế bào đơn bằng kỹ thuật gieo trải tế bào thực vậttrên đĩa thạch như trải tế bào vi sinh vật Và ông đã tái sinh được cây thuốc láhoàn chỉnh từ một tế bào đơn

d, Giai đoạn nghiên cứu di truyền (1960 - nay)

Năm 1960, Cooking tách được tế bào trần Protoplast

Năm 1964, Guha và Mahesawari tạo được cây cà độc dược (Datura

innoxia) có bộ nhiễm sắc thể đơn bội từ nuôi cấy bao phấn.

Nisch (1967), Nakata (1968) tạo được cây đơn bội từ bao phấn cây thuốc lá.Năm 1968, Niieki và Ono nuôi cấy thành công bao phấn và tạo được cây

đơn bội từ lúa (Oryza sativa).

Năm 1971, Takebe tái sinh được cây thuốc lá hoàn chỉnh protoplast thuốc lá

về an toàn sinh học của các nước đang còn khác nhau Vì thế việc đưa cây trồngmang gen biến nạp vào sản xuất đại trà còn phụ thuộc vào trình độ khoa học vàchính sách của từng nước

2.2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào

a, Tính toàn năng của tế bào

Năm 1902, Haberlandt (Đức) là người đầu tiên đề xướng học thuyết về tínhtoàn năng của tế bào (topipotency) trong cuốn sách "Thực nghiệm về nuôi cấy

mô tế bào tách rời" [21] Theo ông: "Mỗi tế bào của một cơ thể đa bào đều mangtrong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh

Vì vậy khi đặt tế bào vào trong điều kiện thuận lợi, nó có thể phát triển thành một

cơ thể."[8] Tính toàn năng cho phép từ những cơ quan, bộ phận của cơ thể có thểtái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ

b, Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào thực vật

Cơ thể sinh vật trưởng thành gồm nhiều cơ quan có nhiều chức năng khácnhau được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Nhưng tất cả các loại tế bào

đó đều bắt nguồn từ một tế bào ban đầu (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bàohợp tử phân chia thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng chuyên biệt(chuyên hoá) Sau đó, từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổithành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan có chức năng khácnhau

Sự phân hoá (diffrentation) của tế bào thực vật là sự chuyển hoá các tế bàophôi sinh thành các tế bào mô chuyên hoá để đảm nhận các chức năng sinh lýkhác nhau.[8]

Tuy nhiên khi các tế bào đã phân hoá thành các tế bào có chức năng chuyênbiệt, chúng không hoàn toàn mất đi khả năng biến đổi của mình Trong trườnghợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng có thể về dạng tế bào phôi sinh vàphân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là quá trình phản phân hoá(dediffrentation), ngược lại với quá trình phân hoá tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là kết quảcủa quá trình phân hoá và phản phân hóa tế bào dựa trên tính toàn năng của tếbào thực vật.[1], [21]

2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

a, Vật liệu nuôi cấy

Cơ thể thực vật đa bào có tính toàn năng nghĩa là có khả năng phân hóa vàkhả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quan trong môitrường dinh dưỡng nhân tạo thích hợp Do vậy, về nguyên tắc bất kỳ một bộ phậnnào của cây cũng có thể sử dụng làm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực rễ,các tổ chức phôi non, phôi đã trưởng thành hoặc các mô sẹo, các tế bào đơn, tếbào trần

Tuy nhiên khả năng này phụ thuộc vào từng loài Có loài dễ tái sinh từ mônuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá, những cũng có những loài rất khó táisinh như trầm hương Thông thường các bộ phận khác nhau của cây khi nuôicấy sẽ cho kết quả khác nhau [9], [10] Như vậy việc lựa chọn vật liệu nuôi cấyban đầu rất quan trọng, lựa chọn vật liêu nuôi cấy phụ thuộc vào giống, loài, tuổimẫu, vị trí, kích thước mẫu, mùa lấy mẫu trong năm và mục tiêu nuôi cấy (Nhựt

et al., 2003) [9], [1]

Đối với Lily, Nguyễn Xuân Linh đã tổng kết tất cả các nghiên cứu và khẳngđịnh rằng có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau như vảy củ, đoạn thân, cuốnghoa, nhị hoa, nhụy, cánh hoa, để tạo vật liệu khởi đầu Nhưng qua quá trìnhquan sát đánh giá thì vảy củ là bộ phận tốt nhất, cho hiệu quả cao nhất trong việctạo vật liệu khởi đầu [11]

b, Môi trường nuôi cấy

Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng vì vậy

để cho mô tồn tại và phân hoá thì trong các giai đoạn nuôi cấy phải tạo ra đượcmôi trường nuôi cấy có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho mô nuôi cấy.Cho đến nay, đã có nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra: Môi trườngMurashige và Skoog (1962) viết tắc là MS, môi trường Linsmainer và Skoog(1963), môi trường Gamborg (1968), môi trường Knop (1974) Đây là những

môi trường cơ bản và sẽ được cãi biến ra nhiều loại môi trường khác nhau chophù hợp với mỗi đối tượng nghiên cứu và mục đích thí nghiệm Trong số đó, môitrường MS được đánh giá là phù hợp nhất cho đa số các loài thực vật (Smith vàGould) và chính Murashige (1974) đã dùng môi trường này để nuôi cấy nhiềuloại cây trồng [10], [23].

Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào thay đổi tuỳ theo từng loại thựcvật, loại tế bào, mô, cơ quan được nuôi cấy, các giai đoạn sinh trưởng, phát triểncủa mẫu cấy, cũng như mục đích nuôi cấy Tuy nhiên môi trường nuôi cấy mô tếbào thực vật đặc trưng đều chứa các thành phần sau:

- Các nguyên tố đa lượng (gồm muối nitơ, phốt pho, magie, canxi, kali,

lưu huỳnh): là thành phần không thể thiếu được vì chúng tham gia cấu thành các

cơ quan tử trong cơ thể thực vật (Anderson, 1980) [21]

- Các nguyên tố vi lượng (muối sắt, kẽm, đồng, mangan, coban, molipden,

bo, iôt) Các nguyên tố này tuy có hàm lượng thấp nhưng có vai trò quan trọngtrong việc thúc đẩy sự phát triển của thực vật ở giai đoạn xuân hóa (Lê Văn Chi,1992), ngoài ra nó còn là thành phần của enzym xúc tác cho các phản ứng sinhhoá trong cơ thể [21] Ví dụ thiếu sắt tế bào mất khả năng phân chia; thiếumangan thì phân bào kém; thiếu bo gây thừa auxin làm mô nuôi cấy có biểu hiện

mô sẹo hoá mạnh nhưng lại xốp, mọng nước và tái sinh kém; molipđen tác độngtrực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật [3]

- Nguồn cacbon: Khi nuôi cấy in vitro thì các tế bào thực vật không có khả

năng quang hợp và do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon để tạo năng lượngcho các quá trình sinh lý, sinh hoá diễn ra bình thường trong tế bào Đườngsucrose là nguồn cacbon tốt nhất thường được sử dụng với nồng độ là 2 - 3%ngoài ra glucose cũng là nguồn cacbon rất tốt Ở một số mô có thể dùng mantose,fructose và glactose Đường có thể bị caramen hoá nếu bị hấp khử trùng quá lâu(Peer, 1971 và Ball, 1953) và sẽ ức chế phản ứng với các hợp chất melanoidin,một chất sẫm màu có phân tử lượng cao, ức chế sự phát triển của tế bào [10]

- Các vitamin: Mô và tế bào nuôi cấy tuy có tổng hợp được vitamin nhưng

không đủ nên thường phải bổ sung vitamin vào môi trường nuôi cấy chủ yếu là:thiamin (B1) đóng vai trò quan trọng trong quá trình biến đổi cacbon và tham giavào thành phần tổ hợp enzym xúc tác quá trình oxi hoá khử cacbon ở axit hữu cơ;axit nicotinic (B3) đi vào các thành phần các enzym oxi hoá khử dehydrogennasexúc tác việc tách hydro ra khỏi các axit hữu cơ; pyridoxin (B6) tham gia vàothành phần các enzym khử cacbon và thay đổi vị trí nhóm amin trong các axitamin; myo - insitol giúp cải thiện sự tăng trưởng của mô, có vai trò trong sinhtổng hợp thành tế bào Vitamin rất nhạy cảm với sự tăng trưởng của mô nuôi cấy,vitamin được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sinh tổnghợp tế bào [3], [21]

- Các chất có nguồn gốc tự nhiên phức tạp: nước dừa, dịch chiết chuối,

dịch chiết cà chua, dịch chiết nấm men, dịch thuỷ phân cazein cũng được sử

dụng trong nuôi cấy in vitro vì thành phần của chúng có nhiều chất thúc đẩy tăng

trưởng tế bào và mô nuôi cấy Năm 1941, Overbeek đã chứng minh nước dừa cókhả năng kích thích sự phân chia và phân hoá tế bào (Đỗ Năng Vịnh, 2003) [21].Theo Tukele và cộng sự (1981) nước dừa bổ sung vào môi trường các loạiđường, protein, các axit hữu cơ, các axit amin các chất kích thích sinh trưởng(cytokinin ), các vitamin (insitol) và các chất quan trọng khác có tác dụng tốttrong tăng trưởng của mô [23]

- Các chất làm rắn môi trường: agar là một polysaccarit thu được từ một

số tảo thuộc ngành tảo đỏ Agar được sử dụng để làm rắn môi trường, tạo giá thểnâng đỡ cây Tuỳ đặc điểm nuôi cấy và chất lượng agar mà nồng độ sử dụng thayđổi từ 0,8 - 1,0% Nếu sử dụng với nồng độ quá cao sẽ làm môi trường quá cứng

và ảnh hưởng tới sự khuyếch tán cũng như hấp thu dinh dưỡng của mô, tế bào(Collin, 1998; Bhojwani & Razan,1983) [1] Nếu như agar không tinh sạch thì nó

có thể làm đục màu môi trường do các chất cặn trong agar gây nên Agar có thểảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm (Griffis et al., 1991;Debergh,1983; Halquist et

al., 1983) bởi vì agar là một sản phẩm lấy từ tảo biển, nó có thể có những tácđộng sinh lý trên mô thực vật Ngoài agar ra một số hợp chất khác cũng đã đượcthử nghiệm thành công để làm rắn môi trường như Gerlit (là một polysaccarittinh và trong suốt được hình thành trong quá trình lên men của Pseudomonas(Kang et al., 1982) [23].

- Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật: (phytohormon) là thành phần

quan trọng bậc nhất của môi trường nuôi cấy Nhờ những chất này các nhà

nghiên cứu có thể chủ động điều chỉnh quá trình phát sinh hình thái thực vật in

vitro Trong nuôi cấy mô tế bào hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng được sử

dụng rộng rãi là auxin và cytokinin:

* Auxin là chất điều khiển sinh trưởng do Went và Thimann phát hiện

(1937) chủ yếu kích thích sinh trưởng tế bào làm tăng phân bào, gây hiện tượng

ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ [3], [13] Nhóm auxin bao gồm IAA,IBA, -NAA, 2,4-D có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp (kích thích ra rễ), ở liềulượng cao auxin sẽ phát động sự tạo mô sẹo và thường gây nên các đột biến [21],[23] 2,4-D thường được sử dụng rộng rãi trong việc phát sinh mô sẹo; IAA, IBA,

-NAA thường được sử dụng cho việc phát sinh rễ [10]

* Cytokinin là nhóm các phytohoocmon dẫn xuất của adenin nó liên quan

chặt chẽ đến quá trình phân bào, kích thích phân hoá chồi từ mô cấy Cáccytokinin thường dùng trong nuôi cấy là kinetin, BA, zeatin và 2iP (Miller và

Skoog, 1953; Campbell, Mitchell, Reece, 1980), chồi nhiều nhưng có kích thước

nhỏ [10], có thể gây ra hiện tượng mọng nước (thuỷ tinh thể và kìm hãm sự tạo rễ[21] Theo Skoog và Miller tỷ lệ auxin/cytokinin cao thường có xu thế kích thíchquá trình tạo rễ bất định, kéo dài chồi, ngược lại tỷ lệ trên thấp thì sẽ đẩy mạnhbiệt hoá chồi và ức chế sự phát triển của chồi nếu tỷ lệ trung bình thì mô sẹo sẽđược hình thành [23]

Ngoài ra trong nuôi cấy mô tế bào người ta còn sử dụng nhómphytohoocmon khác là GA (Gibberellic axit) Gibberelin điển hình là Ga3 có tác