- Nhiệt độ: Theo nghiên cứu của Murashige vào năm 1947, nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất trong mô cấy, ảnh
3.Nội dung và phương pháp nghiên cứu 1 Môi trường nuôi cấy
3.1. Môi trường nuôi cấy
- Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đều sử dụng môi trường dinh dưỡng khoáng cơ bản MS (Murashige and Skoog, 1962) bổ sung đường, agar và các chất điều hoà sinh trưởng.
- pH môi trường: 5,8
- Môi trường được khử trùng trong nồi khử trùng (autoclave) ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút.
3.2. Điều kiện nuôi cấy
Các thí nghiệm đều được thực hiện trong điều kiện nhân tạo. - Nhiệt độ: 25oC ± 2oC
- Cường độ ánh sáng: 2000 lux, sử dụng bóng đèn huỳnh quang. - Thời gian chiếu sáng: tùy thuộc vào từng thí nghiệm.
3.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu
Củ giống Lilium aziatische “Birthday” được được tách riêng từng vảy và rửa sạch bằng xà phòng loãng, sau đó rửa thật sạch dưới vòi nước chảy, cuối cùng rửa lại bằng nước cất trước khi đưa vào tủ cấy vô trùng để tiến hành khử trùng. Các bước tiến hành khử trùng như sau:
- Khử trùng bằng cồn 700C trong 30 giây.
- Khử trùng bằng dung dịch NaOCl, tỷ lệ 1NaOCl: 2H2O với thời gian khử trùng: 8 phút, 10 phút, 12 phút, 14 phút, 16 phút. Sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần.
- Vảy củ đã được khử trùng được cắt bỏ những phần thâm đen do nhiễm chất khử trùng, sau đó cấy vào môi trường nuôi cấy.
- Kết quả được ghi lại sau 1 tuần nuôi cấy dựa vào chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu sống sạch bệnh, tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu chết.
Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ chiếu sáng đến khả năng tạo củ từ vảy củ.
Các vảy củ đã được khử trùng và đảm bảo sống sạch bệnh được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm này. Các vảy củ này được cấy vào môi trường dinh dưỡng và nuôi trong các điều kiện chiếu sáng khác nhau:
- Tối hoàn toàn. - Chiếu sáng 8h/ngày. - Chiếu sáng 12h/ngày. - Chiếu sáng 16h/ngày.
Các công thức thí nghiệm được tiến hành trên 5 bình, mỗi bình 5 vảy được lặp lại 3 lần.
- Kết quả được ghi lại sau 8 tuần nuôi cấy dựa vào chỉ tiêu: thời gian xuất hiện củ, đặc điểm củ.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự hình thành củ từ nuôi cấy vảy củ.
Các vảy củ đã được khử trùng và đảm bảo sống sạch bệnh được sử dụng làm vật liệu cho thí nghiệm này. Các vảy củ này được cấy vào môi trường dinh dưỡng cơ bản bổ sung đường saccharose với các nồng độ khác nhau: 30g/l – 60g/l – 90g/l – 120g/l.
- Các công thức thí nghiệm được tiến hành trên 5 bình, mỗi bình 5 vảy được lặp lại 3 lần.
- Kết quả được ghi lại sau 8 tuần nuôi cấy dựa vào chỉ tiêu: tỷ lệ phát sinh củ.
Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ lát cắt vảy củ.
Các vảy củ đã được khử trùng và đảm bảo sống sạch bệnh được sử dụng làm vật liệu khởi đầu cho thí nghiệm này. Các vảy củ được cắt thành những lát mỏng có kích thước 2 – 3mm tuỳ theo dạng vảy củ và được đặt vào môi trường
tạo cụm chồi. Sau đó, được đặt trong điều kiện hoàn toàn tối một tuần rồi đưa ra sáng.
Môi trường nuôi cấy bổ sung thêm BAP với các nồng độ: 0,1mg/l – 0,3mg/l – 0,5mg/l – 0,7mg/l - 1mg/l. Công thức đối chứng không bổ sung BAP.
Các công thức thí nghiệm được tiến hành trên 5 bình, mỗi bình 5 vảy được lặp lại 3 lần.
Kết quả được ghi lại sau 4 tuần nuôi cấy dựa vào chỉ tiêu: hệ số nhân chồi, thời gian xuất hiện chồi đầu tiên.
Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân nhanh.
Các chồi của thí nghiệm 4 được cắt bỏ lá, tách chồi và cấy vào môi trường nhân nhanh MS bổ sung α–NAA với các nồng độ: 0,05mg/l – 0,07mg/l – 0,1mg/l và nồng độ BAP tối ưu như đã khảo sát ở thí nghiệm trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Các công thức thí nghiệm được tiến hành trên 5 bình, mỗi bình 5 vảy được lặp lại 3 lần.
- Kết quả được ghi lại sau 4 tuần nuôi cấy dựa vào chỉ tiêu: hệ số nhân chồi, chiều dài, số lá/chồi.
3.4. Xử lý số liệu
Các số liệu được xử lý trên phần mềm Microsoft Excel và Statictis for window.
Phần bốn