tóm tắt Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B trên màng tế bào hồng cầu người

Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN QUỐC KHÁNH TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN QUỐC KHÁNH TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ TRUNG TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG Hà Nội – 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Trung, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn suốt thời gian học tập thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Đình Thắng (Bộ môn sinh lý thực vật hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, đặc biệt thầy giáo, cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy dìu dắt thời gian thực luận văn suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị, bạn làm việc Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ bảo suốt trình học tập thực luận văn phòng Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ động viên suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Trần Quốc Khánh Footer Page of 126 iii Header Page of 126 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Máu hệ thống nhóm máu người 1.2 Truyền máu nguyên tắc truyền máu 1.3 Kháng thể đơn dòng 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Vai trò ứng dụng kháng thể đơn dòng 11 1.3.3 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 14 1.3.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng Việt Nam 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 19 2.1.2 Sinh phẩm 19 2.1.3 Máy móc thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Gây miễn dịch đánh giá khả đáp ứng miễn dịch 20 2.2.1.2 Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch 23 2.2.2 Chuẩn bị tế bào 23 2.2.3 Nuôi cấy tế bào myeloma 24 2.2.4 Dung hợp tạo dòng tế bào lai 24 2.2.5 Sàng lọc tế bào lai 26 2.2.6 Tách dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B 27 2.2.7 Đánh giá tốc độ sinh trưởng sản xuất kháng thể tế bào lai 28 2.2.8 Phương pháp đếm tế bào lai (xác định số lượng tế bào sống) 29 2.2.9 Xác định loại globulin miễn dịch kiểm tra tính đơn dòng tế bào lai 29 Footer Page of 126 iv Header Page of 126 2.2.10 Đánh giá kháng thể tế bào lai sản xuất 31 2.2.11 Cô đặc kháng thể ammonium sulfate 32 2.2.12 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu B 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột 35 3.1.1 Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột 35 3.1.2 Cách thức gây miễn dịch cho chuột 35 3.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai myeloma tế bào lympho B chuột 37 3.2.1 Nuôi cấy tế bào đại thực bào để tạo lớp tế bào 37 3.2.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mang kháng nguyên B 38 3.2.2.1 Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn lách chuột gây miễn dịch hồng cầu B 38 3.2.2.2 Dung hợp tế bào myeloma sp2/0 hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B tách từ chuột gây miễn dịch hồng cầu mẫu B 39 3.2.2.3 Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B 41 3.2.2.4 Khả sinh trưởng tế bào B4D10C9 42 3.2.2.5 Khả sản xuất mAb kháng kháng nguyên B dòng tế bào lai B4D10C9 43 Footer Page of 126 3.2.2.6 Xác định độ đặc hiệu mAb B4D10C9 sản xuất 44 3.2.2.7 Cường độ tính mAb B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B 44 3.2.2.8 Xác định phân lớp mAb dòng tế bào B4D10C9 sinh 45 3.2.2.9 Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 47 3.2.2.10 Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 v Header Page of 126 DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Các nhóm máu hệ ABO người 06 Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết phương pháp huyết mẫu 09 Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết phương pháp hồng cầu mẫu 10 Bảng 3.1 Biến động hiệu giá kháng thể trung bình gây miễn dịch 35 theo đường khác Bảng 3.2 Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách hạch bẹn chuột gây miễn dịch hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma sp2/0 37 Bảng 3.3 Số giếng chứa tế bào lai tiết kháng thể gây ngưng kết hồng cầu 40 mẫu B Footer Page of 126 vi Header Page of 126 DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Kháng nguyên nhóm máu người Hình 1.2 Cấu tạo chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hình 1.3 Sơ đồ truyền máu Hình 1.4 Kháng thể đơn dòng liên kết với epitope đặc hiệu 11 Hình 1.5 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 13 Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột 22 Hình 2.2 Gây miễn dịch cho chuột cách tiêm vào hai gan bàn chân chuột 22 Hình 2.3 Cách đọc kết của phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa 96 đáy chữ V 27 Hình 2.4 Sơ đồ pha loãng tới hạn 28 Hình 2.5 Vị trí ô đếm buồng đếm tế bào 29 Hình 2.6 Cách đọc kết đĩa elisa kit Pierce® Rapid ELISA mouse mAb 31 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào đại thực bào nuôi cấy tĩnh 38 Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào lai quan sát kính hiển vi soi ngược (độ phóng đại 1000 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x) 40 Hình 3.3 Minh họa giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A O 41 Hình 3.4 Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu mẫu B 42 Hình 3.5 Hiệu giá kháng thể dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết hồng cầu B 42 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng môi trường DMEM +10% FBS DMEM+1% FBS 43 Footer Page of 126 vii Header Page of 126 theo thời gian Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 môi trường DMEM+1%FBS DMEM+10% FBS 44 Hình 3.8 Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B mAb tế bào lai B4D10C9 sinh 45 Hình 3.9 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến kính xác định tính mAb dòng tế B4D10C9 sinh với hồng cầu mẫu B 45 Hình 3.10 Phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể dòng tế bào B4D10C9 sản xuất 46 Hình 3.11 Dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trước sau tủa 47 ammonium sulphate Hình 3.12 Cường độ phản ứng kháng thể kháng B trước sau 48 tủa Hình 3.13 Phản ứng ngưng kết hồng cầu kháng thể kháng B thu 48 sau tủa ammonium sulphate Hình 3.14 Kháng thể kháng B (anti-B) hoàn nguyên dung 50 dịch hoàn nguyên màu vàng A dung dịch chứa kháng thể B (anti-B); B dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B Hình 3.15 A Phản ứng ngưng kết sinh phẩm B với hồng cầu mẫu A, B O; B Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B Footer Page of 126 viii 50 Header Page of 126 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt anti-A anti-AB anti-B Tên đầy đủ Anti-A antibody Anti-AB antibody Anti-B antibody Tên tiếng việt Kháng thể kháng A Kháng thể kháng AB Kháng thể kháng B BSA DMEM Bovine serum albumin Dulbecco's Modified Eagle's Medium Albumin huyết bò Môi trường Dulbecco biến đổi DMSO E coli EBV Dimethyl sulfoxide Escherichia coli Epstein – Barr virus Virus Epstein-Barr EDTA ELISA Ethylene diamine tetraacetic acid enzyme-linked immunosorbent assays Fragment antigen-binding Mảnh Fetal Bovine Serum Freund’s complete adjuvant Food and Drug Administration nguyên Huyết bê Tá chất hoàn toàn Cục quản lý Thực phẩm Fab FBS FCA FDA FIA HAT Freund’s incomplete adjuvant hypoxanthyl aminoteptrin liên kết kháng Dược phẩm Hoa Kỳ Tá chất không hoàn toàn HT thymidine hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase hypoxanthyl thymidine mARN PBS PEG Messenger RNA Phosphate buffered saline polyethylene glycol ARN thông tin Đệm muối phosphate RPMI Roswell Park Memorial Institute medium World Health Organisation Môi trường RPMI HGPRT WHO Footer Page of 126 ix Tổ chức y tế giới Header Page 10 of 126 MỞ ĐẦU Máu thành phần vô quý giá điều trị bệnh mà chưa có sinh phẩm thay được, đặc biệt máu sử dụng điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp ghép tạng, mổ tim, lọc máu thận Tuy nhiên, việc sử dụng máu điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, có ngưng kết kháng nguyên màng hồng cầu người cho với kháng thể huyết người nhận Để trình truyền máu thành công phải có tương thích máu người cho người nhận Do đó, trước truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế thống kê có 35 hệ nhóm máu với 300 kháng nguyên nhóm máu khác Hầu hết kháng nguyên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu dùng để nghiên cứu di truyền quan hệ huyết thống, có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây phản ứng ngưng kết truyền máu dẫn đến tai biến kháng nguyên A, B hệ nhóm máu ABO kháng nguyên D hệ nhóm máu Rh Các nhóm máu nêu xác định phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu huyết mẫu Huyết mẫu kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có loại huyết mẫu anti-A, anti-B, anti-AB sử dụng xác định nhóm máu hệ ABO huyết mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ Rh Nhiều phương pháp phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng công nghệ lai tế bào, công nghệ tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene Phương pháp lai tế bào ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có chất kháng thể đơn dòng sản xuất thành công Blood Grouping (Prestige Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad) Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu điều trị bệnh ngày lớn việc sử dụng huyết mẫu gia tăng Tuy nhiên, Việt Nam chưa sản xuất kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu Footer Page 10 of 126 Header Page 16 of 126 Hình 1.2 Cấu tạo chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO (RBC – tế bào hồng cầu, GLU – Glucose, GAL – Galactose/Glucosamine, FUC – Fructose, NAc – N-Acetyl) Hệ miễn dịch có tượng chống lại kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân hồng cầu Người nhóm máu A có kháng nguyên A hồng cầu mà kháng nguyên B có kháng thể kháng kháng nguyên B huyết Người nhóm máu B có kháng nguyên B màng hồng cầu kháng thể kháng A huyết Người nhóm máu AB có kháng nguyên A B màng hồng cầu kháng thể kháng A kháng thể kháng B huyết Còn người có nhóm máu O huyết có kháng thể kháng A kháng B màng hồng cầu thiếu hai kháng nguyên A B [11] 1.2 Truyền máu nguyên tắc truyền máu 1.2.1 Nguyên tắc truyền máu Truyền máu trình đưa thành phần máu vào tĩnh mạch người khác Trước đây, sử dụng máu toàn phần để truyền máu thành phần máu truyền trường hợp khác nhau, hồng cầu sử dụng để tăng khả vận chuyển oxy máu, tránh mệt mỏi biến chứng khác Truyền máu khoảng 1-4 phụ thuộc vào thành phần thể tích máu truyền Hầu hết truyền máu thực bệnh viện thực nơi cần thiết Trong hầu hết trường hợp, máu có nguồn gốc từ tình nguyện viên sàng lọc huyết bệnh nhiễm trùng: HIV, HCV, HBV, giang mai, sốt rét [12] Màng tế bào hồng cầu chứa hàng triệu kháng nguyên tự thân, Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 bỏ qua hệ thống miễn dịch Tuy nhiên, trình truyền máu, kháng thể nhóm máu có huyết tương người nhận công tế bào hồng cầu cho mang kháng nguyên khác với kháng nguyên tự thân sau phá hủy hồng cầu gây phản ứng tan máu cấp tính Do đó, xác định tương thích nhóm máu người cho người nhận tương tích nhóm máu người cho người nhận cần thiết để truyền máu an toàn [13] Dựa vào có mặt kháng nguyên bề mặt hồng cầu (A B) kháng thể huyết (anti-A anti-B) trình truyền máu thực theo nguyên tắc sau [15] - Người nhóm máu A có kháng nguyên A hồng cầu mà kháng nguyên B, có kháng thể kháng kháng nguyên B huyết thanh, truyền máu cho người có nhóm máu A AB - Người nhóm máu B có kháng nguyên B màng hồng cầu kháng thể kháng A huyết thanh, truyền máu cho người có nhóm máu B AB - Người nhóm máu AB có kháng nguyên A B màng hồng cầu kháng thể kháng A kháng thể kháng B huyết thanh, truyền máu cho người có nhóm máu AB Người có nhóm máu O huyết có kháng thể kháng A kháng B màng hồng cầu thiếu hai kháng nguyên A B truyền máu cho tất nhóm máu Hình 1.3 Sơ đồ truyền máu Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 1.2.2 Phương pháp xác định nhóm máu hệ ABO Nhóm máu hệ ABO xác định phương pháp huyết mẫu phương pháp hồng cầu mẫu Theo thông tư Bộ Y tế (2013) để kết luận nhóm máu thuộc hệ ABO mẫu máu phải định nhóm hai phương pháp: phương pháp huyết mẫu phương pháp hồng cầu mẫu Phương pháp huyết mẫu dùng huyết biết trước kháng thể cho phản ứng với hồng cầu bệnh nhận để xác định có mặt kháng nguyên bề mặt hồng cầu từ xác định kiểu nhóm máu bệnh nhân Các mẫu huyết dùng để xác định nhóm máu hệ ABO bao gồm: huyết mẫu antiA, anti-B anti-AB Cách xác định nhóm máu thông qua phương pháp huyết mẫu sau (Bảng 1.2) - Không bị ngưng kết với mẫu huyết mẫu mẫu nhóm máu O - Ngưng kết với mẫu huyết mẫu mẫu thuộc nhóm máu AB - Ngưng kết mẫu anti-A anti-AB mẫu nhóm máu A - Ngưng kết vị trí Anti-B Anti-AB mẫu kiểm tra nhóm máu B Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết phương pháp huyết mẫu Anti-A Anti-B Anti-AB Nhóm máu A + - + Nhóm máu B - + + Nhóm máu AB + + + Nhóm máu O - - - (+) tương ứng với trường hợp xảy phản ứng ngưng kết; (-) Tương ứng với trường hợp không xảy phản ứng ngưng kết Phương pháp hồng cầu mẫu sử dụng hồng cầu mẫu biết trước kháng nguyên cho phản ứng với kháng thể bệnh nhân để xác định kháng thể có mặt huyết từ xác định kiểu nhóm máu bệnh nhân Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết phương pháp hồng cầu mẫu Hồng cầu mẫu A Hồng cầu mẫu B Hồng cầu mẫu O Nhóm máu A - + - Nhóm máu B + - - Nhóm máu AB - - - Nhóm máu O + + - (+) tương ứng với trường hợp xảy phản ứng ngưng kết; (-) Tương ứng với trường hợp không xảy phản ứng ngưng kết 1.3 Kháng thể đơn dòng 1.3.1 Khái niệm Kháng nguyên chất có khả cảm ứng hình thành kháng thể phản ứng đặc hiệu với kháng thể tạo Chúng phản ứng với thụ thể tế bào T Trên phân tử kháng nguyên có yếu tố định kháng nguyên gọi epitope epitope đặc hiệu với kháng thể kháng nguyên liên kết với nhiều kháng thể vị trí liên kết khác Hai đặc tính quan trọng kháng nguyên là: 1) tính kháng nguyên (có khả kích thích hệ miễn dịch thể); 2) tính miễn dịch (có khả kết hợp với kháng thể tế bào lympho) Kháng nguyên chia thành loại kháng nguyên phụ thuộc tuyến ức (yêu cầu tham gia tế bào T) kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (không yêu cầu tham gia tế bào T để sản xuất kháng thể mà trực tiếp kích hoạt tế bào B đặc hiệu) [14] Kháng thể phân tử glycoprotein sản xuất tế bào B hệ miễn dịch Mỗi phân tử kháng thể gồm chuỗi polypeptide ngắn giống gọi chuỗi nhẹ chuỗi polypeptide dài giống gọi chuỗi nặng Bốn chuỗi liên kết với cầu nối disulfide hình thành phân tử dạng chữ Y - Mỗi chuỗi nhẹ gồm vùng cố định (trình tự axit amin không thay đổi kappa - κ lamda - λ) vùng biến đổi (có trình tự axit amin biến đổi vị trí liên kết với kháng nguyên) Footer Page 19 of 126 10 Header Page 20 of 126 - Mỗi chuỗi nặng gồm ba bốn vùng cố định (CH1, CH2, CH3) vùng biến đổi (VH) đối xứng với vùng biến đổi chuỗi nhẹ, có trình tự amino acid khác phân tử kháng thể Hầu hết phần khác thuộc khu vực siêu biến đổi thường gồm 6-10 amino acid Chuỗi nặng kháng thể γ (IgG), α (IgA), µ (IgM), ε (IgE) δ (IgD), IgG, IgA IgD có vùng định vùng lề, IgM IgE có vùng định vùng lề [17] Kháng thể đơn dòng kháng thể sản xuất dòng tế bào B nhận diện đặc hiệu epitope kháng nguyên Hình 1.4 Kháng thể đơn dòng liên kết với epitope đặc hiệu 1.3.2 Vai trò ứng dụng kháng thể đơn dòng Kháng thể đơn dòng công cụ hữu ích nhiều nghiên cứu y sinh có giá trị kinh tế giá trị y học lớn Một số lượng lớn kháng thể đơn dòng ứng dụng cho chẩn đoán, trị liệu xét nghiệm có độ nhạy cao [18] Một số ứng dụng kháng thể đơn dòng lĩnh vực khoa học, công nghệ, y tế [6]: - Xác định hormon: Kháng thể đơn dòng sử dụng để xác định mức hormon máu, nước tiểu, nước bọt để chẩn đoán bệnh liên quan đến tuyến nội tiết định lượng hormon LH, FSH, progesteron, ostrogen - Trong phân loại vi sinh vật: Kháng thể đơn dòng giúp định loại vi khuẩn, Footer Page 20 of 126 11 Header Page 21 of 126 virus, nấm gây bệnh người, động vật - Trong dược học: Nghiên cứu dược động học thuốc (quá trình biến đổi đào thải thuốc thể) Dùng phát thuốc bị cấm sử dụng (doping, chất gây nghiện), chất độc hại với thể tồn dư lương thực, thực phẩm - Trong ghép tủy xương: Sau ghép tủy xương, muốn tránh tượng đào thải mảnh ghép, người ta phải sử dụng thuốc chống đào thải làm ức chế hệ miễn dịch dẫn đến hệ thống phòng ngự thể bị tê liệt, dễ nhiễm bệnh Đưa mAb đặc hiệu có định hướng vào thể, chúng ức chế yếu tố gây tượng đào thải mảnh ghép mà không ức chế toàn hệ thống miễn dịch thể, mà sức đề kháng thể bị suy giảm - Thử thai: Khi người nữ mang thai, hormon HCG tiết qua nước tiểu Dung dịch mAb kháng HCG liên kết với enzyme bị biến đổi màu có diện HCG (Human Chorionic Gonadotropin) Do đó, cho dung dịch vào ống nghiệm đựng nước tiểu nước tiểu đổi màu có thai ngược lại - Trong bệnh tim mạch: Tơ myosin loại tơ cấu thành nên tế bào Một phần myosin tim bị phá hủy sau nhồi máu Bằng cách tiêm mAb đáp ứng với myosin ta xác định số lượng myosin để đánh giá tình trạng tổn thương tim Kháng thể đơn dòng dùng để xác định vị trí cục máu đông thể bệnh nhân cách gắn vào sợi fibrin có cục máu đông Việc giúp bác sĩ chẩn đoán xử lý kịp thời - Trong việc chống thải loại mô ghép: Kháng thể đơn dòng giúp xác định mô người cho có tương thích với người nhận hay không ngăn ngừa hệ thống miễn dịch bệnh nhân thải loại mô ghép - Trong lĩnh vực chẩn đoán: Việc ứng dụng mAb vào lĩnh vực chẩn đoán đưa thị trường sản phẩm que thử nhanh, kit ELISA chẩn đoán nhanh (dựa phản ứng ngưng kết kháng nguyên kháng thể) Đây ứng dụng bật phổ biến mAb, mAb yếu tố sở thiếu để sản xuất Footer Page 21 of 126 12 Header Page 22 of 126 loại que thử nhanh, kit ELISA phát nhiều loại kháng nguyên khác hormon (que thử thai phát HCG, que thử phát LH xác định rụng trứng phụ nữ), tác nhân gây bệnh, morphin, tồn dư kháng sinh, dấu ấn ung thư PSA, AFP Hình 1.5 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể - Trong việc định nhóm máu hệ ABO Rh: Kháng thể đơn dòng công cụ thiết yếu nghiên cứu, điều trị kỹ thuật chẩn đoán [7, 24] Nhưng thành công lớn mAb sử dụng miễn dịch, huyết học Ngày mAb dần thay kháng thể đa dòng tính đặc hiệu, khả cung cấp với số lượng lớn, chi phí sản xuất thấp Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO huyết đa dòng có nguồn gốc từ người dịch chiết lectin thực vật Ngày nay, mAb sử dụng để tạo thuốc thử định nhóm máu hệ ABO [16] Kháng thể đơn dòng chuột có nhiều ưu điểm so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người việc nhận diện kháng nguyên A B yếu, không lẫn tạp kháng thể, giá thành thấp không bị phụ thuộc Đã có nhiều công bố việc sản xuất thành công mAb chuột để định nhóm máu hệ ABO Hiện nay, giới có nhiều sinh phẩm định nhóm máu hệ ABO có chất mAb thương mại như: Febrile Antigen Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin Footer Page 22 of 126 13 Header Page 23 of 126 international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient) 1.3.3 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng Một vài phương pháp sử dụng để sản xuất kháng thể đơn dòng người gồm: tế bào B, công nghệ phage display, chuột chuyển gen, công nghệ kháng thể đơn dòng tái tổ hợp [15]  Bất tử tế bào B sản xuất kháng thể đơn dòng Bất tử tế bào B thực công nghệ lai tế bào công nghệ EBV (Epstein-Barr virus) Với công nghệ lai tế bào, dung hợp tế bào lympho B miễn dịch tế bào myeloma (người chuột) tạo tế bào lai mang đặc tính dòng tế bào khả sinh trưởng vô hạn sản xuất kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên gây miễn dịch Biến nạp EBV cách làm tế bào lympho B Tuy nhiên, tế bào lympho B biến nạp EBV sinh trưởng vô hạn chúng tế bào ung thư, chúng khó nhân dòng sản xuất lượng nhỏ kháng thể Công nghệ tế bào lai - EBV thiết lập dựa kết hợp phương pháp trì ưu điểm hai  Công nghệ phage display sản xuất kháng thể đơn dòng Công nghệ phage display chọn lọc gen quy định vùng chức (vùng biến đổi) kháng nguyên để biểu mảnh kháng thể chức Các bước phage display bao gồm: xây dựng thư viện kháng thể, biểu bề mặt phage, lựa chọn phage biểu kháng thể, sàng lọc phage biểu kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đích Mảnh gen VH VL khếch đại từ mARN tế bào lympho B sử dụng RT-PCR Mảnh gen mã hóa vùng biến đổi chuỗi đơn (single chain fragment variable - scFv) tạo cách tổ hợp ngẫu nhiên mảnh gen VH VL sử dụng PCR Thư viện sau tách dòng để biểu scFv bề mặt thực khuẩn thể Lựa chọn phage biểu scFv đặc hiệu với kháng nguyên mong muốn cách cho dòng thực khuẩn thể biểu scFv liên liên kết với kháng nguyên hapten khác Các kháng thể không bám loại bỏ cách rửa sau kháng thể bám rửa giải nhân lên cách lây nhiễm vào Footer Page 23 of 126 14 Header Page 24 of 126 E coli Lặp lại bước vài lần lựa chọn mảnh scFv đặc hiệu kháng nguyên Sau đó, đặc hiệu mảnh scFv sàng lọc sử dụng phương pháp miễn dịch enzyme lọc tế bào hoạt hóa huỳnh quang protein liên kết màng tế bào đích Khi đặc hiệu phân lập, gen vùng biến đổi kháng thể đưa vào vector biểu toàn kháng thể người chuyển vào tế bào để sản xuất kháng thể đơn dòng người Một thư viện phage display phân lập mAb cấp phép FDA 35 mARN người tạo từ công nghệ phage display thử nghiệm lâm sàng  Chuột chuyển gen sản xuất kháng thể đơn dòng Sử dụng chuột biến đổi gen kỹ thuật khác để tạo kháng thể đơn dòng Kỹ thuật chuyển gen chuột gồm phân cắt locus gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi nhẹ chuột chuyển gen mã hóa chuỗi nặng, chuỗi nhẹ kappa người vào  Công nghệ kháng thể tái tổ hợp sản xuất kháng thể đơn dòng Công nghệ kháng thể tái tổ hợp từ dòng tế bào B sản xuất kháng thể tiến hành sau:đầu tiên tiến hành phân lập tế bào B đơn từ lách chuột tế bào máu ngoại vi người (bằng vi hạt mang marker chọn lọc tế bào B) sau tách mRNA tổng hợp cDNA gen mã hóa cho đoạn biến đổi chuỗi nặng chuỗi nhẹ kháng thể (bằng RT-PCR), tiến hành tổ hợp gen chuỗi nặng chuỗi nhẹ (sử dụng kỹ thuật PCR overlapping), cuối biểu vector nhân dòng để sản xuất kháng thể đơn dòng người đặc hiệu in vitro Đây phương pháp biểu kháng thể đơn dòng người có hiệu cao, tạo lượng lớn kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên thời gian ngắn yêu cầu số lượng tế bào  Công nghệ tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng Tế bào lai tế bào tạo sau trình dung hợp tế bào có chức sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn Tạo tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng (kháng thể đặc hiệu kháng nguyên) tiến hành sau: gây miễn dịch chuột với kháng nguyên đặc hiệu Sau vài tuần, thu máu từ chuột gây miễn dịch để định lượng kháng thể huyết Khi hiệu giá kháng thể Footer Page 24 of 126 15 Header Page 25 of 126 đủ cao, thu lách chuột để tách tế bào lympho B Dung hợp tế bào lympho ung thư tủy myeloma thiếu gen HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase), nuôi cấy tế bào môi trường HAT (hypoxanthyl aminoteptrin thymidine) Tế bào myeloma khả tổng hợp kháng thể thiếu enzyme HGPRT (enzyme cho phép tế bào tổng hợp purine từ hypoxanthine) Ban đầu, vắng mặt HGPRT vấn đề tế bào sử dụng đường thay để tổng hợp purine Tuy nhiên, tế bào nuôi cấy môi trường aminoteprin, chúng sử dụng đường thay khác phụ thuộc hoàn toàn vào HGPRT để tồn Tế bào lympho B phân lập từ chuột có enzyme HGPRT có khả sản xuất kháng thể, tiếp xúc với kháng nguyên biệt hóa thành tương bào plasma sản xuất kháng thể lại giai đoạn cuối trình biệt hóa nên chúng nhân lên nuôi cấy Do vậy, có tế bào lai có khả tồn môi trường HAT Dịch nuôi cấy tế bào lai kiểm tra để tìm tế bào sản xuất kháng thể mong muốn Sau tạo dòng tế bào lai đặc hiệu kháng nguyên kháng thể đơn dòng sản xuất cách tiêm dòng tế bào lai vào khoang bụng chuột sử dụng kỹ thuật nuôi cấy tế bào in vitro [20-22] Đáp ứng miễn dịch động vật không phụ thuộc loại kháng nguyên mà còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố kiểu hình di truyền động vật chủ, liều lượng kháng nguyên, đường gây miễn dịch có mặt tá chất miễn dịch Cấu trúc di truyền động vật chủ có ảnh hưởng lớn đến khả sinh đáp ứng miễn dịch động vật chủ cường độ đáp ứng Nhiều nghiên cứu chứng minh gen phức hợp MHC có liên quan đến việc kiểm soát tính sinh miễn dịch thể Các protein sản phẩm gen tham gia vào trình trình diện kháng nguyên cho tế bào T đóng vai trò trung tâm định cường độ đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên Ngoài ra, đáp ứng miễn dịch động vật chủ với kháng nguyên phụ thuộc vào gen mã hóa thụ thể tế bào B, tế bào T nhận diện kháng nguyên gen mã hóa protein khác tham gia vào trình đáp ứng miễn dịch Sự thay đổi di truyền tất gen ảnh hưởng đến tính sinh miễn dịch động vật Footer Page 25 of 126 16 Header Page 26 of 126 chủ với kháng nguyên biết trước Tá dược chất trộn với kháng nguyên làm tăng tính sinh miễn dịch kháng nguyên cách kéo dài tồn kháng nguyên thể động vật gây miễn dịch Các tá chất Freund gồm có kháng nguyên dung dịch nước, dầu khoáng chất nhũ hoá, tá chất phân tán dầu thành giọt nhỏ bao quanh kháng nguyên kháng nguyên giải phóng chậm từ nơi tiêm vào thể Tá chất Freund hoàn toàn (FCA) có thêm Mycobarterium bị giết nhiệt có hiệu lực cao tá chất Freund không hoàn toàn (FIA) thành phần muramyl dipeptide vách tế bào Mycobarterium hoạt hoá đại thực bào làm tăng hoạt động thực bào, kích thích hoạt hoá tế bào TH Cả hoạt động trình diện kháng nguyên tín hiệu đồng kích thích tế bào TH tăng lên có tá chất Do vậy, tá chất Freund sử dụng gây nhũ với hồng cầu để gây miễn dịch cho chuột [28-30] 1.3.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng Việt Nam  Nghiên cứu kháng thể đơn dòng Việt Nam Ở Việt Nam có số nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng: Đỗ Thị Thảo đồng tác giả (2008) thành công việc tạo dòng tế bào lai sinh mAb kháng protein vỏ VP28 virus WSSV gây bệnh đốm trắng cho tôm sú; Nguyễn Thị Trang đồng tác giả (2010) tạo polyhedrin virus MBV gây bệnh còi tôm, progesteron-BSA AFP; Lê Quang Huấn đồng tác giả nghiên cứu tạo mAb kháng tế bào ung thư vú kỹ thuật phase display [1, 2] Tuy nhiên, đến chưa có báo cáo việc tạo mAb kháng kháng nguyên hồng cầu nhằm ứng dụng chẩn đoán định nhóm máu Việt Nam  Sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu dùng định nhóm máu Việt Nam Trước đây, thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO huyết đa dòng có nguồn gốc từ người dịch chiết lectin thực vật [14] Ngày nay, kháng thể đơn dòng sử dụng để tạo thuốc thử xác định nhóm máu ABO Kháng thể đơn dòng chuột có nhiều ưu điểm so với kháng thể đa dòng có nguồn gốc từ người bao gồm nhận diện kháng nguyên A B yếu, loại bỏ kháng thể lẫn tạp, hiệu Footer Page 26 of 126 17 Header Page 27 of 126 giá thành nguồn kháng thể có sẵn không phụ thuộc vào người Đã có nhiều báo cáo sản xuất thành công kháng thể đơn dòng chuột để xác định nhóm máu hệ ABO [23, 25] Hiện nay, giới có nhiều thuốc thử xác định nhóm máu hệ ABO có chất kháng thể đơn dòng thương mại như: Febrile Antigen Reagents (Atlas Medical), Transclone (Biorad), Blood grouping anti sera (Maxwin international), Blood Grouping (Prestige Diagnostics U.K.), ALBAclone (Quotient) Tuy nhiên, kháng thể đơn dòng sử dụng để xác định nhóm máu hệ ABO chưa sản xuất Việt Nam Cho đến nay, Việt Nam chưa có đơn vị hay tổ chức sản xuất mAb đặc hiệu dùng để định nhóm máu hệ ABO hệ Rh Hầu hết huyết mẫu sử dụng để chẩn đoán nhóm máu nhập ngoại với giá thành cao Trước đây, Viện Huyết học Truyền máu Trung ương tự sản xuất huyết mẫu từ huyết tương tách từ máu nguời tình nguyện Phương pháp tốn chi phí sử dụng nhiều máu thu gom từ tình nguyện viên Nếu tiếp tục sản xuất huyết mẫu theo phương pháp ảnh hưởng đến sản lượng máu dùng cho chữa bệnh, mà mục tiêu ý nghĩa cao hiến máu nhân đạo để chữa bệnh cứu người giới chưa nghiên cứu máu nhân tạo thay Trên thị trường Việt Nam, số công ty Bộ Y tế cấp phép nhập huyết mẫu có chứng CE Bio-Rad Việt Nam Biotech Việt Nam Biotech Việt Nam phân phối huyết mẫu hãng Spinreact, Tây Ban Nha sản xuất với giá 280.000 đồng/bộ gồm lọ huyết anti A, anti B anti AB (mỗi lọ 10 ml) Còn hãng Bio-Rad chào bán huyết mẫu với giá 600.000 đồng/bộ gồm lọ huyết anti A, anti B anti AB (mỗi lọ 10 ml) Như vậy, số tiền cần bỏ để nhập huyết mẫu đủ để định nhóm máu hệ ABO thu gom hàng năm khoảng vài chục tỷ đồng, để xét nghiệm nhóm máu hệ ABO toàn quốc lên đến vài trăm tỷ đồng Đây số thực lớn bối cảnh nước ta nghèo người bệnh lại trả tiền thuốc men chữa trị lớn Footer Page 27 of 126 18 Header Page 28 of 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2): 203-208 Lê Quang Huấn Lã Thị Huyền (2009), “Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng” NXB Khoa học công nghệ, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Abhyankar A (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific for human blood group B” Journal of Hematological Malignancies, 2(2), p ATTC (2011), “Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for continuous cell line” Aymard JP (2012), “Karl Landsteiner (1868–1943) and the discovery of blood groups”, Transfus Clin Biol, 19(4-5), P.244 -248 Berger M (2002), “Therapeutic applications of monoclonal antibodies”, The American Journal of the Medical Sciences, 324(1), p.14-30 Borrebaeck CA (2000), “Antibodies in diagnostics - from immunoassays to protein chips”, Immunology Today, 21(8), p.379 – 382 Committee I (2012) “Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats” the University of North Carolina at Chapel Hill Council N (1999), “Monoclonal Antibody Production” National Academy Press, Washington 10 Fouad (2005), “Production of a new anti-A monoclonal reagent”, African Journal of Bioteachnology, 4(8), p.3 11 Fulle A (1992), “Immunization of Mice” Current Protocols in Molecular Biology 12 Greenfield E.A (2014), “Antibodies: A laboratory manual, second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 13 Footer Page 28 of 126 Iyer YS (2006), “Production of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal 52 Header Page 29 of 126 Medicin Research, 123(4), p 561 14 Izumi K, (2001), “Antigen–Antibody Binding”, Encyclopedia of life science 15 John B Zabriskie (2009), “Essential Clinical Immunology”, Cambridge University Press, United Kingdom 16 Khan F (2002), “Lectins as markers for blood grouping”, Medical Science Monitor, 8(12), p.293-300 17 Martine L (2001), “Molecular characterization of a monoclonal murine antiblood group A antibody”, Immunology Letters, 76(1), 18 Mika K,(2003), “Molecular characterization of a human monoclonal antibody to B antigen in ABO blood type”, Immunology Letters, 86(1), pp 45-51 19 Laura D (2005), “Chapter Blood and the cells it contain, Blood groups and red cell antigens”, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) 20 Laura D (2005), “Chapter Blood group antigen are surface marker on the red blood cell membrane Blood groups and red cell antigens”, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) 21 Lundblad AK (1963), “Monoclonal antibody formulation for diagnostic use”, US 4618486 22 Parham, P (2009), “The Immune System, third edition”, Garland Science 23 Pandey, S (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies” International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 1(2): p 24 Pelegrin M (2004), Monoclonal antibody-based genetic immunotherapy, Current Gene Therapy Journal, 4(3), p.347 – 356 25 Shinya S (2014), “Routes of Administration” The Laboratory Mouse, National Institute of Animal Health, Tsukuba, Japan 26 Kamala T (2007), “Hock immunization: A humane alternative to mouse footpad injections”, J Immunol Methods, 328(1-2), p.204–214 27 Wang, S (2011), “Advances in the production of human monoclonal antibodies” Antibody Technology Journal, 2001(1): pp 1-4 28 Blood transfusion http://www.medicinenet.com/blood_transfusion/article.htm, 29/2/2016 Footer Page 29 of 126 53 Header Page 30 of 126 29 International Society of Blood Transfusion (2014) http://www.isbtweb.org, 29/2/2016 30 A Report of the Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council, "Monoclonal Antibody Production", National Academy Press, 1999 http://grants.nih.gov/grants/policy/antibodies.pdf 26/09/2016 Footer Page 30 of 126 54 ... nêu trên, thực đề tài Tạo dòng tế b o lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B màng tế b o hồng cầu người với mục tiêu tạo dòng tế b o lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên. .. cầu số lượng tế b o  Công nghệ tế b o lai sản xuất kháng thể đơn dòng Tế b o lai tế b o tạo sau trình dung hợp tế b o có chức sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn Tạo tế b o lai sản xuất kháng thể. .. Chuẩn b tế b o 23 2.2.3 Nuôi cấy tế b o myeloma 24 2.2.4 Dung hợp tạo dòng tế b o lai 24 2.2.5 Sàng lọc tế b o lai 26 2.2.6 Tách dòng tế b o lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên