Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên b trên màng tế bào hồng cầu người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN QUỐC KHÁNH TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - TRẦN QUỐC KHÁNH TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN B TRÊN MÀNG TẾ BÀO HỒNG CẦU NGƯỜI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ TRUNG TS NGUYỄN ĐÌNH THẮNG Hà Nội – 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Trung, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình bảo, hướng dẫn suốt thời gian học tập thực luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Đình Thắng (Bộ môn sinh lý thực vật hóa sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên) thầy giáo, cô giáo khoa Sinh học, đặc biệt thầy giáo, cô giáo môn Sinh lý Thực vật Hóa sinh học tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, giảng dạy dìu dắt thời gian thực luận văn suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị, bạn làm việc Phòng Kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tận tình giúp đỡ bảo suốt trình học tập thực luận văn phòng Cuối cùng, vô biết ơn gia đình bạn bè khích lệ động viên suốt thời gian qua Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Trần Quốc Khánh iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Máu hệ thống nhóm máu người 1.2 Truyền máu nguyên tắc truyền máu 1.3 Kháng thể đơn dòng 10 1.3.1 Khái niệm 10 1.3.2 Vai trò ứng dụng kháng thể đơn dòng 11 1.3.3 Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 14 1.3.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất kháng thể đơn dòng Việt Nam 17 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 19 2.1.2 Sinh phẩm 19 2.1.3 Máy móc thiết bị 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Gây miễn dịch đánh giá khả đáp ứng miễn dịch 20 2.2.1.2 Đánh giá khả đáp ứng miễn dịch 23 2.2.2 Chuẩn bị tế bào 23 2.2.3 Nuôi cấy tế bào myeloma 24 2.2.4 Dung hợp tạo dòng tế bào lai 24 2.2.5 Sàng lọc tế bào lai 26 2.2.6 Tách dòng tế bào lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B 27 2.2.7 Đánh giá tốc độ sinh trưởng sản xuất kháng thể tế bào lai 28 2.2.8 Phương pháp đếm tế bào lai (xác định số lượng tế bào sống) 29 2.2.9 Xác định loại globulin miễn dịch kiểm tra tính đơn dòng tế bào lai 29 iv 2.2.10 Đánh giá kháng thể tế bào lai sản xuất 31 2.2.11 Cô đặc kháng thể ammonium sulfate 32 2.2.12 Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu B 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột 35 3.1.1 Lựa chọn nguyên liệu gây miễn dịch cho chuột 35 3.1.2 Cách thức gây miễn dịch cho chuột 35 3.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai myeloma tế bào lympho B chuột 37 3.2.1 Nuôi cấy tế bào đại thực bào để tạo lớp tế bào 37 3.2.2 Nghiên cứu tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mang kháng nguyên B 38 3.2.2.1 Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn lách chuột gây miễn dịch hồng cầu B 38 3.2.2.2 Dung hợp tế bào myeloma sp2/0 hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B tách từ chuột gây miễn dịch hồng cầu mẫu B 39 3.2.2.3 Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B 41 3.2.2.4 Khả sinh trưởng tế bào B4D10C9 42 3.2.2.5 Khả sản xuất mAb kháng kháng nguyên B dòng tế bào lai B4D10C9 43 3.2.2.6 Xác định độ đặc hiệu mAb B4D10C9 sản xuất 44 3.2.2.7 Cường độ tính mAb B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B 44 3.2.2.8 Xác định phân lớp mAb dòng tế bào B4D10C9 sinh 45 3.2.2.9 Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 47 3.2.2.10 Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 v DANH MỤC CÁC BẢNG Tên Bảng Trang Bảng 1.1 Các nhóm máu hệ ABO người 06 Bảng 1.2 Hướng dẫn đọc kết phương pháp huyết mẫu 09 Bảng 1.3 Hướng dẫn đọc kết phương pháp hồng cầu mẫu 10 Bảng 3.1 Biến động hiệu giá kháng thể trung bình gây miễn dịch 35 theo đường khác Bảng 3.2 Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách hạch bẹn chuột gây miễn dịch hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma sp2/0 37 Bảng 3.3 Số giếng chứa tế bào lai tiết kháng thể gây ngưng kết hồng cầu 40 mẫu B vi DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1 Kháng nguyên nhóm máu người Hình 1.2 Cấu tạo chuỗi đường quy định kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hình 1.3 Sơ đồ truyền máu Hình 1.4 Kháng thể đơn dòng liên kết với epitope đặc hiệu 11 Hình 1.5 Phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể 13 Hình 2.1 Chuẩn bị vật liệu gây miễn dịch cho chuột 22 Hình 2.2 Gây miễn dịch cho chuột cách tiêm vào hai gan bàn chân chuột 22 Hình 2.3 Cách đọc kết của phản ứng ngưng kết hồng cầu đĩa 96 đáy chữ V 27 Hình 2.4 Sơ đồ pha loãng tới hạn 28 Hình 2.5 Vị trí ô đếm buồng đếm tế bào 29 Hình 2.6 Cách đọc kết đĩa elisa kit Pierce® Rapid ELISA mouse mAb 31 Hình 3.1 Hình ảnh tế bào đại thực bào nuôi cấy tĩnh 38 Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào lai quan sát kính hiển vi soi ngược (độ phóng đại 1000 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x) 40 Hình 3.3 Minh họa giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A O 41 Hình 3.4 Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu mẫu B 42 Hình 3.5 Hiệu giá kháng thể dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết hồng cầu B 42 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng môi trường DMEM +10% FBS DMEM+1% FBS 43 vii theo thời gian Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 môi trường DMEM+1%FBS DMEM+10% FBS 44 Hình 3.8 Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B mAb tế bào lai B4D10C9 sinh 45 Hình 3.9 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến kính xác định tính mAb dòng tế B4D10C9 sinh với hồng cầu mẫu B 45 Hình 3.10 Phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể dòng tế bào B4D10C9 sản xuất 46 Hình 3.11 Dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trước sau tủa 47 ammonium sulphate Hình 3.12 Cường độ phản ứng kháng thể kháng B trước sau 48 tủa Hình 3.13 Phản ứng ngưng kết hồng cầu kháng thể kháng B thu 48 sau tủa ammonium sulphate Hình 3.14 Kháng thể kháng B (anti-B) hoàn nguyên dung 50 dịch hoàn nguyên màu vàng A dung dịch chứa kháng thể B (anti-B); B dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B Hình 3.15 A Phản ứng ngưng kết sinh phẩm B với hồng cầu mẫu A, B O; B Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B viii 50 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt anti-A anti-AB anti-B Tên đầy đủ Anti-A antibody Anti-AB antibody Anti-B antibody Tên tiếng việt Kháng thể kháng A Kháng thể kháng AB Kháng thể kháng B BSA DMEM Bovine serum albumin Dulbecco's Modified Eagle's Medium Albumin huyết bò Môi trường Dulbecco biến đổi DMSO E coli EBV Dimethyl sulfoxide Escherichia coli Epstein – Barr virus Virus Epstein-Barr EDTA ELISA Ethylene diamine tetraacetic acid enzyme-linked immunosorbent assays Fragment antigen-binding Mảnh Fetal Bovine Serum Freund’s complete adjuvant Food and Drug Administration nguyên Huyết bê Tá chất hoàn toàn Cục quản lý Thực phẩm Fab FBS FCA FDA FIA HAT Freund’s incomplete adjuvant hypoxanthyl aminoteptrin liên kết kháng Dược phẩm Hoa Kỳ Tá chất không hoàn toàn HT thymidine hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase hypoxanthyl thymidine mARN PBS PEG Messenger RNA Phosphate buffered saline polyethylene glycol ARN thông tin Đệm muối phosphate RPMI Roswell Park Memorial Institute medium World Health Organisation Môi trường RPMI HGPRT WHO ix Tổ chức y tế giới MỞ ĐẦU Máu thành phần vô quý giá điều trị bệnh mà chưa có sinh phẩm thay được, đặc biệt máu sử dụng điều trị nội khoa, cấp cứu ngoại khoa, sản khoa triển khai nhiều kỹ thuật y học cao cấp ghép tạng, mổ tim, lọc máu thận Tuy nhiên, việc sử dụng máu điều trị bệnh gặp phải nhiều rủi ro, có ngưng kết kháng nguyên màng hồng cầu người cho với kháng thể huyết người nhận Để trình truyền máu thành công phải có tương thích máu người cho người nhận Do đó, trước truyền máu cần phải tiến hành xác định nhóm máu Năm 2014, Hiệp hội truyền máu quốc tế thống kê có 35 hệ nhóm máu với 300 kháng nguyên nhóm máu khác Hầu hết kháng nguyên màng hồng cầu có tính sinh miễn dịch yếu dùng để nghiên cứu di truyền quan hệ huyết thống, có hai nhóm kháng nguyên đặc biệt quan trọng gây phản ứng ngưng kết truyền máu dẫn đến tai biến kháng nguyên A, B hệ nhóm máu ABO kháng nguyên D hệ nhóm máu Rh Các nhóm máu nêu xác định phương pháp ngưng kết sử dụng hồng cầu mẫu huyết mẫu Huyết mẫu kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên nhóm máu, có loại huyết mẫu anti-A, anti-B, anti-AB sử dụng xác định nhóm máu hệ ABO huyết mẫu anti-D để xác định nhóm máu hệ Rh Nhiều phương pháp phát triển để sản xuất kháng thể đơn dòng công nghệ lai tế bào, công nghệ tế bào B, công nghệ phage display, công nghệ kháng thể tái tổ hợp, sử dụng chuột chuyển gene Phương pháp lai tế bào ứng dụng thành công để tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể kháng lại kháng nguyên nhóm máu hệ ABO Hiện nay, nhiều thuốc thử nhóm máu có chất kháng thể đơn dòng sản xuất thành công Blood Grouping (Prestige Diagnostics UK), Monoclonal blood grouping reagent (Maxwin international), Anti-A Monoclonal reagent (Atlas Medical), Transclone® (Biorad) Ngày nay, nhu cầu sử dụng máu điều trị bệnh ngày lớn việc sử dụng huyết mẫu gia tăng Tuy nhiên, Việt Nam chưa sản xuất kháng thể đơn dòng xác định nhóm máu mà chủ yếu sử dụng hồng cầu A B C D Hình 3.2 Ảnh chụp tế bào lai quan sát kính hiển vi soi ngược (độ phóng đại 200 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x) A sau ngày nuôi; B sau ngày nuôi; C sau ngày nuôi; D sau 10 ngày nuôi tế bào sau dung hợp môi trường HAT/HT Sự phát triển tế bào lai sau dung hợp quan sát kính hiển vi soi ngược truyền qua chụp ảnh (Hình 3.2) Sau ngày dung hợp tế bào lai hình thành (Hình 3.2A); sau ngày nuôi tế bào phát triển thành cụm to hơn, số lượng tế bào nhiều (Hình 3.2B); tế bào tiếp tục phát triển quan sát ngày (Hình 3.2C, D) Tùy vào tốc độ phát triển tế bào lai, sau 4-6 ngày môi trường HAT thay HT Sau 10 ngày nuôi cấy, tế bào lai phát triển thành cụm lớn gồm nhiều tế bào bị phân tán tác động học trình thay môi trường 40 3.2.2.3 Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B Dịch nuôi từ 1035 giếng chứa tế bào lai kiểm tra với hồng cầu mẫu A, B O Kết quả, dịch nuôi giếng B4D6, B4D10, B8D11, B8F6, B4H6 gây kết hồng cầu B mà không gây ngưng kết hồng cầu A hồng cầu O Tế bào giếng cấy chuyển sang giếng đĩa 24 giếng để tiến hành thí nghiệm phân lập tế bào lai đơn Hình 3.3 Minh họa giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A O Phân lập tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết đặc hiệu kháng nguyên B Bằng phương pháp pha loãng giới hạn nồng độ mô tả phần phương pháp, 10 dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B phân lập (Hình 3.3) Các dòng tế bào lai đơn gồm: B4D6C6, B4D6E2, B4D10C9, B4D10B6, B4D10D5, B4D10D6, B4D10E4, B4H6C5, B8F6B6, B8F6D4 41 Hình 3.4 Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu mẫu B Khả sản xuất kháng thể từ dòng tế bào đơn xác định thông qua hiệu giá kháng thể dịch nuôi Hầu hết tế bào sinh kháng thể có hiệu giá cao 1/64, riêng dòng tế bào B4D10C9 sinh kháng thể có hiệu giá 1/256 (Hình 3.5) Dòng tế bào đơn B4D10C9 lựa chọn để tiến hành thí nghiệm Hình 3.5 Hiệu giá kháng thể dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết hồng cầu B 3.2.2.4 Khả sinh trưởng tế bào B4D10C9 Khi nuôi dòng tế bào lai B4D10C9 với mật độ ban đầu 105 tế bào/ml môi trường chứa 10% FBS không quan sát thấy pha tiềm phát pha cân 42 đường cong sinh trưởng dòng tế bào lai (Hình 3.6) Mật độ tế bào tối đa đạt 9,9.105 tế bào/ml sau 50 nuôi, tốc độ sinh trưởng trung bình 0,030 h-1, sau số lượng tế bào sống giảm dần tế bào chết hầu hết sau khoảng 150 Dòng tế bào lai B4D10C9 nuôi môi trường chứa 1% FBS tế bào tăng sinh thời gian pha tiềm phát kéo dài không quan sát pha cân đường cong sinh trưởng Mật độ tế bào tối đa đạt 3,4.105 tế bào/ml sau khoảng 72 nuôi, tốc độ sinh trưởng trung bình 0,011 h-1 Toàn tế bào chết sau 140 nuôi Trong dòng tế bào.Mật độ tế bào giảm dần sau 50 nuôi chết gần hết x 105 tế bào sống/ml sau 150 nuôi (Hình 3.6) Thời gian nuôi Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng môi trường DMEM +10% FBS DMEM+1% FBS theo thời gian 3.2.2.5 Khả sản xuất mAb kháng kháng nguyên B dòng tế bào lai B4D10C9 Kháng thể sản xuất dòng tế bào B4D10C9 suốt trình sinh trưởng tế bào đạt cực đại vào cuối pha suy vong Dòng tế bào B4D10C9 nuôi môi trường chứa 10% FBS hiệu giá kháng thể cực đại dịch nuôi đạt 1/512 Còn nuôi dòng tế bào môi trường chứa 1%FBS hiệu giá kháng thể cực đại đạt 1/64 (Hình 3.7) 43 Hiệu giá kháng thể Thời gian nuôi cấy, Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 môi trường DMEM+1%FBS DMEM+10% FBS 3.2.2.6 Xác định độ đặc hiệu mAb B4D10C9 sản xuất Hình 3.8 trình bày kết phản ứng ngưng kết dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 với hồng cầu mẫu A, B, O Dịch nuôi tế bào B4D10C9 gây ngưng kết hồng cầu B mà không gây ngưng kết hồng cầu A O Kết tương tự phản ứng anti-B (biorad) với hồng cầu mẫu A, B, O Trong môi trường DMEM+10% FBS không gây ngưng kết với hồng cầu mẫu đem kiểm tra 3.2.2.7 Cường độ tính mAb B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B Độ nhạy kháng thể đánh giá qua cường độ tính Nếu kháng thể có độ nhạy cao đồng nghĩa với cường độ phản ứng cao tính cao Ái tính kháng thể dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 xác định phản ứng ngưng kết dịch nuôi hồng cầu mẫu B 10% Sau khoảng 3,5 giây để nhận biết dấu hiệu phản ứng ngưng kết anti-B (Biorad) khoảng giây 44 Hình 3.8 Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B mAb tế bào lai B4D10C9 sinh Hàng ngang 1, 2, 3: Hồng cầu mẫu A, B, O tương ứng Cột dọc 1, 2, 3: môi trường DMEM+10% FBS (đối chứng âm), anti-B (đối chứng dương), dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 tương ứng Cường độ đánh giá độ mạnh phản ứng ngưng kết kháng nguyênkháng thể xác định phản ứng ngưng kết dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 hồng cầu mẫu B 10% phiến kính Sau phút phản ứng, cường độ phản ứng ngưng kết dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 hồng cầu mẫu B 10% 2+ có nhiều cụm ngưng kết dịch đục Trong cường độ phản ứng ngưng kết anti-B (Biorad) hồng cầu mẫu B 10% 3+ Thông qua đánh giá tính kháng thể cường độ phản ứng ngưng kết hồng cầu nhận thấy kháng thể có dịch nuôi dòng tế bào lai B4D10C9 có độ nhạy trung bình (Hình 3.9) Hình 3.9 Phản ứng ngưng kết hồng cầu phiến kính xác định tính mAb dòng tế B4D10C9 sinh với hồng cầu mẫu B 3.2.2.8 Xác định phân lớp mAb dòng tế bào B4D10C9 sinh 45 Kháng thể kháng B dòng tế bào B4D10C9 xác định phân lớp kháng thể phương pháp ELISA Một phiến nhựa phủ lớp kháng thể anti-mouse chuỗi nặng (anti-IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA IgM) kháng thể chuỗi nhẹ (kappa lambda) Kết Hình 3.10 cho thấy vị trí F G có phản ứng xảy ra, màu dung dịch giếng từ không màu chuyển thành vàng vàng nhạt A B C D E F G H Hình 3.10 Phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể dòng tế bào B4D10C9 sản xuất Đối chiếu với bảng kit Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit ta thấy hai vị trí tương ứng với kháng thể kháng B chứa chuỗi nặng IgM chuỗi nhẹ kappa Tiến hành xác định đo giá trị OD vị trí đo bước sóng 450 nm thu kết có hai vị trí cho giá trị OD450> 0,2 tương ứng với hai vị trí đổi màu quan sát Như vậy, kháng thể dòng tế B4D10C9 sản xuất có phân lớp chuỗi nặng IgM phân lớp chuỗi nhẹ kappa Phản ứng Elisa không xác định isotype kháng thể mà phương pháp để kiểm chứng xem dòng tế bào lai đơn dòng hay chưa Cơ chế kiểm soát tái xếp gen globulin miễn dịch để chắn tế bào đơn sản xuất hai chuỗi nhẹ, chế kiểm soát gen chuỗi nặng cắt ARN cho phép dòng tế bào đơn sản xuất nhiều chuỗi nặng Tuy nhiên, tế bào lai tiết chuỗi nặng chuỗi nhẹ Việc dòng tế bào lai sản xuất hai chuỗi nhẹ nhiều chuỗi nặng xảy việc phát nhiều chuỗi nặng dòng tế bào lai mong muốn có lẫn với dòng tế bào lai khác Theo kết thu được, dòng tế bào lai B4D10C9 sản xuất chuỗi nặng chuỗi nhẹ dòng tế bào B4D10C9 chắn đơn dòng sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên B 46 3.2.2.9 Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B Dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 có chứa kháng thể kháng kháng nguyên B với protein kháng thể có nguồn gốc từ huyết bò (FBS) Tuy nhiên, kiểm tra độ đặc hiệu kháng thể có dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 với hồng cầu mẫu A+, B+, O+ kháng thể dịch nuôi cấy nhận diện đặc hiệu kháng nguyên B màng hồng cầu Do dịch nuôi cấy chứa kháng thể kháng kháng nguyên B có lẫn tạp với protein huyết bò không ảnh hưởng đến độ đặc hiệu kháng thể kháng nguyên B Như vậy, sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 để làm thuốc thử xác định nhóm máu B Tuy nhiên sinh phẩm xác định nhóm máu thương mại thị trường, để phân biệt kháng thể kháng A, kháng B hay kháng AB trộn với dung dịch chất màu khác để phân biệt Do phải tiến hành loại bỏ màu phenol đỏ dịch nuôi cấy tế bào trước tạo màu cho dịch kháng thể Để loại bỏ phenol red tiến hành sử dụng phương pháp tủa với ammonium sulfate 50% phương pháp đơn giản dễ dàng Kháng thể kháng B dịch nuôi cấy thu lại cách tủa với ammonium sulfate 50% bão hòa (Hình 3.11) Hình 3.11 Dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trước sau tủa ammonium sulphate Dịch kháng thể sau tủa kiểm tra phản ứng ngưng kết phiến kính với hồng cầu mẫu A B để đánh giá lại độ đặc hiệu kháng thể Kết nhận kháng thể sau tủa ngưng kết tốt với hồng cầu mẫu B Tuy nhiên hoàn nguyên thể tích ban đầu dịch kháng thể thể cường độ phản ứng thấp dịch nuôi cấy Khi hoàn nguyên với thể tích 1/5 ban đầu cường độ phản 47 ứng cao cường độ nhận từ dịch nuôi cấy (Hình 3.12) Hình 3.12 Cường độ phản ứng kháng thể kháng B trước sau tủa Có thể thấy rằng, kháng thể trước hay sau tủa với ammonium sulphate phản ứng đặc hiệu với hồng cầu mẫu B Tuy nhiên vơi dịch tủa sau hòa bẳng thể tích ban đầu cường độ giảm trình tủa thì có phần hàm lượng kháng thể bị dịch nuôi cấy tế bào có bổ sung FBS mà thành phần FBS BSA, BSA lại có tương tác với kháng nguyên kháng thể mà sau hàm lượng BSA giảm ảnh hưởng đến cường độ ngưng kết phản ứng kháng nguyên-kháng thể Tế bào B4D10C9 nuôi cấy đến pha suy vong dịch nuôi cấy thu lại Hiệu giá kháng thể dịch nuôi cấy đạt 28, hàm lượng kháng thể tương đương 50 µg/ml 2200 ml dịch nuôi cấy chứa hàm lượng cao kháng thể kháng B thu lại tủa với ammonium sulphate 50% bão hòa Hiệu giá kháng thể dịch cô đặc 29 cường độ phản ứng dịch kháng thể kháng B 4+ (Hình 3.13) Hình 3.13 Phản ứng ngưng kết hồng cầu kháng thể kháng B thu sau tủa ammonium sulphate 48 3.2.2.10 Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B Sau cô đặc, kháng thể hoàn nguyên vào dung dịch bảo quản protein Dung dịch hoàn nguyên kháng thể dịch không màu nên khó theo dõi trình xét nghiệm Để tránh nhầm lẫn trình thực nghiệm, màu xanh màu vàng dùng để đánh dấu màu huyết mẫu dùng để xác định nhóm máu ABO Theo đó, màu xanh dùng để đánh dấu thuốc thử anti-A, màu vàng dùng để đánh dấu thuốc thử anti-B Theo công bố sáng chế WO 2012083361 màu xanh hình thành từ chất patent blue V, màu vàng hình thành từ chất tartrazine Tartrazine chất màu có gốc axit liên kết với nhau, gốc sulphonic gốc carboxylic Nó tích điện âm nước có lực yếu với cellulose polyester Khi chất màu trộn với dịch chứa kháng thể hòa tan nhanh chóng tạo thành dung dịch suốt có màu Kháng thể có chất protein nên điều kiện bảo quản sử dụng dễ dàng bị công phân hủy protease Để bảo quản chúng, sodium azide với hàm lượng 0,01% bổ sung vào dung dịch bảo quản kháng thể Phản ứng ngưng kết hồng cầu xảy hiệu môi trường muối có nồng độ ion thấp, thông thường sử dụng dung dịch nước muối sinh lý Do sodium chloride với nồng độ cuối 0,9% sử dụng đệm phosphate (PBS) sử dụng dung dịch bảo quản kháng thể Để tạo môi trường phản ứng ngưng kết hồng cầu tốt nhất, EDTA chất chống đông máu, làm ổn định hồng cầu sử dụng thành phần dịch hoàn nguyên kháng thể Nồng độ cuối EDTA dung dịch 10 mM Thành phần dung dịch hoàn nguyên anti-B: 0,02% Tartrazine (0,0002 g/ml)+ 0,01% sodium azide + 10mM EDTA + 0,9% NaCl Kháng thể kháng B sau tủa amonium sulfate hoàn nguyên vào dung dịch hoàn nguyên kháng thể kháng B Kháng thể B sau hoàn nguyên dung dịch tạo thành màu vàng, suốt không vẩn cặn (Hình 3.14) 49 AB Hình 3.14 Kháng thể kháng B (anti-B) hoàn nguyên dung dịch hoàn nguyên màu vàng A dung dịch chứa kháng thể B (anti-B); B dung dịch dùng hoàn nguyên kháng thể B Sinh phẩm B (anti-B) sau tạo kiểm tra khả ngưng kết với loại hồng cầu mẫu A, B, O so sánh với sinh phẩm đối chứng (anti-B, Biorad) Kết Hình 3.15 cho thấy sinh phẩm B gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mẫu B với cường độ phản ứng 3+, tính kháng thể quan sát trước 10 giây Đối chứng dương huyết mẫu anti-B Biorad cho cường độ phản ứng 4+ B A Hình 3.15 A Phản ứng ngưng kết sinh phẩm B với hồng cầu mẫu A, B O; B Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã chọn dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B tốt dòng B4D10C9 với hiệu giá kháng thể đạt 27 Đã đánh giá khả sinh trưởng sản xuất kháng thể dòng tế tế bào lai B4D10C9 Dòng tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng tốt môi trường DMEM+10% FBS, mật độ tế bào tối đa đạt nuôi cấy tĩnh 9,9.105 tế bào/ml sau 50 hiệu giá kháng thể cao đạt 29 sau khoảng 100 nuôi cấy Kháng thể đơn dòng kháng B xác định thuộc phân lớp IgM, chuỗi nhẹ kappa Sinh phẩm B tạo gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mẫu B với cường độ phản ứng 3+, tính kháng thể quan sát trước 10 giây Kiến nghị Thử nghiệm kháng thể kháng B với mẫu máu toàn phần, số lượng mẫu đủ lớn có so sánh với sinh phẩm sử dụng để khẳng định chất lượng kháng thể Tiếp tục phát triển nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng kháng A để hoàn thiện sinh phẩm xác định nhóm máu ABO 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phương, Đỗ Khắc Hiếu, Hà Thị Thu, Đinh Thương Vân, Đinh Duy Kháng, Lê Trần Bình (2008), “Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm sú”, Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(2): 203-208 Lê Quang Huấn Lã Thị Huyền (2009), “Kháng thể tái tổ hợp ứng dụng” NXB Khoa học công nghệ, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh Abhyankar A (2012), “Indigenously developed monoclonal antibody specific for human blood group B” Journal of Hematological Malignancies, 2(2), p ATTC (2011), “Animal Cell Culture Basic: Tips and techniques for continuous cell line” Aymard JP (2012), “Karl Landsteiner (1868–1943) and the discovery of blood groups”, Transfus Clin Biol, 19(4-5), P.244 -248 Berger M (2002), “Therapeutic applications of monoclonal antibodies”, The American Journal of the Medical Sciences, 324(1), p.14-30 Borrebaeck CA (2000), “Antibodies in diagnostics - from immunoassays to protein chips”, Immunology Today, 21(8), p.379 – 382 Committee I (2012) “Footpad Injections Guidelines in Mice and Rats” the University of North Carolina at Chapel Hill Council N (1999), “Monoclonal Antibody Production” National Academy Press, Washington 10 Fouad (2005), “Production of a new anti-A monoclonal reagent”, African Journal of Bioteachnology, 4(8), p.3 11 Fulle A (1992), “Immunization of Mice” Current Protocols in Molecular Biology 12 Greenfield E.A (2014), “Antibodies: A laboratory manual, second edition”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 13 Iyer YS (2006), “Production of murine monoclonal anti-B”, Indian Journal 52 Medicin Research, 123(4), p 561 14 Izumi K, (2001), “Antigen–Antibody Binding”, Encyclopedia of life science 15 John B Zabriskie (2009), “Essential Clinical Immunology”, Cambridge University Press, United Kingdom 16 Khan F (2002), “Lectins as markers for blood grouping”, Medical Science Monitor, 8(12), p.293-300 17 Martine L (2001), “Molecular characterization of a monoclonal murine antiblood group A antibody”, Immunology Letters, 76(1), 18 Mika K,(2003), “Molecular characterization of a human monoclonal antibody to B antigen in ABO blood type”, Immunology Letters, 86(1), pp 45-51 19 Laura D (2005), “Chapter Blood and the cells it contain, Blood groups and red cell antigens”, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) 20 Laura D (2005), “Chapter Blood group antigen are surface marker on the red blood cell membrane Blood groups and red cell antigens”, National Center for Biotechnology Information, Bethesda (MD) 21 Lundblad AK (1963), “Monoclonal antibody formulation for diagnostic use”, US 4618486 22 Parham, P (2009), “The Immune System, third edition”, Garland Science 23 Pandey, S (2013), “Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies” International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research, 1(2): p 24 Pelegrin M (2004), Monoclonal antibody-based genetic immunotherapy, Current Gene Therapy Journal, 4(3), p.347 – 356 25 Shinya S (2014), “Routes of Administration” The Laboratory Mouse, National Institute of Animal Health, Tsukuba, Japan 26 Kamala T (2007), “Hock immunization: A humane alternative to mouse footpad injections”, J Immunol Methods, 328(1-2), p.204–214 27 Wang, S (2011), “Advances in the production of human monoclonal antibodies” Antibody Technology Journal, 2001(1): pp 1-4 28 Blood transfusion http://www.medicinenet.com/blood_transfusion/article.htm, 29/2/2016 53 29 International Society of Blood Transfusion (2014) http://www.isbtweb.org, 29/2/2016 30 A Report of the Committee on Methods of Producing Monoclonal Antibodies Institute for Laboratory Animal Research National Research Council, "Monoclonal Antibody Production", National Academy Press, 1999 http://grants.nih.gov/grants/policy/antibodies.pdf 26/09/2016 54 ... cầu số lượng tế b o  Công nghệ tế b o lai sản xuất kháng thể đơn dòng Tế b o lai tế b o tạo sau trình dung hợp tế b o có chức sinh tổng hợp sản phẩm mong muốn Tạo tế b o lai sản xuất kháng thể. .. [15]  B t tử tế b o B sản xuất kháng thể đơn dòng B t tử tế b o B thực công nghệ lai tế b o công nghệ EBV (Epstein-Barr virus) Với công nghệ lai tế b o, dung hợp tế b o lympho B miễn dịch tế b o. .. Chuẩn b tế b o 23 2.2.3 Nuôi cấy tế b o myeloma 24 2.2.4 Dung hợp tạo dòng tế b o lai 24 2.2.5 Sàng lọc tế b o lai 26 2.2.6 Tách dòng tế b o lai đơn sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên