3.2.2.1. Tách hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của chuột đã gây miễn dịch bằng hồng cầu B
Thực hiện quy trình tách hỗn hợp tế bào lympho B từ hạch bẹn và lách của chuột (đã gây miễn dịch bằng hồng cầu B) như đã trình bày ở mục 2.2.4. Xác định số tế bào sống trong hỗn hợp tế bào thu được bằng cách nhuộm với trypan blue và đếm bằng buồng đếm. Kết quả thu được 5 ml hỗn hợp tế bào với mật độ tế bào khoảng 1,9 – 2,4 x 106 tế bào/ml đối một con chuột gây miễn dịch.
39
3.2.2.2. Dung hợp giữa tế bào myeloma sp2/0 và hỗn hợp tế bào giàu tế bào lympho B tách từ chuột gây miễn dịch bởi hồng cầu mẫu B
Hỗn hợp tế bào lympho được tách từ các tổ chức giàu tế bào lympho B như lách và hạch bẹn của các chuột đã được gây miễn dịch bởi hồng cầu B được dung hợp với tế bào myeloma sp2/0. Quần thể tế bào lai được nuôi trong môi trường chọn lọc HAT, quan sát sự sinh trưởng của các tế bào lai ở các giếng nuôi cấy dưới kính hiển vi soi ngược truyền qua. Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy rằng, hiệu suất tạo tế bào lai khá cao, đến 89,9 ± 3,0%, với tỷ lệ này chúng tôi rất hy vọng sẽ sàng lọc được các vị trí sinh kháng thể đặc hiệu. Việc tế bào lai được hình thành với một tỷ lệ rất cao chỉ thể giải thích là do chúng tôi đã chọn được thời điểm thích hợp để tế bào lympho B dung hợp với myeloma.
Bảng 3.2. Số giếng hình thành tế bào lai từ thí nghiệm dung hợp hỗn hợp tế bào lympho giàu tế bào lympho B tách từ lách và hạch bẹn chuột gây miễn dịch bằng
hồng cầu mẫu B với tế bào myeloma sp2/0
Lần thí nghiệm Tổng số giếng
Hình thành tế bào lai
Số lượng Tỷ lệ %
1 384 310 80,7
2 384 345 89,8
3 384 380 98,9
Tổng số 1152 1035
Trung bình 345 ± 12 89,9 ± 3,0
40 A
B
C D
Hình 3.2. Ảnh chụp tế bào lai quan sát dưới kính hiển vi soi ngược (độ phóng đại 200 lần: vật kính 10x, thị kính 20x, máy ảnh 5x).
A. sau 2 ngày nuôi; B. sau 4 ngày nuôi; C. sau 6 ngày nuôi;
D. sau 10 ngày nuôi tế bào sau dung hợp trong môi trường HAT/HT
Sự phát triển của tế bào lai sau dung hợp được quan sát dưới kính hiển vi soi ngược truyền qua và chụp ảnh (Hình 3.2). Sau 2 ngày dung hợp tế bào lai đã được hình thành (Hình 3.2A); sau 4 ngày nuôi các tế bào này phát triển thành một cụm to hơn, số lượng tế bào nhiều hơn (Hình 3.2B); các tế bào tiếp tục phát triển và được quan sát ở các ngày tiếp theo (Hình 3.2C, D). Tùy vào tốc độ phát triển của tế bào lai, sau 4-6 ngày thì môi trường HAT được thay thế bằng HT. Sau 10 ngày nuôi cấy, tế bào lai đã phát triển thành một cụm lớn gồm rất nhiều tế bào và bị phân tán do tác động cơ học trong quá trình thay thế môi trường.
41
3.2.2.3. Nghiên cứu sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể kháng kháng nguyên B Dịch nuôi từ 1035 giếng chứa tế bào lai được kiểm tra với hồng cầu mẫu A, B và O. Kết quả, dịch nuôi tại 5 giếng B4D6, B4D10, B8D11, B8F6, B4H6 chỉ gây kết hồng cầu B mà không gây ngưng kết hồng cầu A và hồng cầu O. Tế bào trong các giếng này được cấy chuyển sang các giếng của đĩa 24 giếng để tiến hành thí nghiệm phân lập tế bào lai đơn.
Hình 3.3. Minh họa 5 giếng chứa dịch nuôi cấy gây ngưng kết hồng cầu mẫu B mà không gây ngưng kết hồng cầu mẫu A và O
Phân lập tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết đặc hiệu kháng nguyên B
Bằng phương pháp pha loãng giới hạn 3 nồng độ như đã mô tả ở phần phương pháp, 10 dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B được phân lập (Hình 3.3). Các dòng tế bào lai đơn gồm: B4D6C6, B4D6E2, B4D10C9, B4D10B6, B4D10D5, B4D10D6, B4D10E4, B4H6C5, B8F6B6, B8F6D4.
42
Hình 3.4. Sàng lọc tế bào lai đơn sinh mAb gây ngưng kết hồng cầu mẫu B Khả năng sản xuất kháng thể từ các dòng tế bào đơn được xác định thông qua hiệu giá kháng thể trong dịch nuôi. Hầu hết các tế bào đều sinh kháng thể có hiệu giá cao hơn 1/64, riêng dòng tế bào B4D10C9 sinh kháng thể có hiệu giá 1/256 (Hình 3.5). Dòng tế bào đơn B4D10C9 được lựa chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.5. Hiệu giá kháng thể của các dòng tế bào lai đơn tiết mAb gây ngưng kết hồng cầu B
3.2.2.4. Khả năng sinh trưởng của tế bào B4D10C9
Khi nuôi dòng tế bào lai B4D10C9 với mật độ ban đầu 105 tế bào/ml trong môi trường chứa 10% FBS thì không quan sát thấy pha tiềm phát và pha cân bằng
43
trong đường cong sinh trưởng của dòng tế bào lai này (Hình 3.6). Mật độ tế bào tối đa đạt 9,9.105 tế bào/ml sau 50 giờ nuôi, tốc độ sinh trưởng trung bình 0,030 h-1, sau đó số lượng tế bào sống giảm dần và tế bào chết hầu hết sau khoảng 150 giờ. Dòng tế bào lai B4D10C9 nuôi trong môi trường chứa 1% FBS thì tế bào vẫn tăng sinh nhưng thời gian pha tiềm phát kéo dài và không quan sát được pha cân bằng trong đường cong sinh trưởng. Mật độ tế bào tối đa đạt 3,4.105 tế bào/ml sau khoảng 72 giờ nuôi, tốc độ sinh trưởng trung bình 0,011 h-1. Toàn bộ tế bào chết sau 140 giờ nuôi. Trong khi dòng tế bào.Mật độ tế bào giảm dần sau 50 giờ nuôi và chết gần hết sau 150 giờ nuôi (Hình 3.6).
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mật độ tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng trong môi trường DMEM +10% FBS và DMEM+1% FBS theo thời gian
3.2.2.5. Khả năng sản xuất mAb kháng kháng nguyên B của dòng tế bào lai B4D10C9
Kháng thể được sản xuất bởi dòng tế bào B4D10C9 trong suốt quá trình sinh trưởng của tế bào và đạt cực đại vào cuối pha suy vong. Dòng tế bào B4D10C9 được nuôi trong môi trường chứa 10% FBS thì hiệu giá kháng thể cực đại trong dịch nuôi đạt 1/512. Còn khi nuôi dòng tế bào này trong môi trường chứa 1%FBS thì hiệu giá kháng thể cực đại đạt 1/64 (Hình 3.7).
Thời gian nuôi x 105 tế bào sống/ml
44
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn hiệu giá kháng thể theo thời gian của dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trong môi trường DMEM+1%FBS và DMEM+10% FBS
3.2.2.6. Xác định độ đặc hiệu mAb do B4D10C9 sản xuất
Hình 3.8 trình bày kết quả phản ứng ngưng kết giữa dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 với hồng cầu mẫu A, B, O. Dịch nuôi tế bào B4D10C9 chỉ gây ngưng kết hồng cầu B mà không gây ngưng kết hồng cầu A và O. Kết quả này tương tự phản ứng giữa anti-B (biorad) với các hồng cầu mẫu A, B, O. Trong khi môi trường DMEM+10% FBS không gây ngưng kết với bất kỳ hồng cầu mẫu nào đem kiểm tra.
3.2.2.7. Cường độ và ái tính mAb do B4D10C9 sản xuất với hồng cầu mẫu B Độ nhạy của kháng thể được đánh giá qua cường độ và ái tính. Nếu kháng thể có độ nhạy cao đồng nghĩa với cường độ phản ứng cao và ái tính cao. Ái tính của kháng thể trong dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 được xác định bằng phản ứng ngưng kết giữa dịch nuôi và hồng cầu mẫu B 10%. Sau khoảng 3,5 giây để có thể nhận biết được dấu hiệu đầu tiên của phản ứng ngưng kết trong khi anti-B (Biorad) mất khoảng 1 giây.
Hiệu giá kháng thể
Thời gian nuôi cấy, giờ
45
Hình 3.8. Phản ứng ngưng kết đặc hiệu hồng cầu B của mAb do tế bào lai B4D10C9 sinh ra. Hàng ngang 1, 2, 3: Hồng cầu mẫu A, B, O tương ứng. Cột dọc
1, 2, 3: môi trường DMEM+10% FBS (đối chứng âm), anti-B (đối chứng dương), dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 tương ứng
Cường độ đánh giá độ mạnh của phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên- kháng thể và được xác định bằng phản ứng ngưng kết giữa dịch nuôi tế bào lai B4D10C9 và hồng cầu mẫu B 10% trên phiến kính. Sau 5 phút phản ứng, cường độ phản ứng ngưng kết giữa dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 và hồng cầu mẫu B 10% là 2+ vì có nhiều cụm ngưng kết và dịch đục. Trong khi cường độ phản ứng ngưng kết giữa anti-B (Biorad) và hồng cầu mẫu B 10% là 3+. Thông qua đánh giá về ái tính kháng thể và cường độ của phản ứng ngưng kết hồng cầu nhận thấy kháng thể có trong dịch nuôi dòng tế bào lai B4D10C9 có độ nhạy trung bình (Hình 3.9).
Hình 3.9. Phản ứng ngưng kết hồng cầu trên phiến kính xác định ái tính mAb do dòng tế B4D10C9 sinh ra với hồng cầu mẫu B
3.2.2.8. Xác định phân lớp mAb do dòng tế bào B4D10C9 sinh ra
46
Kháng thể kháng B do dòng tế bào B4D10C9 cũng được xác định phân lớp kháng thể bằng phương pháp ELISA. Một phiến nhựa đã được phủ một lớp kháng thể anti-mouse chuỗi nặng (anti-IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA và IgM) hoặc kháng thể chuỗi nhẹ (kappa hoặc lambda). Kết quả ở Hình 3.10 cho thấy tại các vị trí F và G có phản ứng xảy ra, màu của dung dịch tại các giếng này từ không màu chuyển thành vàng và vàng nhạt.
Hình 3.10. Phản ứng ELISA xác định phân lớp kháng thể do dòng tế bào B4D10C9 sản xuất
Đối chiếu với bảng của bộ kit Pierce® Rapid ELISA mouse mAb isotyping kit ta thấy hai vị trí này tương ứng với kháng thể kháng B chứa chuỗi nặng IgM và chuỗi nhẹ kappa. Tiến hành xác định đo giá trị OD tại các vị trí này đo được ở bước sóng 450 nm thì thu được kết quả có hai vị trí cho giá trị OD450> 0,2 tương ứng với hai vị trí đổi màu quan sát được. Như vậy, kháng thể do dòng tế B4D10C9 sản xuất có phân lớp chuỗi nặng là IgM và phân lớp chuỗi nhẹ là kappa.
Phản ứng Elisa này không chỉ xác định isotype kháng thể mà còn là một phương pháp để kiểm chứng xem dòng tế bào lai đã đơn dòng hay chưa. Cơ chế kiểm soát sự tái sắp xếp gen globulin miễn dịch để chắc chắn rằng một tế bào đơn không thể sản xuất hai chuỗi nhẹ, cơ chế kiểm soát gen chuỗi nặng và cắt ARN cho phép một dòng tế bào đơn có thể sản xuất nhiều chuỗi nặng. Tuy nhiên, đối với tế bào lai hầu như chỉ tiết một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ. Việc một dòng tế bào lai sản xuất hai chuỗi nhẹ và nhiều chuỗi nặng rất hiếm khi xảy ra và việc phát hiện nhiều chuỗi nặng có thể dòng tế bào lai mong muốn có lẫn với các dòng tế bào lai khác. Theo kết quả thu được, dòng tế bào lai B4D10C9 chỉ sản xuất một chuỗi nặng và một chuỗi nhẹ như vậy dòng tế bào B4D10C9 chắc chắn là đơn dòng và chỉ sản xuất kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng nguyên B.
A B C D E F G H
47
3.2.2.9. Cô đặc dung dịch kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B
Dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 có chứa kháng thể kháng kháng nguyên B cùng với các protein và kháng thể có nguồn gốc từ huyết thanh bò (FBS). Tuy nhiên, khi kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể có trong dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 với bộ hồng cầu mẫu A+, B+, O+ thì kháng thể trong dịch nuôi cấy chỉ nhận diện đặc hiệu kháng nguyên B trên màng hồng cầu. Do vậy dịch nuôi cấy chứa kháng thể kháng kháng nguyên B có lẫn tạp với các protein và huyết thanh của bò không ảnh hưởng đến độ đặc hiệu của kháng thể kháng nguyên B. Như vậy, có thể sử dụng trực tiếp dịch nuôi cấy tế bào lai B4D10C9 để làm thuốc thử xác định nhóm máu B. Tuy nhiên trong các bộ sinh phẩm xác định nhóm máu được thương mại trên thị trường, để phân biệt giữa các kháng thể kháng A, kháng B hay kháng AB đều được trộn với dung dịch chất màu khác để phân biệt. Do vậy chúng tôi phải tiến hành loại bỏ màu của phenol đỏ trong dịch nuôi cấy tế bào trước khi tạo màu cho dịch kháng thể. Để loại bỏ phenol red chúng tôi tiến hành sử dụng phương pháp tủa với ammonium sulfate 50% là phương pháp đơn giản và dễ dàng nhất.
Kháng thể kháng B trong dịch nuôi cấy được thu lại bằng cách tủa với ammonium sulfate 50% bão hòa (Hình 3.11).
Hình 3.11. Dịch nuôi cấy tế bào B4D10C9 trước và sau khi tủa ammonium sulphate Dịch kháng thể sau khi tủa được kiểm tra phản ứng ngưng kết trên phiến kính với hồng cầu mẫu A và B để đánh giá lại độ đặc hiệu của kháng thể. Kết quả nhận được kháng thể sau tủa đã ngưng kết rất tốt với hồng cầu mẫu B. Tuy nhiên khi hoàn nguyên về thể tích ban đầu thì dịch kháng thể thể hiện cường độ phản ứng thấp hơn dịch nuôi cấy. Khi hoàn nguyên với thể tích 1/5 ban đầu thì cường độ phản
48
ứng cao hơn cường độ nhận được từ dịch nuôi cấy (Hình 3.12).
Hình 3.12. Cường độ phản ứng của kháng thể kháng B trước và sau khi tủa
Có thể thấy rằng, kháng thể trước hay sau khi tủa với ammonium sulphate đều chỉ phản ứng đặc hiệu với hồng cầu mẫu B. Tuy nhiên vơi dịch tủa sau khi hòa bẳng thể tích ban đầu thì cường độ giảm có thể là do trong quá trình tủa thì thì có một phần hàm lượng kháng thể bị mất đi hoặc có thể trong dịch nuôi cấy tế bào có bổ sung FBS mà thành phần chính của FBS là BSA, BSA lại có tương tác với kháng nguyên kháng thể mà sau khi hàm lượng BSA giảm đi thì ảnh hưởng đến cường độ ngưng kết của phản ứng kháng nguyên-kháng thể.
Tế bào B4D10C9 được nuôi cấy đến pha suy vong thì dịch nuôi cấy được thu lại. Hiệu giá kháng thể trong dịch nuôi cấy đạt 28, hàm lượng kháng thể tương đương 50 àg/ml. 2200 ml dịch nuụi cấy chứa hàm lượng cao khỏng thể khỏng B được thu lại bằng tủa với ammonium sulphate 50% bão hòa. Hiệu giá kháng thể trong dịch cô đặc là 29 và cường độ phản ứng của dịch kháng thể kháng B là 4+
(Hình 3.13)
Hình 3.13. Phản ứng ngưng kết hồng cầu của kháng thể kháng B thu được sau khi tủa bằng ammonium sulphate
49
3.2.2.10. Tạo sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên B
Sau khi cô đặc, các kháng thể được hoàn nguyên vào dung dịch bảo quản protein. Dung dịch hoàn nguyên kháng thể là dịch không màu nên khó theo dõi trong quá trình xét nghiệm. Để tránh nhầm lẫn trong quá trình thực nghiệm, các màu xanh và màu vàng đã được dùng để đánh dấu màu trong các huyết thanh mẫu dùng để xác định nhóm máu ABO. Theo đó, màu xanh được dùng để đánh dấu thuốc thử anti-A, màu vàng được dùng để đánh dấu thuốc thử anti-B. Theo công bố trong sáng chế WO 2012083361 thì màu xanh được hình thành từ chất patent blue V, màu vàng được hình thành từ chất tartrazine. Tartrazine là chất màu có 2 gốc axit liên kết với nhau, 2 gốc sulphonic và một gốc carboxylic. Nó cũng tích điện âm trong nước do vậy có ái lực yếu với cellulose và polyester. Khi chất màu được trộn với dịch chứa kháng thể nó có thể hòa tan nhanh chóng tạo thành một dung dịch trong suốt và có màu.
Kháng thể có bản chất là protein nên trong điều kiện bảo quản và sử dụng dễ dàng bị tấn công và phân hủy bởi các protease. Để bảo quản chúng, sodium azide với hàm lượng là 0,01% được bổ sung vào dung dịch bảo quản kháng thể. Phản ứng ngưng kết hồng cầu xảy ra hiệu quả trong môi trường muối có nồng độ ion thấp, thông thường là sử dụng dung dịch nước muối sinh lý. Do đó sodium chloride với nồng độ cuối cùng là 0,9% hoặc sử dụng đệm phosphate (PBS) được sử dụng trong dung dịch bảo quản kháng thể. Để tạo môi trường phản ứng ngưng kết hồng cầu tốt nhất, EDTA là một chất chống đông máu, làm ổn định hồng cầu cũng được sử dụng trong thành phần của dịch hoàn nguyên kháng thể. Nồng độ cuối cùng của EDTA trong dung dịch là 10 mM.
Thành phần dung dịch hoàn nguyên anti-B: 0,02% Tartrazine (0,0002 g/ml)+
0,01% sodium azide + 10mM EDTA + 0,9% NaCl. Kháng thể kháng B sau khi tủa bằng amonium sulfate sẽ được hoàn nguyên vào dung dịch hoàn nguyên kháng thể kháng B. Kháng thể B sau khi được hoàn nguyên bằng dung dịch tạo thành màu vàng, trong suốt không vẩn cặn (Hình 3.14).
50
A B
Hình 3.14. Kháng thể kháng B (anti-B) được hoàn nguyên trong dung dịch hoàn nguyên màu vàng. A. dung dịch chứa kháng thể B (anti-B); B. dung dịch dùng hoàn
nguyên kháng thể B
Sinh phẩm B (anti-B) sau khi được tạo ra được kiểm tra khả năng ngưng kết với 3 loại hồng cầu mẫu A, B, O và so sánh với sinh phẩm đối chứng (anti-B, Biorad). Kết quả ở Hình 3.15 cho thấy sinh phẩm B gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mẫu B với cường độ phản ứng 3+, ái tính của kháng thể quan sát được trước 10 giây. Đối chứng dương là huyết thanh mẫu anti-B của Biorad cho cường độ phản ứng 4+.
A B
Hình 3.15. A. Phản ứng ngưng kết của sinh phẩm B với hồng cầu mẫu A, B và O;
B. Lọ sinh phẩm kháng thể đơn dòng kháng B
51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
1. Đã chọn được dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên B tốt nhất là dòng B4D10C9 với hiệu giá kháng thể đạt 27.
2. Đã đánh giá được khả năng sinh trưởng và sản xuất kháng thể của dòng tế tế bào lai B4D10C9. Dòng tế bào lai B4D10C9 sinh trưởng tốt trong môi trường DMEM+10% FBS, mật độ tế bào tối đa đạt được trong nuôi cấy tĩnh là 9,9.105 tế bào/ml sau 50 giờ và hiệu giá kháng thể cao nhất đạt được là 29 sau khoảng 100 giờ nuôi cấy.
3. Kháng thể đơn dòng kháng B được xác định thuộc phân lớp IgM, chuỗi nhẹ kappa.
4. Sinh phẩm B được tạo ra gây ngưng kết đặc hiệu hồng cầu mẫu B với cường độ phản ứng 3+, ái tính của kháng thể quan sát được trước 10 giây
Kiến nghị
1. Thử nghiệm kháng thể kháng B với các mẫu máu toàn phần, số lượng mẫu đủ lớn và có so sánh với sinh phẩm hiện đang được sử dụng để khẳng định chất lượng của kháng thể.
2. Tiếp tục phát triển nghiên cứu và sản xuất được kháng thể đơn dòng kháng A để hoàn thiện bộ sinh phẩm xác định nhóm máu ABO.