Chuột BALB/c là chuột thuần chủng được sử dụng phổ biến trong nghiên
36
cứu ung thư và miễn dịch học. Chuột BALB/c có khả năng sản xuất u tương bào khi gây đáp ứng miễn dịch với tá chất dầu khoáng để sản xuất kháng thể đơn dòng (BALB/c, 2007). Chuột BALB/c dễ nhân giống, tỷ lệ mắc ung thư rất thấp nhưng chúng rất nhạy cảm với các chất gây ung thư và có thể hình thành các khối u phổi, u thận và nhiều loại khối u khác.
Có nhiều con đường đưa kháng nguyên vào cơ thể chuột nhằm kích thích hệ miễn dịch của chuột sinh kháng thể: tiêm dưới da, tiêm trong da, tiêm cơ, tiêm vào xoang bụng, tiêm tĩnh mạch, tiêm não, tiêm ngực, tiêm mũi. Trong đó, tiêm dưới da, tiêm xoang bụng, tiêm bắp và tiêm tĩnh mạch thường được sử dụng để đưa dung dịch cơ chất hoặc huyền phù vào trong chuột. Hồng cầu là kháng nguyên hữu hình do vậy không thể sử dụng phương pháp tiêm tĩnh mạch để gây miễn dịch cho chuột.
Đường vào của kháng nguyên sẽ quyết định cơ quan miễn dịch nào và quần thể tế bào nào sẽ tiếp xúc với chúng để tham gia vào sự hình thành đáp ứng miễn dịch.
Kháng nguyên đưa vào theo đường tĩnh mạch sẽ được chuyển đến lách đầu tiên còn kháng nguyên tiêm dưới da sẽ chuyển đến hạch lympho. Sự khác biệt của các quần thể lympho cư trú trong các cơ quan này sẽ tạo nên sự khác nhau về chất lượng của đáp ứng miễn dịch. Dựa trên việc xác định hiệu giá kháng thể trung bình khi gây miễn dịch chuột nhằm tìm được vị trí gây đáp ứng miễn dịch hiệu quả nhất. Từ đó lựa chọn được phương pháp hiệu quả nhất.
Sau quá trình gây miễn dịch cho chuột bằng cách tiêm vào hai gan bàn chân chuột, tiêm xoang bụng và tiêm bắp. Chuột được nuôi, chăm sóc và theo dõi các triệu chứng. Kết quả dù chuột được gây miễn dịch theo con đường nào thì cũng hoạt động, ăn và ngủ bình thường tương tự như các chuột không gây miễn dịch. Kết quả hiệu giá kháng thể trong máu chuột được trình bày ở Bảng 3.1.
Kết quả ở Bảng 3.1 cho thấy đáp ứng miễn dịch bắt đầu hình thành sau lần gây miễn dịch đầu tiên, tăng mạnh sau khi gây miễn dịch lần 2 và tiếp tục tăng trong thời gian theo dõi (20 ngày). Ở những chuột được gây miễn dịch dưới da gan bàn chân có hiệu giá kháng thể tăng nhanh hơn so với tiêm bắp và tiêm xoang bụng.
Chứng tỏ việc tiêm kháng nguyên vào gan bàn chân chuột sẽ kích thích các tế bào
37
lympho B của chuột nhanh hơn, hiệu quả hơn. Lundblad, (1963) đã sử dụng hồng cầu tiêm hai lần liên tiếp vào phúc mạc chuột để chuột tạo tế bào lympho B sản xuất kháng thể. Trong khi Lennox, (1982) dùng hồng cầu trộn với tá chất hoàn toàn tiêm lần đầu, hai lần sau dùng tá chất không hoàn toàn để tiêm vào phúc mạc chuột [20, 21].
Bảng 3.1. Biến động hiệu giá kháng thể trung bình khi gây miễn dịch theo các con đường khác nhau
Đường tiêm
Hiệu giá kháng thể (số lần pha loãng)
3 ngày 6 ngày 10 ngày 14 ngày 20 ngày Dưới da 5,3 ± 2,3 10,7 ± 4,6 42,7±18,5 53,3±18,5 64,0±0 Xoang bụng 4,0 ± 0 10,7 ± 4,6 21,3 ± 9,2 26,7 ± 9,2 42,7±18,5
Tiêm bắp 3,3 ± 1,2 6,7 ± 2,3 13,3 ± 4,6 16,0±0 21,3±9,2 Tuy nhiên, việc tiêm kháng nguyên vào gan bàn chân chuột sẽ làm cho các chuột đau đớn và khó di chuyển hơn các vị trí tiêm khác. Theo các tổ chức bảo vệ động vật và tổ chức y đức thì việc tiêm kháng nguyên vào gan bàn chân chuột không được khuyến cáo. Nhưng do hiệu quả của thí nghiệm nên cách gây miễn dịch bằng tiêm dưới da gan bàn chân chuột BALB/c để thu được các tổ chức lympho giàu tế bào lympho B sinh kháng thể kháng B đã được lựa chọn.
3.2. Nghiên cứu tạo tế bào lai giữa myeloma và tế bào lympho B chuột 3.2.1. Nuôi cấy tế bào đại thực bào để tạo lớp tế bào nền
Khi nuôi cấy tế bào lai, người ta thường sử dụng lớp tế bào nền là các tế bào đại thực bào. Lớp tế bào này sẽ tiết các cytokine thúc đẩy quá trình dung hợp cũng như sự phát triển của tế bào lai từ một tế bào. Các tế bào đại thực bào có mặt ở các xoang của cơ thể, đặc biệt là xoang bụng. Chúng ta có thể dễ dàng thu nhận các tế bào đại thực bào từ xoang bụng của chuột. Các tế bào đại thực bào là các tế bào đã
38
biệt hóa hoàn toàn do vậy nó không có khả năng nhân lên khi nuôi cấy in vitro. Do đó, sự sinh trưởng của tế bào đại thực bào không ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào lai. Ở điều kiện nuôi tĩnh, các tế bào đại thực bào bám dính vào bề mặt của dụng cụ nuôi tạo thành các tế bào hình sợi hoặc hình sao.
Hình 3.1 cho thấy sau 2 ngày nuôi cấy, tế bào đại thực bào đã hồi phục và sinh trưởng, một số tế bào bám dính vào bề mặt chai nuôi nên có dạng hình sao hoặc dài thuôn hai đầu, một số tế bào chết hoặc đang phân chia hoặc các tế bào khác vẫn tồn tại ở dạng tự do nên có hình cầu.
Hình 3.1. Hình ảnh tế bào đại thực bào khi nuôi cấy tĩnh