CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.10. Đánh giá kháng thể do tế bào lai sản xuất
Xác định hiệu giá kháng thể
Xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngưng kết trên đĩa 96 giếng đáy chữ V. Bổ sung 25 l nước muối sinh lý vào mỗi giếng đĩa 96 đáy chữ V. Sau đó, bổ sung 25 l dịch nuôi cấy vào giếng đầu tiên của 1 hàng, trộn đều dịch nuôi cấy với nước muối sinh lý trong giếng sau đó chuyển 25 l từ giếng đầu sang giếng thứ 2, làm tương tự cho đến giếng cuối của hàng đó thì bỏ đi 25 l (kháng thể được pha loóng theo cơ số 2). Bổ sung 25 àl hồng cầu mẫu 2% vào mỗi giếng và để ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, quan sát kết quả.
Xác định độ đặc hiệu của kháng thể
Độ đặc hiệu của dịch nuôi cấy tế bào lai được xác định bằng phản ứng ngưng kết của nó chống lại panel hồng cầu của nhóm máu ABO. Dịch nuôi cấy tế bào lai, môi trường nuôi cấy DMEM+10% FBS (đối chứng âm) và huyết thanh mẫu anti-A của Biorad (đối chứng dương) được làm phản ứng ngưng kết trên đĩa 96 giếng đáy chữ V đồng thời với cả hồng cầu mẫu A, B và O. Phân tích kết quả đánh giá độ đặc hiệu của kháng thể do tế bào lai sản xuất.
32
Xác định độ nhạy (cường độ và ái tính của kháng thể)
Ái tính được đánh giá thông qua thời gian cần thiết (giây) để có thể bắt đầu quan sát phản ứng ngưng kết bằng mắt thường. Độ mạnh của phản ứng kháng nguyên – kháng thể được xác định như sau [20]:
(+) có một mảng ngưng kết và dịch trong
(3+) có một vài mảng ngưng kết và dịch trong
(2+) một vài mảng ngưng kết nhỏ và dịch đục
(1+) nhiều mảng ngưng kết và dịch đục
(-) không ngưng kết
Ái tính kháng thể và độ mạnh của phản ứng kháng nguyên - kháng thể được xác định bằng cách nhỏ một giọt dịch nuôi cấy chứa kháng thể lên một tấm kính sạch, bổ sung một giọt hồng cầu mẫu 10% và trộn đều, bắt đầu bấm giờ cho đến khi quan sát được tín hiệu đầu tiên của phản ứng ngưng kết kháng nguyên - kháng thể.
Sau 5 phút thì tiến hành đánh giá độ mạnh của phản ứng kháng nguyên - kháng thể.
2.2.11. Cô đặc kháng thể bằng ammonium sulfate
Nguyên lý
Tủa ammonium sulfate là phương pháp thường được sử dụng để làm giàu và cô đặc kháng thể trong huyết thanh, dịch báng hoặc dịch nuôi cấy tế bào [10].
Quy trình
Dịch nuôi cấy tế bào lai được tủa với ammonium sulfate đến nồng độ cuối cùng là 50%. Bổ sung từ từ dung dịch ammonium sulfate bão hòa 100% vào dịch nuôi cấy tế bào lai theo tỉ lệ 1:1, sử dụng khuấy từ để ammonium sulfate và dịch nuôi cấy tế bào trộn đều với nhau (quá trình này tiến hành ở trên đá, 4oC). Sau khi bổ sung hết ammonium sulfate bão hòa 100% vào dịch nuôi cấy tế bào tạo thành dung dịch đồng nhất, tủa dung dịch ở 4oC trong 3h hoặc qua đêm. Ly tâm 8000 rpm trong 20 phút để thu tủa. Rửa tủa 2 lần với ammonium sulfate bão hòa 50%. Tủa sau đó được tái huyền phù bằng 1/5 thể tích ban đầu trong PBS 1x, bổ sung 0,01%
sodium azide. Dịch kháng thể được bảo quản ở 4oC.
33 2.2.12. Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu B
Kháng thể B sau tinh sạch được sử dụng để tạo sinh phẩm với thành phần như sau: 0,0035% patent blue V sodium salt; EDTA 10mM; 0,01% sodium azide pha trong đệm PBS 1X pH=7,8.
34
Sơ đồ nghiên cứu Gây miễn dịch trên chuột
BALB/c bằng hồng cầu mẫu B
Nuôi cấy tế bào myeloma
Chuẩn bị tế bào nền
(Đại thực bào từ xoang bụng chuột) Dung hợp tạo tế bào lai
Nuôi cấy tế bào lai
Sàng lọc tế bào lai bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu mẫu A,B,O
Tách dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng (bằng phương pháp pha loãng tới hạn)
Định loại globulin miễn dịch và kiểm tra tính đơn dòng của tế bào lai
(bằng ELISA) Đánh giá tốc độ sinh trưởng và sản xuất
kháng thể của tế bào lai (bằng phương pháp đếm tế bào)
Đánh giá mAb do tế bào lai sản xuất
Cường độ và ái tính
Độ nhạy
Cô đặc kháng thể (bằng phương pháp tủa ammonium sulfate) Tạo sinh phẩm xác định nhóm máu B
Thu hỗn hợp giàu tế bào lympho B từ hạch lách chuột
Đánh giá khả năng sinh mAb của các dòng tế bào lai đơn
(Hiệu giá kháng thể) Đánh giá tính sinh miễn dịch của chuột BALB/c
(xác định hiệu giá kháng thể)
35