Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên b trên màng tế bào hồng cầu người

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VƢƠNG THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VƢƠNG THANH HƢƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Geobacillus stearothermophilus ĐỂ PHÁT HIỆN NHANH DƢ LƢỢNG KHÁNG SINH TRONG SỮA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60420107 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS MAI THỊ ĐÀM LINH Hà Nội - Năm 2017 Luận văn thạc sỹ MỞ ĐẦU Được phát lần vào năm 1928 Alexander Flemming, chất kháng sinh coi công cụ hữu hiệu việc điều trị bệnh cho người động vật Chất kháng sinh sử dụng rộng rãi ngành nông nghiệp chăn nuôi, trồng trọt, nuôi truồng thủy hải sản, … có tác dụng lớn giúp cho vật nuôi trồng chống lại bệnh tật Việc sử dụng chất kháng sinh chăn nuôi chứng minh làm tăng khả hấp thu dinh dưỡng, khả thu nhận thức ăn vật nuôi đề kháng lại bệnh tật Do hiệu nhanh mạnh, chất kháng sinh sử dụng tràn lan phổ biến chăn nuôi mà không kiểm soát Điều dẫn đến thực trạng tượng tồn dư chất kháng sinh vật nuôi gây ảnh hưởng lớn đến chất lượng sản phẩm Tại Việt Nam, chăn nuôi gia súc, gia cầm người dân sử dụng tùy tiện loại thức ăn có chứa chất tăng trọng thuốc kháng sinh nhằm ngăn ngừa, trị bệnh cho vật nuôi giúp vật ni mau ăn chóng lớn Hậu dư lượng chất kích thích thuốc kháng sinh thực phẩm từ vật nuôi vượt ngưỡng cho phép gấp nhiều lần Trong ngành sản xuất sữa nay, việc sử dụng thuốc kháng sinh để phòng chữa bệnh cho bò (phổ biến bệnh viêm vú bò) nguyên nhân gây tồn dư thuốc kháng sinh mơ sữa bị Kháng sinh tồn dư sữa bò, dê, cừu gây ức chế vi khuẩn dùng trình chế biến sữa, đặc biệt trình chế biến phomat, sữa chua phải dùng vi khuẩn để lên men Đồng thời tồn dư lượng kháng sinh sữa gây nguy hiểm cho trẻ em người già, đối tượng dùng sữa nhiều Các nước Châu Âu ngừng sử dụng kháng sinh chăn nuôi từ năm 2006 Mỹ Thái Lan ngừng sử dụng năm 2017 Quốc tế có rào cản riêng để nói khơng với thực phẩm chứa kháng sinh Ở Việt Nam, vấn đề kiểm tra kiểm soát dư lượng kháng sinh sữa quan tâm Trước đòi hỏi ngày cao chất lượng độ an tồn sản phẩm có nguồn gốc từ đồng Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ vật người, việc tăng cường quản lý cơng đoạn sản xuất việc xác định nhanh hàm lượng kháng sinh tồn dư thực phẩm điều cần thiết Có nhiều phương pháp phát nhanh dư lượng kháng sinh sữa phương pháp sắc ký, phương pháp sắc ký miễn dịch, phương pháp ELISA, Các phương pháp hầu hết có độ nhạy cao, kết xác Tuy nhiên quy trình thường phức tạp, cần có trang thiết bị kèm cần kỹ thuật viên chuyên nghiệp cao Hơn trình kiểm nghiệm phải lấy mẫu thực phịng thí nghiệm Hiện nay, phương pháp phân tích vi sinh vật sử dụng phổ biến để xác định dư lượng kháng sinh tính đơn giản, tiện lợi Có nhiều test vi sinh vật nghiên cứu ứng dụng để xác định kháng sinh nhiều loại sản phẩm Geobacillus stearothermophilus chủng vi sinh vật ưa nhiệt, nhạy cảm với kháng sinh, sử dụng phổ biến test nước Tuy nhiên test có giá thành cao, thủ tục nhập đòi hỏi thời gian, gây trở ngại cho việc áp dụng rộng rãi Việt Nam Để chủ động nghiên cứu đáp ứng nhu cầu người tiêu dùng tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát nhanh dư lượng kháng sinh sữa” Mục tiêu đề tài Xây dựng quy trình chế tạo test thử từ bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để phát nhanh dư lượng kháng sinh sữa tươi nguyên liệu Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Chƣơng - TỔNG QUAN 1.1 Tình hình sản xuất sữa tƣơi Việt Nam: Là quốc gia đông dân với mức tăng trưởng dân số cao, khoảng 1,2%/năm, Việt Nam đánh giá thị trường tiềm cho hãng sản xuất sữa Với tỷ lệ tăng trưởng GDP 6-8%/năm, thu nhập bình quân đầu người tăng 14,2%/năm với xu hướng cải thiện sức khỏe tầm vóc người Việt khiến nhu cầu sử dụng loại sữa sản phẩm từ sữa mức cao Theo dự báo Hiệp hội Sữa Việt Nam (VDA), lượng sữa tiêu thụ bình quân đầu người Việt Nam vào năm 2010 đạt 15 lít/năm tăng gần gấp đơi, lên mức 28 lít/năm vào năm 2020 [15] Tăng trưởng doanh thu ngành sữa chủ yếu sữa bột sữa nước, chiếm 74% tổng giá trị thị trường Tuy nhiên, lực sản xuất sữa sản phẩm từ sữa nước dự báo không theo kịp nhu cầu tiêu thụ, đặc biệt lĩnh vực sản xuất sữa tươi Lượng sữa tươi nguyên liệu nước đáp ứng 30% nhu cầu sử dụng [15] Trong đó, chất lượng sữa thấp, khơng ổn định nguồn cung cấp chủ yếu từ hộ chăn nuôi nhỏ, suất thấp Nắm bắt tiềm tăng trưởng thị trường, ngày có nhiều doanh nghiệp tham gia vao ngành chế biến sữa Việt Nam Đặc biệt, đa phần doanh nghiệp tập trung đầu tư phát triển vùng nguyên liệu riêng nhiều hình thức nhằm giải nhược điểm lớn ngành sữa Việt Nam thiếu hụt nguyên liệu Một doanh nghiệp sữa thành công với việc tạo lập vùng nguyên liệu để phát triển sản phẩm Công ty Cổ phần sữa TH (nhãn hiệu sữa TH true milk) Các doanh nghiệp khác khơng đứng ngồi đua phát triển vùng nguyên liệu Công ty cổ phần sữa Việt Nam Vinamilk, Công ty cổ phần Thực phẩm dinh dưỡng NutiFood Việt Nam, … Sức hấp dẫn thị trường sữa Việt Nam khơng kích thích doanh nghiệp nội địa mở rộng sản xuất mà thu hút nhiều nhà đầu tư nước bỏ vốn vào ngành Ví dụ, doanh nghiệp sữa Friesland Campina Việt Nam (nhãn hiệu sữa Cô gái Hà Lan) xúc tiến đẩy mạnh phát triển vùng nguyên liệu tỉnh Hà Nam theo hình thức hợp tác Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ với hộ nông dân, hình thành trang trại chăn ni bị sữa quy mơ gia đình (50 - 80 bị sữa/trại) khác với mơ hình trại lớn 500 - 1000 bị sữa/trại doanh nghiệp khác [15] Có nhiều doanh nghiệp tham gia vào ngành chế biến sữa họ nắm bắt tiềm tăng trưởng thị trường Điều dẫn đến cạnh tranh gay gắt hãng sữa việc đưa lựa chọn sản phẩm sữa tốt cho người tiêu dùng Vấn đề chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm sản phẩm đặt lên hàng đầu Một vấn đề quan tâm xuất tồn dư chất kháng sinh sản phẩm sữa Nguyên nhân người dân sử dụng kháng sinh bừa bãi chăn nuôi, quy trình sử dụng khơng kiểm sốt Do việc kiểm soát chất lượng sữa, đặc biệt dư lượng kháng sinh sữa nguồn vấn đề quan tâm đẩy mạnh Hình 1.1 Quy trình kiểm sốt chất lượng sữa đầu vào trước xử lý Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 1.2 Tình hình sử dụng chất kháng sinh chăn nuôi: 1.2.1 Trên giới: Kháng sinh đóng vai trị quan trọng chăn ni ni trồng thủy sản, khơng để phịng trị bệnh mà dùng chất kích thích sinh trưởng liều thấp (2,5 - 50 ppm) [8,52] Nhu cầu sử dụng kháng sinh chăn ni động vật nói chung ni bị sữa nói riêng lớn Việc sử dụng kháng sinh thức ăn chăn nuôi đánh dấu thí nghiệm Stokstad Juke năm 1949 [65] cho gia cầm ăn thức ăn có bổ sung Chlortetracycline, nhận thấy tốc độ sinh trưởng hiệu sử dụng thức ăn gia cầm tăng rõ rệt Vì thế, người ta đưa vào thức ăn gia súc, gia cầm nhiều loại thuốc kháng sinh Oxytetracycline, Aureomycine, Penicillin, Streptomycine Mỹ nước phát hiệu sử dụng kháng sinh làm chất kích thích sinh trưởng thức ăn chăn ni Ở Mỹ hàng năm có khoảng triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh dùng chăn nuôi Theo thống kê, xấp xỉ 80% số gia cầm, 70% lợn, 70% bị sữa 60% bị thịt ni dưỡng thức ăn có bổ sung kháng sinh Ước tính USD chi phí cho kháng sinh dùng thức ăn, người chăn nuôi thu lợi tức 2-4 USD [33] Cơ quan quản lý Dược phẩm Thực phẩm (FDA) Mỹ ban hành quy định việc cho phép sử dụng kháng sinh để kích thích tăng trọng từ năm 1951 Theo Hội đồng nghiên cứu Quốc Gia Hoa Kỳ (NRC), 1998, Mỹ Canada cho phép sử dụng 17 loại kháng sinh vào thức ăn cho lợn, có loại phải ngừng sử dụng trước giết mổ từ 5-70 ngày Liều lượng bổ sung thường thấp tùy theo loại kháng sinh, sử dụng Chlotetracycline hay Zinbacitracilin hàm lượng 30 đến 40 ppm [33] Ở Anh Pháp, trung bình năm có khoảng 75% số động vật dùng kháng sinh để điều trị gần 60% động vật dùng kháng sinh để phòng bệnh Ở Anh, Tetracycline nhóm kháng sinh sử dụng nhiều để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, chiếm 50% tổng số kháng sinh [52] Theo số liệu Ghislain Follet, năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng dân y chăn nuôi nước châu Âu 10500 (quy theo mức 100% tinh khiết thành Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ phần hoạt tính), 52% sử dụng dân y, 33% điều trị thú y 15% chất bổ sung thức ăn chăn ni Trong đó, tỷ lệ loại kháng sinh sử dụng chăn nuôi: Penicillin 9%; Tetracycline 66%; Macrolide 12%; Aminoglycoside 4%; Fluoroquinolone 1%; Trimethomprimsulfamid 2% kháng sinh khác 6% [10] Việc bổ sung kháng sinh với liều lượng thấp xác nhận cải thiện trọng lượng vật nuôi, giảm lượng thức ăn cho vật nuôi, giúp vật nuôi chống lại bệnh tật Tuy nhiên, việc lạm dụng, sử dụng bất hợp pháp sử dụng sai nguyên tắc thuốc thú y nói chung kháng sinh nói riêng chăn ni nuôi trồng thủy sản gây tượng kháng thuốc tồn dư thuốc sản phẩm, ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cộng đồng, môi trường hiệu điều trị bệnh [20,23] Chính vậy, để tăng cường kiểm soát dư lượng thuốc, nước phát triển có qui định chặt chẽ kiểm soát nghiêm ngặt Ngày 22/12/2009 EU ban hành định số 37/2010 thay cho định số 2377/90 EC quy định giới hạn tồn dư thuốc thú y cho phép sản phẩm động vật [34] Hoa Kỳ Liên minh Châu Âu cho phép dư lượng tối đa kháng sinh thịt phủ tạng động vật 100 µg/kg, đó, Nhật Bản cho phép 20 µg/kg Hàn Quốc 10 µg/kg [17,22,28] Do phát độc tính Chloramphenicol (CAP) lên quan tạo máu (có thể gây thiếu máu không tái tạo, không phục hồi suy tủy, gây tử vong) nên từ năm 1990 Ủy ban Châu Âu cấm sử dụng CAP thú y [3] 1.2.2 Tại Việt Nam: Ở Việt Nam kháng sinh sử dụng tràn lan để phòng bệnh trị bệnh nên tình trạng tồn dư kháng sinh thịt sữa phổ biến Có tới 60-70% tổng thuốc dùng để phịng trị bệnh cho vật ni thuốc hóa học trị liệu chủ yếu thuốc kháng sinh [16] Theo Lã Văn Kính cộng (2007), tỷ lệ sử dụng kháng sinh chăn nuôi nước ta cao: 100% sở chăn ni có sử dụng Oxytetracycline, 67% sở chăn ni có sử dụng Chloramphenicol Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ (mặc dù thuốc bị cấm không dùng để điều trị), 30% có sử dụng Olaquindox, 77% sở chăn ni có sử dụng Dexamethasol [12,13] Cơng bố nghiên cứu khoa Chăn nuôi Thú y Trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh có 628 hộ chăn nuôi lợn, gà cho thấy đa số người chăn nuôi sử dụng kháng sinh không hợp lý liều cao, sử dụng liên tục để phòng ngừa bệnh cho gia súc bán Kết khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni gà địa bàn tỉnh Bình Dương cho thấy có 26 loại kháng sinh sử dụng Trong đó, loại sử dụng nhiều Chloramphenicol (chiếm 15,35%), Tylosin (15%), Colistin (13,24%), Norfloxacin (10%), Gentamycin (8,35%), nhóm Tetracycline (7,95%), Ampicillin (7,24%), sở sử dụng kháng sinh không hợp lý chiếm 17,22%, chủ yếu sai liều lượng (12,57%) liệu trình điều trị (3,09%) đồng thời số sở không tuân thủ quy định thời gian ngưng thuốc trước giết mổ chiếm tới 40,13% [14,18] Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh hộ chăn nuôi địa bàn Hà Nội, kết nghiên cứu Lê Thị Ngọc Diệp cho thấy kháng sinh thuộc hai nhóm Quinolones Macrolides sử dụng nhiều với tỷ lệ tương ứng 78,14% 86,89% Các nhóm kháng sinh khác Polipeptides (54,92%), Aminoglycosides (50,96%), β-lactams (4,58%) Tetracycline (46,58%) [5] Từ năm 2003 - 2006, kết phân tích lượng tồn dư thuốc kích thích tăng trưởng 150 mẫu thịt gan gia cầm, gia súc thu thập Hà Nội Khoa Thực phẩm vệ sinh an toàn thực phẩm, Viện dinh dưỡng Quốc gia cho thấy: phát tồn dư thuốc kháng sinh nhóm Tetracycline 18 mẫu, chiếm tỷ lệ 12% Có 5,5% số mẫu 290 mẫu thịt lợn thị trường Hà Nội có tồn dư kháng sinh Tetracycline Tại khu vực chăn nuôi miền nam nhận thấy có sở chiếm 22,2% mẫu thịt gà có tồn dư loại kháng sinh Tetracycline, Amoxyline, Erofloxacine với hàm lượng cao gấp từ 1,4 – 30,9 lần so với ngưỡng cho phép [14] Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Các bệnh bò thường điều trị kháng sinh bệnh nhiễm khuẩn nặng, viêm vú, viêm tử cung, viêm phổi, viêm móng, khớp, tiêu chảy,… Kết nghiên cứu Sa Đình Chiến Cộng [4] cho thấy bệnh viêm vú gây thiệt hại đáng kể cho người chăn nuôi Tỷ lệ viêm vú lâm sàng bò sữa nhập vào địa bàn Mai Sơn, Sơn La 27,46 %, viêm vú phi lâm sàng 48,16 % Có nhiều nguyên nhân dẫn đến phát sinh phát triển bệnh viêm vú Kháng sinh sử dụng để điều trị bệnh viêm vú bò sữa là: Amoxilin, Lincomycin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Cefazolin, Neomycin, Tetracyclin, Gentamycin Hình 1.2 Khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni địa bàn tỉnh Bình Dương [18] 1.3 Tồn dƣ chất kháng sinh thực phẩm: Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7405:2004 [1] sữa tươi nguyên liệu - yêu cầu kỹ thuật cho phép giới hạn tối đa dư lượng thuốc thú y sau: Hv: Vương Thanh Hương Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ  Đặc điểm hình thái Geobacillus stearothermophilus vi khuẩn Gram dương, hình que, sinh trưởng đơn lẻ chuỗi, có khả tạo thành bào tử, tạo thành nội bào tử môi trường dinh dưỡng bị suy giảm Thành tế bào vi khuẩn có cấu trúc vi khuẩn Gram dương điển hình Chúng có cấu tạo gồm lớp peptidoglycan dày xung quanh màng sinh chất [67] Lớp peptidoglycan chứa DAP axit mesodiaminopimelic có chứa lượng axit teichoic đáng kể với axit muramic giúp bảo vệ thành tế bào suốt trình phân chia [70] Bề mặt vi khuẩn có chứa lớp vỏ, lớp S-layer, protein Các lớp kết tinh bề mặt protein giống lớp S-layer vi khuẩn khác, chúng có mối liên quan chặt chẽ với tế bào vi khuẩn [67]  Đặc điểm sinh hóa G stearothermophilus có phản ứng catalase oxidase dương Vi khuẩn sử dụng hoàn toàn hợp chất hữu đơn giản đường, axit amin, axit hữu oxy chất nhận điện tử cuối [67,70] G stearothermophilus vi khuẩn khử nitơ Vi khuẩn tìm thấy đất cơng nghiệp phân compost tham gia vào q trình khử nitơ phân bón từ NO xuống NO2 dễ bay N2 [70]  Đặc điểm nuôi cấy - Điều kiện sinh trưởng: Vi khuẩn có khả di động, hiếu khí G o stearothermophilus sinh trưởng nhiệt độ khác nhau, từ 30-75 C, chịu axit với dải pH từ 2-11 nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 50-65°C Đặc biệt lồi vi khuẩn có o thể sống sót nhiệt độ cao đến 130 C [59] Vi khuẩn dễ dàng sinh trưởng phân lập phịng thí nghiệm vi sinh [70] G stearothermophilus chủng vi khuẩn dễ bị ức chế kháng sinh, đặc biệt nhóm β-lactam [54,61,66,45] - Đặc điểm nuôi cấy: Trên môi trường thạch đĩa Trypticase Soy Agar (TSA): khuẩn lạc dạng trịn, rìa cưa khơng đều, màu vàng xám, đường kính – mm, sau – ngày bề mặt nhăn nheo, màu nâu Trên môi trường canh Trypticase Soy Broth (TSB): Hv: Vương Thanh Hương 25 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ vi khuẩn sinh trưởng làm đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn, kết lại vẩn mây đáy, khó tan lắc - Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần nguyên tố C, H, O, N số nguyên tố vi lượng khác Vi khuẩn sinh trưởng tốt môi trường cung cấp đủ nguồn carbon (như Glucose) nitơ (như Peptone) Hình 1.9 Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus môi trường thạch [31] 1.5.1.3 Sự hình thành bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus: Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus có dạng elip đến hình cầu, có kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,0 – 1,5 µm, bao bọc nhiều lớp màng với thành phần lipoprotein, peptidoglycan… Bào tử G.stearothermophilus có chứa lượng lớn canxi, magie acid dipicolinic Hình 1.10 Bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus [63] Hv: Vương Thanh Hương 26 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ  Cấu tạo bào tử Geobacillus stearothermophilus: Bào tử G stearothermophilus khối nguyên sinh chất đặc, có chứa thành phần hóa học tế bào sinh dưỡng có vài điểm khác tỉ lệ thành phần có thêm số thành phần Bào tử bọc vỏ dày gồm nhiều lớp: - Lớp màng ngoài: Màng ngồi nằm ngồi cùng, phần cịn sót lại tế bào mẹ, có có không, dày, xốp, chiếm - 10% khối lượng khơ bào tử Màng ngồi gồm lớp, lớp dày 6nm, lớp dày 19nm - Lớp áo bào tử: Lớp áo bào tử lớp peptidoglycan dày gồm nhiều loại protein khác Lớp áo bào tử thường chứa protein lắp ráp yếu tố hình thái quan trọng Lớp áo đóng vai trị quan trọng nảy mầm bào tử - Lớp vỏ bào tử: Vỏ bào tử chiếm thể tích lớn (36 - 60%) Lớp có vai trị lớp rào cản nguồn gốc kháng nguyên bề mặt bào tử Lớp vỏ bào tử có phản ứng với lectin để tạo liên kết với olysaccharide nằm sợi lớp vỏ bào tử - Lõi bào tử: gọi thể chất nguyên sinh bào tử Lõi gồm phần: thành bào tử, màng bào tử, bào tử chất vùng nhân Áo bào tử Lớp màng Vỏ bào tử Vách tế bào Lớp màng Lõi bào tử Hình 1.11 Cấu tạo bào tử vi khuẩn [49] Hv: Vương Thanh Hương 27 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ  Sự hình thành nảy mầm bào tử: Quá trình hình thành bào tử gồm bước sau: Hình thành búi chất nhiễm sắc Tế bào bắt đầu phân cắt không đối xứng, tạo vùng nhỏ gọi tiền bào tử Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng xạ Lớp vỏ sơ khai hình thành hai lớp màng bào tử sau tích lũy nhiều peptioglican tổng hợp dipicolinat canxi, tính chiết quang tăng cao Kết thúc việc hình thành áo bào tử Kết thúc việc hình thành vỏ bào tử Bào tử thành thục, bắt đầu có tính kháng nhiệt Nang bào vỡ ra, bào tử thoát ngồi Hình 1.12 Q trình hình thành bào tử Lúc đầu lớp nguyên sinh chất tế bào sử dụng Tế bào chất nhân tập trung vị trí định tế bào Tế bào chất tiếp tục cô đặc Hv: Vương Thanh Hương 28 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ tạo thành tiền bào tử (prospore) Tiền bào tử dần bao bọc lớp màng Tiền bào tử phát triển trở thành bào tử - Sự nảy mầm bào tử: Quá trình chuyển từ trạng thái nghỉ sang tế bào sinh dưỡng vi khuẩn gọi trình nảy mầm bào tử Quá trình gồm giai đoạn: hoạt hóa, nẩy mầm sinh trưởng Protein có chứa nhiều systein áo bào tử hố xốp lên làm tăng tính thấm, xúc tiến hoạt động enzyme proteinaza Khi lượng protein áo bào tử giảm xuống Các cation bên ngồi xâm nhập vào lớp vỏ bào tử làm trương lớp vỏ lên, sau làm tan tiêu thối Khi nước bên ngồi xâm nhập vào lớp lõi bào tử làm cho lõi trương to lên, loại enzyme bắt đầu hoạt hoá lên, bắt đầu trình tổng hợp thành tế bào Trong q trình nảy mầm đặc tính chịu nhiệt, chiết quang cao… bắt đầu giảm dần, lượng BPA - Ca, acid amin, polipeptit đi, bắt đầu xảy việc tổng hợp ADN, ARN protein lõi bào tử Bào tử chuyển sang thành tế bào dinh dưỡng Khi nảy mầm, bào tử mầm đâm theo phía cực đâm ngang Lúc thành tế bào cịn mỏng chưa hồn chỉnh nâng cao khả tiếp nhận thêm ADN ngoại lai để thực trình biến nạp Cuối cùng, bào tử chứa số enzyme sửa chữa ADN, ADN sửa chữa trình nảy mầm tăng trưởng sau lõi hoạt hóa trở lại  Sức đề kháng bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus: Bào tử có sức đề kháng cao với yếu tố vật lý hóa học nhiệt độ, tia cực tím, áp suất chất sát trùng Bào tử có sức đề kháng cao sống lâu do: - Nước bào tử phần lớn trạng thái liên kết, khơng có khả làm biến tính protein tăng nhiệt độ - Do bào tử có khối lượng lớn ion Ca 2+ acid dipicolinic, protein bào tử kết hợp với dipicolinate canxi thành phức chất có tính chất ổn định cao nhiệt độ Hv: Vương Thanh Hương 29 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ - Các enzyme hoạt chất sinh học khác chứa bào tử tồn dạng không hoạt động, hạn chế trao đổi chất bào tử tế bào bên ngồi - Với cấu trúc có nhiều màng bao bọc tính thẩm thấu lớp màng làm cho tính chất hóa học chất sát trùng khó tác động tới bào tử 1.5.2 Ứng dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus việc phát nhanh dư lượng số kháng sinh sữa: Vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus chủng vi khuẩn ứng dụng rộng rãi test Châu Âu như: Improved Agar Diffusion test, Delvotest SP-NT, Charm AIM – 96, Disk Assay Plate Method, Copan Milk test,… [47] Vi khuẩn thường dùng dạng bào tử khả chống chịu tốt với điều kiện bất lợi, dễ thương mại hóa, điều kiện bảo quản sử dụng dễ dàng Hình 1.13 Test thử dư lượng kháng sinh sữa hãng Delvotest Năm 1962, Galesloot cộng [37] sử dụng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus G calidolactis để phát dư lượng kháng sinh sữa Phương pháp thực cách đặt miếng giấy có tẩm sữa lên mơi trường thạch dinh dưỡng có bổ sung vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus, sau o ủ 55 C 2,5 Tiến hành quan sát ức chế vi khuẩn lên khu vực có chứa miếng giấy tẩm để biết diện kháng sinh sữa Phương pháp có độ nhạy kháng sinh Penicillin khoảng 0.0025 IU/ml Tuy nhiên Hv: Vương Thanh Hương 30 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ phương pháp không phù hợp địi hỏi người thực phải có chun mơn cao có nhược điểm thực phịng thí nghiệm Năm 1969, Mol H [56] phát triển phương pháp Galesloot Phương pháp thực cách đặt miếng giấy có thấm môi trường chứa: Peptone 20%, Glucose 20% làm khơ, sau thấm sữa đặt mơi trường agar có bổ sung bào tử vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus var o calidolactis Sau đem ủ 63 C quan sát diện kháng sinh Mặc dù phương pháp đánh giá tốt phương pháp Galesloot có số nhược điểm như: khó nhận vùng ức chế, thể tích mẫu khơng đủ để thực nhắc lại Năm 1990, Lameris cộng [50] nghiên cứu phương pháp phát dư lượng kháng sinh sữa cách bổ sung vào môi trường dinh dưỡng từ 10 đến 10 bào tử/ml vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus var calidolactis vào ống hình trụ, ủ nhiệt độ thích hợp khoảng 55°C đến 70°C, tốt 60°C đến 65°C ủ khoảng thời gian tương đối ngắn khoảng 1,5 đến giờ, tốt 2-3 quan sát thay đổi màu sắc môi trường Các nghiên cứu chứng minh vai trò quan vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus việc sản xuất test thử để phát nhanh dư lượng kháng sinh sữa Tuy nhiên Việt Nam chưa có đơn vị sử dụng chủng vi khuẩn Geobacillus stearothermophilus để sản xuất test phát nhanh dư lượng kháng sinh sữa dạng ống thạch mà chủ yếu nhập ngoại với giá thành cao Do việc nghiên cứu chế tạo test thử từ vi khuẩn điều kiện Việt Nam có ý nghĩa, góp phần tạo sản phẩm có chất lượng tốt giá thành rẻ đồng thời nâng cao chất lượng sản phẩm có nguồn gốc nước Hv: Vương Thanh Hương 31 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ TÀI LIỆU THAM KHẢO I Tài liệu tiếng Việt: Bộ Khoa học Công nghệ (2004), TCVN 7405:2004, Sữa tươi nguyên liệu - yêu cầu kỹ thuật Bộ Khoa học Công nghệ (2010), TCVN 8345-2010, Thủy sản sản phẩm thủy sản Xác định dư lượng Sulfonamid Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Bộ NN & PTNT (2009), Quyết định số 15/2009/TTBNN ngày 17 tháng năm 2009, Danh mục số hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh sử dụng thuốc thú y Sa Đình Chiến cộng (2005), Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu bệnh viêm vú bị sữa ni Sơn la biện pháp phòng trị, Sơn La, tr.50-54 Lê Thị Ngọc Diệp (2003), “Một số kết khảo sát tình hình sử dụng thuốc kháng sinh chăn nuôi gà tồn dư kháng sinh thịt, trứng gà địa bàn Hà Nội”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, (1), tr.4043 Phạm Kim Đăng, Marie-Louise Sippo, Guy Degand, Caroline Douny, Guy Maghuin-Rogister (2007), “Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính kiểm sốt tồn dư kháng sinh thực phẩm có nguồn gốc động vật theo quy định số 2002/657/EC (bài tổng hợp)”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp, 5(1), tr 24-30 Phạm Kim Đăng cộng (2008), “Ứng dụng phương pháp ELISA để phân tích tồn dư kháng sinh nhóm Quinolone tơm số tỉnh ven biển khu vực phía Bắc”, Tạp chí Khoa học phát triển, 6(3), tr.261-267 Phạm Kim Đăng, Nguyễn Tú Nam, Bùi Thị Tho, Phạm Hồng Ngân (2012), “Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh chăn ni gà Hải Phịng”, Tạp chí khoa học Kỹ thuật thú y, Hội thú y Việt Nam, 19(5), tr 92-98 Hv: Vương Thanh Hương 70 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu cao số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu hợp chất tự nhiên, nhà xuất Y học, Thành phố Hồ Chí Minh 10 Phạm Khắc Hiếu (2009), Giáo trình dược lý học thú y, nhà xuất Bộ giáo dục Việt Nam 11 Lã Thị Huyền cộng (2015), Báo cáo tổng kết đề tài: Nghiên cứu chế tạo sử dụng Kit phát kháng sinh sữa kỹ thuật nano, Viện Công nghệ Sinh học 12 Nguyễn Văn Kính (2010), Phân tích thực trạng sử dụng kháng sinh kháng kháng sinh Việt Nam, Nhóm nghiên cứu GARP-Việt Nam, tr.34 13 Lã Văn Kính cộng (2007), Báo cáo tổng kết đề tài : Nghiên cứu sản xuất thịt lợn an toàn chất lượng cao, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn 14 Dương Văn Nhiệm (2005), Phân tích bước đầu tồn dư Tetracycline thịt lợn thị trường Hà Nội, Luận văn thạc sĩ khoa học thú y, Chieng Mai University Thailand & Freie Universitot Berlin Germany 15 Đặng Quang (2015), “Thị trường sữa tươi Việt Nam: tiềm rộng mở”, Tạp chí Cơng thương, (18), tr.13-15 16 Bùi Thị Tho (2003), Bài giảng thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi, nhà xuất Hà Nội 17 Thơng tư số 03/2012/TT-BNNPTNT, Danh mục thuốc, hóa chất, kháng sinh cấm sử dụng, hạn chế sử dụng, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn 18 Đinh Thiện Thuật, Nguyễn Ngọc Tuấn, Võ Thị Trà An, Lê Thanh Hiển, Võ Bá Lân, Khương Thị Ninh (2003), “Bước đầu khảo sát tình hình sử dụng kháng sinh chăn nuôi dư lượng kháng sinh thịt thịt thương phẩm địa bàn tỉnh Bình Dương”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, 1(1), tr.50-57 19 Vũ Thị Trang (2012), Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) xác định dư lượng số kháng sinh nhóm Sulfonamides thịt gia súc gia cầm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội Hv: Vương Thanh Hương 71 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ II Tài liệu tiếng Anh: 20 Alali, W Q., Scott, H M., Christian, K L., Fajt, V R., Harvey, R B., Lawhorn, D B (2009), “Relationship between level of antibiotic use and resistance among Escherichia coli isolates from integrated multi-site cohorts of humans and swine”, Prev Vet Med, 90, pp 160-167 21 Al-Rimawi F and Maher K (2011), “Analysis of chloramphenicol and its related Compound 2- Amino-1-(4-nitrophenyl)propane-1,3-diol by Reversed-Phase High-Performance Liquid Chromatography with UVDetection”, Chromatography Research International, Vol 2011, Acticle ID 482308 22 Barbara Chiavarino (1998), “Determination of sulfonamid antibiotics by gas chromatography coupled with atomic emission detection”, Journal of Chromatography B, 706, pp 269-277 23 Bogaard van den A.E., and Stobberingh E.E (2000), “Epidemiology of resistance to antibiotics Links between animals and humans”, International journal of antimicrobial agents 14, 4(75), pp 327-335 24 Bogaerts, R and Wolf, F (1980), “A standardized method for the detection of residues of antibacterial substances in fresh meat – A report of the working group of the Scientific Veterinary Commission of the European Communities concerning a proposal for a common microbiological method, the so-called EEC fourplate method”, Fleischwirtschaft, 60 pp 667-669 25 Chukwuenweniwe J E., Johnson S and Sunday A A (2003) “An alternative colorimetric method for the determination of chloramphenicol”, Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 2(2), pp 215-221 26 Chung HH., Lee JB., Chung YH and Lee KG (2009), “Analysis of sulfonamide and quinolone antibiotic residues in Korean milk using microbial assays and high performance liquid chromatography”, Analytical Methods, 113 (1), pp 297-301 Hv: Vương Thanh Hương 72 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 27 Coorevits, A, Dinsdale, AE, Halket, G, Lebbe, L, De Vos, P, Van Landschoot, A, Logan, NA (2012), "Taxonomic revision of the genus Geobacillus: emendation of Geobacillus, G stearothermophilus, G jurassicus, G toebii, G thermodenitrificans and G thermoglucosidans (nom corrig., formerly 'thermoglucosidasius'); transfer of Bacillus thermantarcticus to the genus as G thermantarcticus comb nov.; proposal of Caldibacillus debilis gen nov., comb nov.; transfer of G tepidamans to Anoxybacillus as A tepidamans comb nov.; and proposal of Anoxybacillus caldiproteolyticus sp nov.", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 62, pp 85-1470 28 Dal-Ho Kim, Dai Woon Lee (2003), “Comparison of separation conditions and ionization methods for the liquid chromatography–mass spectrometric determination of sulfonamid”, Journal of Chromatography A, 984, pp 153-158 29 Dang, P K., Degand, G., Caroline, D., Ton, V D., Maghuin-Rosister, G &Scippo, M L (2011), “Optimization of a new two-plate screening method for the detection of antibiotic residues in meat”, International Journal of Food Science and Technology, 46, Issue 10, pp.2070–2076 30 Dang Pham Kim, Claude Saegerman, Caroline Douny, Ton Vu Dinh, Bo Ha Xuan, Binh Dang Vu, Ngan Pham Hong, Marie-Louise Scippo (2013), “First Survey on the Use of Antibiotics in Pig and Poultry Production in the Red River Delta Region of Vietnam”, Food and Public Health, 3(5), pp 247-256 31 De Brabander H.F., Noppe H., Verheyden, K et al (2009), Review Residue analysis: Future trends from a historical perspective, 1216, pp 79647976 32 DONK P.J (1920), “A highly resistant thermophilic organism", Journal of Bacteriology , 5, pp 373-374 Hv: Vương Thanh Hương 73 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 33 Ensminger M.E., Oldfield J.E., Heinemann W.W (1990), Feeds and Nutrition the Ensminger Publishing Company, USA, pp 593–666 34 European Commission (2010), “Commission Regulation No 37/2010 of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits in foodstuffs of animal origin”, Official Journal, 15, pp 1-72 35 Ferrini AM, Mannoni V, Aureli P (2006), Food Addit Contam, 23, pp:16–24 36 Furukawaa, S., Watanabea, T., Koyamaa, T., Hirataa, J., Narisawaa, N., Ogiharaa, H., Yamasakib (2003), ”Inactivation of food poisoning bacteria and Geobacillus stearothermophilus spores by high pressure carbon dioxide treatment”, Appl Environ Microbiol, 69(12) pp 7124-7129 37 Galesloot et al (1962), Neth Milk & Dairy J., 16, pp 89-95 38 Gaurav A, Gill JPS, Aulakh RS and Bedi JS (2014), “ELISA based monitoring and analysis of tetracycline residues in cattle milk in Punjab”, Veterinary World 7(1), pp 26-29 39 George Stubbings, Timothy Bigwood (2009), “The development and validation of a multiclass liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC– MS/MS) procedure for the determination of veterinary drug residues in animal tissue using a QuEChERS (QUick, Easy, CHeap, Effective, Rugged and Safe) approach”, Analytica Chimica Acta, 637 , pp 68-78 40 Gerber, F.; Krummen, M.; Potgeter, H.; Roth, A.; Siffrin, C.; Spoendlin, C (2004), “Practical aspects of fast reversed-phase high-performance liquid chromatography using 3μm particle packed columns and monolithic columns in pharmaceutical development and production working under current good manufacturing practice” Journal of Chromatography A, pp 1036 41 Hela W et al (2003), “Determination of sulfonamid in animal tissues using cation exchange reversed phase sorbent for sample cleanup and HPLC– DAD for detection”, Food Chemistry 83, pp 601–608 Hv: Vương Thanh Hương 74 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 42 Hua-Jin Zenga, RanYangb, BingLiub, Li-FangLeib, Jian-JunLib, Ling-BoQu (2012), “Simple and sensitive determination of sparfloxacin in pharmaceuticals and biological samples by immunoassay”, Journal of Pharmaceutical Analysis, 2(3), pp.214–219 43 Hwang, Andy, Huang, Lihan (2009), ”Ready-to-Eat Foods: Microbial Concerns and Control Measures”, CRC Press, pp 88 44 International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2001), Notification that new names and new combinations have appeared in volume 50, part 2, of the IJSEM , 51, 795–796 45 Jevinova P, Dudrikova E, Sokol J, Nagy J, Mate D, Pipova M, Cabadaj R (2003), Determination of oxytetracycline residues in milk with the use of HPLC method and two microbial inhibition methods Bull Vet Inst Pulawy ,47, pp.211-216 46 Jiang Jinqing, Zhang Haitang, An Zhixing, Xu Zhiyong, Yang Xuefeng, Huang Huaguo Wang Ziliang (2012), “Development of an Heterologous Immunoassay for Ciprofloxacin Residue in Milk”, Physics Procedia, 25, pp.1829 - 1836 47 John G Holt, Noel R Krieg, Peter H.A Sneath, James T Staley, Stanley T Williams (1957), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th Ed, ap 613-693 48 Jones G.M (1999), On-farm tests for drug residues in milk, Virginia Coop erative Extension, pp 404-401 49 Kumar N, Thakur G, Raghu HV, Singh N, Sharma PK, et al (2013), “Bacterial Spore Based Biosensor for Detection of Contaminants in Milk”, J Food Process Technol, 4(11) 50 Lameris et a1 (1990), Method for determination of the presence of antibiotics, ap 1-7 Hv: Vương Thanh Hương 75 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ 51 Mariel G Pikkemaat (2009), “Microbial screening methods for detection of antibiotic residues in slaughter animals”, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 395(4), pp 893-905 52 MCEVOY, J D G (2002), “Contamination of animal feedingstuffs as a cause of residues in food: a review of regulatory aspects, incidence and control”, Analytica Chimica Acta, 473, pp 3-26 53 McGlinchey TA., Rafter PA., Regan F., McMahon GP (2008), “A review of analytical methods for the determination of aminoglycoside and macrolide residues in food matries”, J Analytica chemica acta, 624, pp 1-15 54 Messer W, Leslie J, Houghtby G, Peeler J, Barnett J (1982), “Bacillus stearothermophilus disc assay for detection of inhibitors in milk”, J Assoc Official Anal Chem, 65 (5), pp 1208-1214 55 Mitchell JM, Griffiths MW, McEwen SA, McNab WB, Yee AJ (1998), J Food Prot ,61, pp.742–756 56 Mol H et al (1969), Neth Milk & Dairy J., 23, pp 153-162 57 Myers RP (1964), Rev Environ Contam Toxicol, 7, pp 11–36 58 Myllyniemi, A.L., Rintala, R., Backman, C., Niemi, A (1999), “Microbiological and chemical identification of antimicrobial drugs in kidney and muscle samples of bovine cattle and pigs”, Food additives & Contaminants, 16, pp 339-351 59 Nazina, T.N., Tourova, T.P., Poltaraus, A.B., Novikova, E.V., Grigoryan, A.A., Ivanova, A.E., Lysenko, A.M., Petrunyaka, V.V., Osipov, G.A., Belyaev, S.S., Ivanov, M.V (2001), “Taxonomic study of aerobic thermophilic bacilli”, Int J Syst Evol Microbiol, 51, pp 433-446 60 Nouws, J.F.M., Schothorst, M.v and ziv G (1979), “A critical evaluation of several microbial test methods for residues of antimicrobial drugs in ruminants”, Arch Lebensm Hyg, 30, pp.4-8 61 Reybroeck W (1995), “Evaluation of screening tests for the detection of antimicrobial residues in milk”, International Dairy Federation, Hv: Vương Thanh Hương 76 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ Symposium on residues of antimicrobial drugs and other inhibitors in milk Kiel, Germany, pp 182-186 62 Robert L T and Fischer L.J (1978), “High Performance LiquidChromatographic Assay for Chloramphenicol in Biological Fluids”, Clinical Chemistry, 24(5), pp 778-781 63 Rossi F., Kylian O., Hasiwa M (2006), Plasma Processes Polym, 3, pp 431 64 Samanidou VF., Tsochatzis ED., and Papadoyannis IN (2006), “HPLC determination of cefotaxime and cephalexine residues in milk and cephalexine in veterinary formulation”, Microchimica Acta, Vol.160 (4), pp 471-475 65 Stokstad, E.L.R and T.H Jukes (1949), Further observations on the animal protein factor, Proceedings of the Society of Biological and Experimental Medicine, 73, pp 523–528 66 Suhren G, Beukers R (1998), Delvotest SP for detection of cloxacillin and sulfamethoxazole in milk: IDF interlaboratory study J Assoc Official Anal Chem, 81, pp.978-990 67 Todar Kenneth (2008), "Surface Structure of Bacillus", Textbook of Bacteriology 68 William A M and Raida HK (1995), Rapid Determination of Tetracycline Antibiotics in Milk and Tissues Using Ion-Pairing High-Performance Liquid Chromatography, 43 (4), pp 931-934 69 Yanbin Lu, Qing Shen, Zhiyuan Dai, Hong Zhanghai, Honghai Wang (2011), “Development of an on-line matrix solid-phase dispersion/fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry system for the rapid and simultaneous determination of 13 Sulfonamid in grass carp tissue”, Journal of Chromationgraphy A, 1218, pp 929-937 70 Zeigler, Daniel R (2001), "The Genus Geobacillus." , Bacillus Genetic Stock Center, 3, pp 7-11 Hv: Vương Thanh Hương 77 Lớp: K23-QH2014 ... sợi lớp vỏ b? ?o tử - Lõi b? ?o tử: gọi thể chất nguyên sinh b? ?o tử Lõi gồm phần: thành b? ?o tử, màng b? ?o tử, b? ?o tử chất vùng nhân Áo b? ?o tử Lớp màng Vỏ b? ?o tử Vách tế b? ?o Lớp màng Lõi b? ?o tử Hình... áo b? ?o tử Kết thúc việc hình thành vỏ b? ?o tử B? ?o tử thành thục, b? ??t đầu có tính kháng nhiệt Nang b? ?o vỡ ra, b? ?o tử thoát ngồi Hình 1.12 Q trình hình thành b? ?o tử Lúc đầu lớp nguyên sinh chất tế. .. chất tế b? ?o sử dụng Tế b? ?o chất nhân tập trung vị trí định tế b? ?o Tế b? ?o chất tiếp tục cô đặc Hv: Vương Thanh Hương 28 Lớp: K23-QH2014 Luận văn thạc sỹ tạo thành tiền b? ?o tử (prospore) Tiền b? ?o tử