Nghiên cứu sản xuất kháng thể thỏ kháng ovalbumin dùng phát hiện ovalbumin trong vacxin cúm a h5n1

tài "“ NGHIÊN C U S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN DÙNG PHÁT HI N OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1” T lòng bi t bày t lòng c m Ban Giám hi u trư ng khoa Ch Bi n tồn th q trình h c t p t i trư ng PGS.TS Lê V n Hi p - Vi n trư ng Vi n V c xin Sinh ph m Y t Nha Trang, ngư i th y trình th c t p t i Vi n CN Nguy n Th Minh Hi n - trư ng phòng, TS Nguy n Th Lan Phư ng phó phịng Ki m d n, ch b o nhi t tình, chu hồn thành lu n v n Qua ây em xin bày t phòng Ki m lòng bi t n sâu s c nh, phòng Nghiên c u phát tri n n toàn th cơ, anh ch ã nhi t tình giúp , góp ý ng viên em th i gian th c t p t i phòng Em xin chân thành c m n Ban Giám c Vi n V c xin Nha Trang ãto i u ki n thu n l i cho em th c t p t i Vi n Xin bày t quan tâm, giúp lòng bi t , chia s , n n gia ình, t t c b n bè, anh ch em ng viên em su t th i gian qua Nha Trang, tháng 11 năm 2007 Sinh viên Th Thanh Vân ã CH APS CV D D VN ELISA FCA FIA HA IgG IU KN KT LOD LOQ NA OD PBS SD SDS-PAGE ( i n di gel Poly acrylamide có Sodium dodecyl sulphate) Streptavidine – PO : Streptavidine – Peroxydase RIA : Radial immuno assay (Th RNA : Ribonucleic Acide (Axit Ribonucleic) TMB : 3,3’,5,5’ – TetraMethyl Benzidine TEMED : N,N,N’,N’- TetraMethylethylendiamin WHO : World Health Organization (T nghi m mi n d ch phóng x ) ch c Y t th gi i -TCYTTG) M CL C TRANG BÌA PH L IC MƠN DANH M CCH VI TT T MCLC DANH M C CÁC B NG DANH M C CÁC HÌNH L INĨI U 1.1 TÌNH HÌNH B NH CÚM A/H5N1 1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U S N XU HI N NAY 1.3 GI I THI U VACXI CĨ PHƠI 1.3.1 Nguyên li u s n xu t 1.3.2 Ch ng s n xu t 1.3.3 Quy trình s n xu t ki m nh vacxin cúm A/H5N1 tr ng gà có phơi 1.3.4 Tiêu chu n ch t lư ng c a vacxin cúm A/H5N1 1.4 OVALBUMIN 1.4.1 c tính 1.4.2 C u t o 1.4.3 Tính sinh mi n d ch 1.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HI N OVALBUMIN VÀ KHUY N CÁO V CÁCH PHÁT TRI 1.5.1 Các phư ng pháp phát hi n ovalbumin 1.5.1.1 Phư ng pháp Ouchterlony (khuy ch tán mi n d ch kép) 1.5.1.2 Phư ng pháp i n di mi n d ch 1.5.1.3 Phư ng pháp mi n d ch phóng x 1.5.1.4 Phư ng pháp ELISA – K thu t ch t h p ph mi n d ch g n enzyme (Enzyme – 1.5.2 Các khuy n cáo v cách phát tri n th m nh phư ng pháp 1.6 S N XU T KHÁNG TH VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CH 1.6.1 Tá ch t 15 1.6.2 Quy trình gây mi n d ch c b n t o kháng th a dòng 16 1.6.3 Tinh ch kháng th IgG 17 1.6.3.1 K t t a IgG t huy t ho c d ch sinh v t khác b ng (NH4)2SO4 18 1.6.3.2 Tinh ch IgG nh s c kí trao i ion 18 1.6.3.3 Tinh ch IgG nh c t l c protein A- ho c protein G-sepharose 4B 1.6.4 Ki m tra n ng 2.1 TH I GIAN VÀ 19 s ch c a huy t sau tinh ch 20 A I M NGHIÊN C U 22 2.2 V T LI U 22 2.2.1 Sinh ph m 22 2.2.2 Súc v t thí nghi m 22 2.2.3 Hoá ch t dung d ch chu n 22 2.2.4 Thi t b 23 2.2.5 D ng c 24 2.3 PHƯƠNG PHÁP 24 2.3.1 Mi n d ch th 2.3.2 Xác thu huy t kháng ovalbumin 24 nh hi u giá kháng th th kháng ovalbumin b ng phư ng pháp khuy ch tán mi n d ch kép (Ouchterlony) 26 2.3.2.1 Nguyên t c 26 2.3.2.2 Ti n hành 26 2.3.3 Tinh ch kháng th kháng ovalbumin b ng c t HiTrap protein G HP .27 2.3.3.1 Tinh ch 27 2.3.3.2 Phư ng pháp 2.3.4 Phư ng pháp i n di SDS-PAGE i n di mi n d ch 2.3.5 Xây d ng phư ng pháp ELISA ki m tra s ch c a huy t sau tinh ch 28 i lưu 30 nh lư ng ovalbumin vacxin cúm A/H5N1 31 2.3.5.1 Nguyên lý 31 2.3.5.2 Các bư c ti n hành 31 2.3.6 Th m nh phư ng pháp 33 2.3.6.1 Xây d ng ng chu n nh y c a ph n ng 33 2.3.6.2 Xác nh xác c a phư ng pháp 33 CHƯƠNG III: K T QU VÀ BÀN LU N 36 3.1 ÁNH GIÁ QUY TRÌNH MI N D CH VÀ S N XU T KHÁNG TH TH KHÁNG OVALBUMIN 37 3.2 TINH CH KHÁNG TH TH (IgG) KHÁNG OVALBUMIN 40 3.3 XÂY D NG H ELISA 3.3.1 Ch n h 3.3.2 Xác 3.4 TH M NH LƯ NG OVALBUMIN 43 m khóa phi n 43 nh n ng kháng th phù h p cho ph phi n 44 NH PHƯƠNG PHÁP 46 3.4.1 Xây d ng ng chu n 46 3.4.2 K t qu xác nh nh y c a ph n ng 47 3.4.3 K t qu xác nh xác úng c a phư ng pháp .49 3.4.4 So sánh v i phư ng pháp 3.5 NG D NG H i n di mi n d ch ELISA i lưu 55 NH LƯ NG OVALBUMIN TRONG TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 56 4.1 K T LU N 59 4.1.1 S n xu t kháng th 4.1.2 th kháng ovabumin 59 ã s d ng c t HiTrap protein G HP tinh ch (IgG) kháng ovalbumin t huy t th 4.1.3 Xây d ng th m nh ch thành công kháng th thô 59 ELISA gián ti p nh lư ng ovalbumin vacxin cúm A/H5N1 59 4.2 KI N NGH 60 TÀI LI U THAM KH O PH L C DANH M C CÁC B NG B ng 3.1 K t qu áp ng kháng th c a th sau m i tiêm th nh t 37 B ng 3.2 K t qu hi u giá kháng th B ng 3.3 K t qu kháng th sau tinh ch 41 B ng 3.4 nh y c a ph n B ng 3.5 M t sau m i tiêm 38 ng (LOD LOQ) 48 quang n n c a l n th nghi m 51 B ng 3.6 l p l i c a ph n ng 52 B ng 3.7 xác úng c a ph n B ng 3.8 K t qu ELISA ng 54 nh lư ng m u ovalbumin 56 DANH M C CÁC HÌNH Hình 2.1 S mi n d ch 25 Hình 2.2 S l y máu 25 Hình 2.3 K thu t ELISA gián ti p nh lư ng kháng nguyên ovalbumin 35 Hình 3.1 Tiêu b n nhu m Coomassie phư ng pháp Ouchterlony phát hi n kháng th kháng ovalbumin 39 Hình 3.2 o n thu th bi u di n phân c tinh ch huy t kháng ovalbumin 40 Hình 3.3 Tiêu b n nhu m Coomassie b n i n di SDS-PAGE (10% SDS) m u huy t 42 Hình 3.4 ELISA Hình 3.5 th bi u di n s m khóa phi n ph n ng nh lư ng ovalbumin 43 th bi u di n s ovalbumin ph n Hình 3.6 phù h p gi a th phù h p gi a n ng ng ELISA kháng th th kháng nh lư ng ovalbumin 44 ng chu n 46 Hình 3.7 Tiêu b n nhu m Coomassie phư ng pháp i n di i lưu nh lư ng ovalbumin 55 -1- B nh cúm A/H5N1 s lây lan nhanh t mts th nư c châu Á, gi i v i 229 ngư i nhi m b nh, ó 131 ngư i t von Các trư ng h gi a ngư i v nh, vi c virus cúm A lây nhi m t Trư c nguy c vào cu c Vacxin gi m t l m c b nh t l cúm “thơng thư ng” s lư ng m c giá cao [3] nên không th d ch x y ra, h n T ch c Y t th s n xu t vacxin cúm A/H5N1 bov s c kho A/H5N1 thích h cúm qu c t tr cat c ng gà có phơi, t ng qu c gia mà l b o tính an tồn hi u qu T i Vi t Nam, vi n V c xin sinh ph m y t xu t vacxin cúm A/H5N1 cho ngư i b ng phư ng pháp nuôi c y tr phôi Vi n vacxin cúm ph i -2- c a B Y t Vi t Nam TCYTTG M t s tiêu chu n ó hàm lư ng ovalbumin, protein lịng tr ng tr ng, thành ph n có kh n ng gây d ng r t cao Theo tiêu chu n c a TCYTTG, lư ng ovalbumin m i li u vacxin cúm A/H5N1 s n xu t t vi c tìm m t phư ng pháp xác nh hàm lư ng ovalbumin v i xác cao m t lư ng ovalbumin như: ELISA, ó cho th y, phư ng pháp ELISA phư ng pháp cho r t cao, có kh n ng phát hi n ovalbumin m kít ELISA dùng ti n hành ki m trang thi t b hi n có, chúng tơi ti n hành nghiên c XU T KHÁNG TH OVALBUMIN TRONG VACXIN CÚM A/H5N1” M c tiêu S n xu t kh ng th th kháng ovalbumin Tinh ch kháng th (IgG) kháng ovalbumin ng d ng kháng th kháng ovalbumin tinh ch nh lư ng ovalbumin m u vacxin cúm A/H5N1 b ng phư ng pháp ELISA phư ng pháp i n di mi n d ch i lưu -54- B ng 3.7 N ng lý thuy t c a m u “spiked” ( g/ml) H s phân tán (CV%) c a m u th th nghi m khác l p l i 95,42% cho th y pháp không ch Như v y, phư ng pháp ELISA xác r t cao ( l n thí nghi m -55- 3.4.4 So sánh v i phư ng pháp so sánh vi c nh lư ng ovalbumin, phư ng pháp i n di mi n d ch Kháng th ovalbumin tinh ch v i n ng V c i n ng t gi ng phía c c âm v gi ng phía c c dư ng K t qu KN-KT n ng không th y xu t hi n cung ngưng k t d ch i lưu ch Hình 3.7 Tiêu b n nhu m Coomassie phư ng pháp di i lưu nh lư ng ovalbumin Như v y, v i th i gian th c hi n ng n (1 ngày, lúc lư ng m u l n, (CV 95%, b ng 3.7), phư ng pháp ELISA nghiên c u phư ng pháp có ưu th ovalbumin in vư t tr i vi c c xây d ng nh lư ng -56- 3.5 NG D NG H ELISA TRONG VACXIN CÚM A/H5N1 Sau t i ưu hoá thông ovalbumin (trong vacxin cúm ovalbumin thô s n xu t t s d ng th m nh phư ng pháp M i m u ov lpl i (B ng 3.8) B ng 3.8 K t qu Theo k t qu b ng 3.8 cho th y: N ng ovalbumin lòng tr ng tr ng cao nh t (3 g/ml) ovalbumin thành ph n c a lịng tr ng tr ng Tuy nhiên, ovalbumin d ch ni u n m (ni u nang) r t (