Dũng tế bào P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0
Số giếng thực hiện
dung hợp tế bào 144 144 144 144 288 288
Số giếng cú tế bào
lai 102 117 109 124 211 241
Hiệu quả lai 70,83 % 81,25 % 75,69 % 86,11 % 73,2 % 83,6 %
Như vậy tỷ lệ giếng cú tế bào lai dũng Sp2/0- Ag14 của chuột số 2 và số 3 cao hơn hẳn so với với dũng P3X- Ag18.
51
Tế bào lỏch của chuột số 2 và 3 lai với dũng Sp2/0-Ag14 cho tổng số kết quả lai bằng 83,6% . Trong khi ủú dũng P3X-Ag18 cú kết quả lai bằng 73,2%.
A B
Hình 8. (A) Tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder. (B) Tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-Ag18 với
tế bào lympho B kháng progesteron trên nền tế bào feeder;
Trong quỏ trỡnh nhõn nuụi tế bào, chỳng tụi nhận thấy tế bào Sp2/0- Ag14 cú sức sống mạnh hơn, tế bào sinh sản nhanh hơn so với dũng tế bào P3X-Ag18 trong ủiều kiện bỡnh thường với cả hai loại mụi trường DMEM và RPMI 1640, ủiều này cú thể giải thớch nguyờn nhõn dẫn ủến sự khỏc biệt về kết quả lai giữa tế bào lymphoB với tế bào Sp2/0-Ag14 và P3X-Ag18.
4.3. Tỏch dũng tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron progesteron
Theo giả thuyết của Burnet (đặng đức Trạch và cs, 1987) về quỏ trỡnh hỡnh thành khỏng thể thỡ mỗi dũng tế bào Lympho B của hệ miễn dịch chịu trỏch nhiệm sản xuất một loại khỏng thể khỏng một quyết ủịnh khỏng nguyờn sau khi khỏng nguyờn xõm nhập vào cơ thể và kớch thớch quỏ trỡnh hoạt hoỏ dũng tế bào này. Tuy nhiờn, số dũng tế bào lympho B ủược hoạt hoỏ và tổng hợp khỏng thể là rất nhiều (khỏng thể ủa dũng) ngay khi cả cơ thể ủược gõy
52
miễn dịch bằng một loại khỏng nguyờn tinh chế. Do ủú, khi cú tế bào lai, việc tạo dũng ( một tế bào ban ủầu) và chọn dũng cần ủược thực hiện.
Trong thớ nghiệm của chỳng tụi, tất cả cỏc giếng cú tế bào lai ủược kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng progesteron bằng phương phỏp ELISA. Cỏc giếng cú giỏ trị OD nhỏ hơn hoặc bằng 0,3 ủược xem là õm tớnh. Kết quả cụ thể ủược trỡnh bày ở bảng 4.
Trong phản ứng ELISA sàng lọc này, chỳng tụi sử dụng progesteron làm khỏng nguyờn thay vỡ progesteron -Al. Sở dĩ như vậy vỡ mục tiờu của chỳng tụi là chọn ủược những dũng tế bào lai sinh khỏng thể khỏng progesteron ủể phục vụ cho việc phỏt hiện sự cú mặt cũng như xỏc ủịnh hàm lượng progesteron ở cỏc ủộng vật, nhất là ở ủộng vật cú chửa. Kết quả bảng 4. cho thấy:
- Số giếng cú sinh khỏng thể khi lai với tế bào Sp2/0-Ag14 cao hơn so với dũng P3X-Ag18.
- Số giếng cú tế bào lai sinh khỏng thể mong muốn ủạt tỷ lệ % cao so với tổng số giếng cú tế bào lai cho thấy quỏ trỡnh gõy miễn dịch của chỳng tụi là phự hợp, ủạt hiệu quả cao.
- đồng thời khỏng nguyờn P3-Al mà chỳng tụi sử dụng trong thớ nghiệm này là ủạt tiờu chuẩn của khỏng nguyờn. Do vậy, cú thể sử dụng P3-Al trong cỏc thớ nghiệm tiếp sau này.
53
Bảng 4. Tỷ lệ giếng cú khỏng thể khỏng progesteron trờn tổng số giếng cú tế bào lai
Chuột thớ nghiệm Chuột số 2 Chuột số 3 Tổng số
Dũng tế bào myeloma P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 Số giếng cú khỏng thể khỏng
progesteron 18 22 15 20 33 42
Số giếng cú (khỏng thể khỏng
P3 -Al) 42 51 39 43 81 94
Số giếng cú tế bào lai 102 117 109 124 211 241 Tỷ lệ giếng cú KT/giếng cú tế
bào lai 58,8% 62,4% 49,5% 50,8% 54,0% 56,4%
A B
Hình 9. (A) tế bào lai hybridoma giữa dòng Sp2/0-Ag14 với tế bào lympho B kháng progesteron sau quá trình tách dòng; (B) Clone tế bào lai hybridoma giữa dòng P3X-
54 Như vậy:
Tỷ lệ số giếng cho khỏng thể của chuột 2 cao hơn của chuột 3, ủiều này cho thấy, kết quả tế bào lai cú sinh khỏng thể phụ thuộc nhiều vào sự ủỏp ứng miễn dịch của chuột, chuột cú hiệu giỏ khỏng thể cao sẽ cho nhiều giếng cú khỏng thể hơn chuột cú hiệu giỏ khỏng thể thấp.
+ Bằng phương phỏp ELISA, chỳng tụi cũng sàng lọc ủược những giếng cú khỏng thể khỏng ủặc hiệu progesteron (chứ khụng phải khỏng P3- Al) ủể tiến hành tỏch dũng phục vụ cho cỏc bước tiếp theo.
+ Do nhận thấy cỏc ủặc tớnh tế bào lai của dũng Sp2/0-Ag14 trội hơn so với dũng P3X-Ag18 nờn chỳng tụi lựa chọn giếng tế bào lai sinh khỏng thể khỏng Progesteron cú giỏ trị OD cao nhất của dũng Sp2/0-Ag14 ủể tỏch dũng.
Bảng 5. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh khỏng thểủơn dũng khỏng Progesteron trờn 2 dũng tế bào. Dũng tế bào Cỏc chỉ số thớ nghiệm P3X Sp2/0 Tổng số giếng nuụi tế bào 288 288 Số giếng cú tế bào lai 211 241 Tỷ lệ % tế bào lai so với tổng số giếng 73,2% 83,6% 18(chuột 2) + 15(chuột 3) = 33 22(chuột 2) + 20(chuột 3) = 42 Số giếng cú khỏng thể
khỏng Progesteron Giếng E12/ủĩa2 (OD=2,707) BSA (OD= 0,355) Giếng B3/ủĩa1 (OD=3,076) BSA (OD= 0,355) Tỷ lệ % số giếng cú KT khỏng Progesteron 15,64% 17,43%
55
Sau khi kiểm tra khả năng sinh khỏng thể khỏng Progesteron của cỏc giếng cú tế bào lai bằng phương phỏp ELISA, chỳng tụi chọn ủược một giếng cú giỏ trị OD cao nhất (giếng B3/ủĩa 1/ tế bào Sp2/0, OD =3,076) ủể tiến hành tỏch dũng bằng phương phỏp pha loóng tới hạn sao cho cú khụng quỏ 1 tb/giếng. Kết quả tỏch dũng ủược thể hiện ở bảng sau:
Bảng 6. Hiệu quả tỏch dũng bằng phương phỏp pha loóng tới hạn
Số clone/giếng
đĩa TN 0 clone/giếng 1 clone/giếng ≥2 clone/giếng
đĩa 1 30/96 50/96 16/96
đĩa 2 15/96 70/96 11/96
đĩa 3 42/96 36/96 18/96
Tổng số 87/288 156/288 45/288
Hiệu quả 30,21% 54,17% 15,63%
Như vậy trong tổng số 288 giếng ở 3 khay thỡ cú 156 giếng cú mật ủộ 1clone/giếng, ủạt hiệu quả tỏch dũng là 54,17%. Tế bào ủược nuụi trong khoảng thời gian 2 tuần, sau ủú thu dịch nổi và sử dụng phương phỏp ELISA ủể kiểm tra sự cú mặt của khỏng thể khỏng ủặc hiệu Pogesteron trong dịch nổi của cỏc giếng cú 1clone tế bào/ giếng sau khi tỏch dũng.
Sau khi kiểm tra 156 giếng cú 1clone/ giếng bằng phương phỏp ELISA thỡ chỳng tụi chỉ thu ủược 35 giếng cú dịch nổi cú phản ứng dương tớnh với khỏng nguyờn progesteron.
Như vậy chỉ cú 35 clone tế bào sản xuất khỏng thể khỏng lại progesteron. đõy chớnh là khỏng thể ủơn dũng (01 clone tế bào) mà chỳng ta mong muốn.
Kết quả tỏch dũng với 35 giếng cú phản ứng dương tớnh cho thấy sự cú mặt của khỏng thể khỏng progesteron ủược thể hiện ở bảng 7
56 Bảng 7: Giỏ trị OD của dịch nổi của cỏc giếng dương tớnh khỏng progesteron cú 1 dũng tế bào STT Tờn giếng đĩa TN Giỏ trị OD (n=3) 1 A8 1 0,927 ổ 0,019 2 A11 1 0,878 ổ 0,018 3 C2 1 0,619 ổ 0,012 4 C4 1 0,509 ổ 0,010 5 D7 1 0,796 ổ 0,016 6 E3 1 0,76 ổ 0,015 7 E7 1 1,983 ổ 0,040 8 E9 1 0,732 ổ 0,015 9 F1 1 0,468 ổ 0,009 10 F9 1 0,680 ổ 0,031 11 G2 1 0,462 ổ 0,015 12 G9 1 1,542 ổ 0,013 13 H3 1 0,764 ổ 0,011 14 H6 1 0,650 ổ 0,010 15 B9 2 0,531 ổ 0,015 16 C6 2 0,502 ổ 0,017 17 E6 2 0,864 ổ 0,010 18 F2 2 0,504 ổ 0,015 19 F11 2 0,742 ổ 0,017 20 F12 2 0,872 ổ 0,018 21 G4 2 0,889 ổ 0,033 22 G12 2 1,673 ổ 0,029 23 H4 2 1,437 ổ 0,040 24 H8 2 1,979 ổ 0,015 25 H12 2 0,745 ổ 0,014 26 A3 3 0,678 ổ 0,012 27 B5 3 0,579 ổ 0,010 28 C7 3 0,491 ổ 0,013 29 C8 3 0,647 ổ 0,012 30 F9 3 0,608 ổ 0,016 31 G5 3 0,648 ổ 0,010 32 G10 3 0,789 ổ 0,012 33 G11 3 0,502 ổ 0,016 34 H2 3 0,613 ổ 0,038 35 H6 3 0,787 ổ 0,019 đC + 1,921 đC - 0,355
57 Kết quả cho thấy:
Trong 35 giếng dương tớnh, cỏc giếng khỏc nhau cú giỏ trị OD khỏc nhau. điều này chỳng tỏ mỗi dũng tế bào khỏc nhau thỡ khả năng sinh khỏng thể cũng khỏc nhau. Vỡ vậy cú thể thấy cỏc giếng cú tế bào lai sinh khỏng thể cú chất lượng cao phụ thuộc nhiều vào dũng tế bào lympho B cú ủỏp ứng miễn dịch tốt với khỏng nguyờn hay khụng và dũng tế bào Myeloma (qua thực nghiệm ủó chứng minh dũng tế bào Sp2/0-Ag14 tốt hơn dũng P3X-Ag18).
Từ kết quả của bảng 7: chỳng tụi chọn ra 5 dũng tế bào sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng ủặc hiệu Progesteron tốt nhất tương ứng với 5 giếng cú giỏ trị OD cao nhất là:
+ Giếng E7 ủĩa 1 với giỏ trị OD = 1,983 ủặt tờn là MCAP1 + Giếng G9 ủĩa 1 với giỏ trị OD = 1,542 ủặt tờn là MCAP2 + Giếng G12 ủĩa 2 với giỏ trị OD = 1,673 ủặt tờn là MCAP3 + Giếng H4 ủĩa 2 với giỏ trị OD = 1,437 ủặt tờn là MCAP4 + Giếng H8 ủĩa 2 với giỏ trị OD = 1,979 ủặt tờn là MCAP5
Với 5 dũng tế bào ủó chọn lọc, chỳng tụi tiến hành nuụi in vitro ủể cú số lượng lớn tế bào. để quỏ trỡnh nhõn nuụi ủạt kết quả tốt, từ 5 dũng tế bào chọn ủược chỳng tụi ủưa vào 5 chai nuụi cấy sao cho ủạt nồng ủộ 1ì 105 tế bào/ml. Cỏc chai nuụi cấy ủược bổ sung mụi trường thớch hợp cho cỏc tế bào lai phỏt triển tốt và nuụi trong tủ ấm 370C, 5% CO2. Mụi trường nuụi cấy chỳng tụi sử dụng gồm cỏc thành phần: DMEM và bổ sung FBS 10%.
4.3.1 Chọn lọc dũng tế bào sinh khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu và ủộ nhạy cao
* Tớnh ủặc hiệu
để khẳng ủịnh tớnh ủặc hiệu của khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron của 5 dũng tế bào thu ủược ở trờn, chỳng tụi tiến hành kiểm tra bằng phương phỏp ELISA. Kiểm tra tớnh ủặc hiệu của khỏng thể ủơn dũng sinh ra là kiểm tra khả năng kết hợp của khỏng thể ủơn dũng với khỏng nguyờn và cỏc chất
58
khỏc cú cấu trỳc phõn tử tương tự như Progesteron và cú trong huyết thanh là hormon steroid như progesteron, estradiol, testosteron, corticosteron và pregnenolon. Ngoài progesteron ra trong mỏu ủộng vật cũn cỏc hormon steroid trờn cú cấu tạo hoỏ học gần giống với progesteron. Chỳng tụi dựng khỏng thể ủơn dũng mới thu ủược lần lượt thử nghiệm với ủại diện cỏc nhúm khỏng nguyờn cú cấu tạo hoỏ học gần giống với Progesteron núi trờn và thu ủược kết quả qua bảng 8 như sau:
Bảng 8. Tớnh ủặc hiệu của khỏng thểủơn dũng do 5 dũng tế bào tạo ra
S TT
Khỏng nguyờn
Dũng tế bào Progesteron Estradiol Testosteron Corticosteron Pregnenolon
1. MCAP1 + - - - + 2. MCAP2 + - + + - 3. MCAP3 + - - - - 4. MCAP4 + - - - + 5. MCAP5 + - + - - Ghi chỳ: (+): dương tớnh; (-) õm tớnh Kết quả ở bảng 8. cho thấy:
- Cỏc dũng MCAP1 và MCAP4 ủều cho kết quả dương tớnh với 2 loại khỏng nguyờn là progesteron và pregnenolon. Dũng MCAP2 MCAP5 cho kết quả dương tớnh với progesteron nhưng cũng dương tớnh với cả testosteron và corticosteron.
Như vậy, khỏng thể do 4 dũng tế bào này sinh ra cú tớnh ủặc hiệu khụng cao khụng phõn biệt ủược giữa progesteron với cỏc dạng hormon gần giống với chỳng.
- Chỉ cú dũng MCAP3 cho kết quả õm tớnh với Estradiol, Testosteron, Corticosteron, Pregnenolon và chỉ dương tớnh với progesteron chứng tỏ rằng khỏng thể do dũng tế bào này sinh ra cú tớnh ủặc hiệu cao. Chỳng ủó phõn biệt
59
ủược cỏc loại hormon gần giống với progesteron và chỉ khỏng ủặc hiệu progesteron.
Chỳng ta thấy rằng khỏng thể ủơn dũng là khỏng thể chỉ cú khả năng kết hợp ủặc hiệu với một loại khỏng nguyờn duy nhất mà khụng kết hợp với cỏc loại khỏng nguyờn khỏc cho dự chỳng cú cấu tạo hoỏ học gần giống với khỏng nguyờn ủú.
* Khả năng sinh khỏng thể của cỏc dũng tế bào
Một dũng tế bào cú chất lượng cao ngoài khả năng sinh khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu cao cũn cần phải cú sức sống tốt, khả năng sinh khỏng thể nhiều từ ủú mới ủảm bảo tạo ủược một lượng lớn khỏng thể trờn quy mụ cụng nghiệp, ủủ ủể phục vụ nhu cầu sản xuất thực tế.
- Dựa trờn kết quả kiểm tra tớnh ủặc hiệu và khả năng phỏt triển của 5 dũng tế bào, chỳng tụi chỉ chọn dũng MCAP3 cú tớnh ủặc hiệu cao, tiếp tục nhõn nuụi thu dịch nổi, lưu giữ tế bào trong Nitơ lỏng và gõy bỏng cho chuột nhằm thu lượng khỏng thể cao.
4.4. Gõy bỏng cho chuột
Khỏng thể ủơn dũng cú thể thu nhận từ dịch nổi của chai nuụi tế bào hybridoma. Tuy nhiờn theo Karsten và Rudloph (1985) thỡ ta cú thể thu nhận ủược khỏng thể cao hơn từ 100 ủến 1000 lần nếu tiờm cỏc tế bào lai vào xoang bụng của chuột ủó ủược tiờm pristane trước ủú 2 tuần. Sau khoảng từ 7 ủến 12 ngày bụng chuột cú bỏng to thỡ thu dịch bỏng. Trong thớ nghiệm này, chỳng tụi ủó gõy bỏng thành cụng ủược 2 con chuột (số 5 và số 10)/ 10 chuột cỏi BALB/c bằng dũng MCAP3 và thu ủược khoảng 5ml/con/lần ủược 3-5 lần/con.
4.5. Kiểm tra hiệu giỏ khỏng thể
Dịch bỏng thu ủược lưu giữ ở 4ỨC qua ủờm trước khi ủược chỳng tụi tiến hành tinh sạch bằng phương phỏp kết tủa với Saturated Amonium Sulphate (SAS) hoặc bằng Propur Kit của hóng Nunc.
60
đối với dịch nổi nuụi cấy của dũng MCAP3 chỳng tụi sử dụng mụi trường nuụi cấy ủặc biệt khụng cú huyết thanh (Hybridoma Medium) của hóng GIBCO BRL. Chỳng tụi nhận thấy tế bào phỏt triển tốt trong loại mụi trường này ủạt 1x106 tế bào/ 3 ngày. Sau 3 ngày nuụi cấy, dịch nổi ủược thu giữ và cất ở 4oC qua ủờm trước khi tinh sạch bằng phương phỏp SAS hoặc bằng Propur Kit.
Trước khi tiến hành tinh sạch, dịch nổi và dịch bỏng ủược chỳng tụi tiến hành kiểm tra hiệu giỏ khỏng thể. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 9.
Bảng 9. So sỏnh hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi và dịch bỏng. STT độ pha loóng STT độ pha loóng Mẫu TNo 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000 lần 1 Dịch nổi (nguyờn) ++++ +++ +++ ++ ++ + - 2 Dịch bỏng (pha loóng 20 lần) ++++ +++ +++ ++ ++ + -
(++++): màu rất ủậm (++): màu ủậm vừa (-):khụng màu (+++): màu ủậm (+): màu nhạt
A B
Hình 10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng ở các độ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần.
10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần
61
Quan sỏt bảng 9. ta thấy hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi và dịch bỏng thể hiện là như nhau nhưng hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi là nguyờn bản trong khi ủú hiệu giỏ khỏng thể của dịch bỏng ủó pha loóng 20 lần.
Như vậy cú nghĩa là hiệu giỏ khỏng thể ủơn dũng trong dịch bỏng cao gấp khoảng 20 lần so với dịch nổi. đồng thời kết quả thớ nghiệm cho thấy hiệu giỏ khỏng thể thu ủược là cao (500 lần của dịch nổi) và 10.000 lần của dịch bỏng, từ ủú cú thể phục vụ cho mục ủớch thương mại.
Sau khi thu ủược dịch nổi và dịch bỏng của dũng tế bào MCAP3 chỳng tụi tiến hành tinh sạch bằng SAS và Propur Kit. Kết quả tinh sạch ủược trỡnh bày ở bảng 10.
Nhỡn vào bảng 10, ta thấy tổng lượng khỏng thể ủơn dũng khỏng Progesteron tinh sạch ủược bằng SAS là 1,808mg. Trong khi ủú tinh sạch bằng Propur Kit là 2,55mg.
Bảng 10. Kết quả tinh sạch khỏng thểủơn dũng bằng (SAS) và Propur Kit.
Sử dụng SAS Sử dụng Propur Kit
Dũng tế bào Dịch nổi (100ml) Dịch bỏng pha loóng 10 lần (50ml) Tổng lượng MoAb thu ủược Dịch nổi (100ml) Dịch bỏng