STT ðộ pha loóng Mẫu TNo 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000 lần 1 Dịch nổi (nguyờn) ++++ +++ +++ ++ ++ + - 2 Dịch bỏng (pha loóng 20 lần) ++++ +++ +++ ++ ++ + -
(++++): màu rất ủậm (++): màu ủậm vừa (-):khụng màu (+++): màu ủậm (+): màu nhạt
A B
Hình 10. Kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng ở các độ pha loãng khác nhau; (A) Dịch nổi; (B) Dịch báng pha loãng 20 lần.
10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần 10 lần 50 lần 100 lần 200 lần 500 lần 1000lần Âmtớnh 5 lần
61
Quan sỏt bảng 9. ta thấy hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi và dịch bỏng thể hiện là như nhau nhưng hiệu giỏ khỏng thể của dịch nổi là nguyờn bản trong khi ủú hiệu giỏ khỏng thể của dịch bỏng ủó pha loóng 20 lần.
Như vậy cú nghĩa là hiệu giỏ khỏng thể ủơn dũng trong dịch bỏng cao gấp khoảng 20 lần so với dịch nổi. ðồng thời kết quả thớ nghiệm cho thấy hiệu giỏ khỏng thể thu ủược là cao (500 lần của dịch nổi) và 10.000 lần của dịch bỏng, từ ủú cú thể phục vụ cho mục ủớch thương mại.
Sau khi thu ủược dịch nổi và dịch bỏng của dũng tế bào MCAP3 chỳng tụi tiến hành tinh sạch bằng SAS và Propur Kit. Kết quả tinh sạch ủược trỡnh bày ở bảng 10.
Nhỡn vào bảng 10, ta thấy tổng lượng khỏng thể ủơn dũng khỏng Progesteron tinh sạch ủược bằng SAS là 1,808mg. Trong khi ủú tinh sạch bằng Propur Kit là 2,55mg.
Bảng 10. Kết quả tinh sạch khỏng thểủơn dũng bằng (SAS) và Propur Kit.
Sử dụng SAS Sử dụng Propur Kit
Dũng tế bào Dịch nổi (100ml) Dịch bỏng pha loóng 10 lần (50ml) Tổng lượng MoAb thu ủược Dịch nổi (100ml) Dịch bỏng pha loóng 10 lần (50ml) Tổng lượng MoAb thu ủược MCAP 3 0,43 àg/ml x 100 ml (43àg) 35,3 àg/ml x 50 ml (1,765mg) 1,808 mg 0,45 àg/mlx 100 ml (45àg) 50,1àg/ml x 50 ml (2,505mg) 2,55 mg
Tổng lượng KTðD khỏng Progesteron thu ủược là 4,358 mg
Như vậy cú sự khỏc nhau rừ rệt khi tinh sạch bằng SAS và sử dụng Propur Kit. Sử dụng Propur Kit ủể tinh sạch khỏng thể sẽ thu ủược lượng khỏng thể cao hơn so với phương phỏp SAS.
Lượng khỏng thể ủơn dũng thu ủược ở trờn ủược chỳng tụi lưu giữ bằng ủệm PBS ở nồng ủộ 1mg/ml và cất ở -80oC.
62
Với mục ủớch là sử dụng khỏng thể ủơn dũng trong thực tiễn sản xuất vớ dụ phỏt hiện ủộng vật cú chửa nờn chỳng tụi ủó sử dụng khỏng thể ủơn dũng thu ủược ở trờn ủể kiểm tra huyết thanh của 6 thỏ thớ nghiệm bằng phương phỏp ELISA. Kết quả ủược trỡnh bày ở bảng 11.
Kết quả từ bảng 11. cho thấy khỏng thể ủơn dũng mà chỳng tụi thu ủược ủó phản ứng ủặc hiệu và phỏt hiện ủược Progesteron trong huyết thanh của thỏ thớ nghiệm. Khụng những thế do ở thỏ khụng chửa thỡ trong mỏu vẫn tồn tại progesteron nờn khỏng thể ủơn dũng ở dịch nổi và dịch bỏng cũng như khỏng thể ủơn dũng tinh sạch vẫn phỏt hiện ủược do vậy cú phản ứng dương tớnh. Tuy nhiờn ở thỏ khụng chửa thỡ hàm lượng prgesteron thấp hơn nhiều so với thỏ chửa. Do vậy cỏc dịch nổi, dịch bỏng và khỏng thể ủơn dũng tinh sạch bị pha loóng ủó khụng thể hiện phản ứng dương tớnh với thỏ khụng chửa trong khi vẫn thể hiện dương tớnh với cỏc thỏ chửa.
Bảng 11. Kết quả kiểm tra huyết thanh thỏ thớ nghiệm
Thỏ chửa Thỏ khụng chửa ðộng vật TN Dịch khỏng thể C1 C 2 C 3 K 1 K 2 K 3 Khụng pha + + + + + + Dịch nổi Pha loóng 10 lần + + + - - - Pha loóng 10 lần + + + + + + Dịch bỏng Pha loóng 50 lần + + + - - - Pha loóng 100 lần (10 àg/ml) + + + + + + Khỏng thể tinh sạch Pha loóng 500 lần (2 àg/ml) + + + - - -
ðiều này cho phộp chỳng tụi kết luận rằng khỏng thể ủơn dũng chỳng tụi thu ủược cú phản ứng ủặc hiệu với progesteron và phõn biệt ủược ủộng vật cú chửa và ủộng vật khụng cú chửa ở tỷ lệ pha loóng phự hợp (500X).
63
5. KẾT LUẬN 5.1 KẾT LUẬN 5.1 KẾT LUẬN
Qua quỏ trỡnh làm việc nghiờm tỳc với cỏc nội dung: gõy ủỏp ứng miễn dịch cho chuột, dung hợp tạo tế bào lai, tỏch dũng tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng ủặc hiệu progesteron, chọn lọc dũng tế bào lai theo mong muốn, tinh sạch khỏng thể, dựng khỏng thể ủơn dũng ủó sản xuất ủể kiểm chứng phỏt hiện ủộng vật cú chửa, chỳng tụi rỳt ra một số kết luận sau:
1. Tiến hành gõy miễn dịch với liều lượng khỏng nguyờn P3 - Al bằng 200àg/con/lần tiờm sẽ cho ủỏp ứng miễn dịch tốt nhất. ðỏp ứng miễn dịch của cơ thể khụng những phụ thuộc vào liều lượng khỏng nguyờn gõy miễn dịch mà cũn phụ thuộc vào cỏ thể ủộng vật.
2. Sau dung hợp và tỏch dũng chỳng tụi, ủó chọn ra ủược 05 dũng tế bào cú khả năng sinh khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron như mong muốn. 3. Trong quỏ trỡnh nhõn nuụi và dung hợp tế bào, chỳng tụi nhận thấy tế bào lai giữa tế bào lympho B với tế bào Sp2/0-Ag14 cú sức sống mạnh hơn, tế bào sinh sản nhanh hơn so với dũng tế bào P3X-Ag18 trong ủiều kiện bỡnh thường với cả hai loại mụi trường nuụi cấy là DMEM và RPMI 1640.
4. Trong 5 dũng tế bào lai sinh khỏng thể ủơn dũng ủược chọn lọc dũng tế bào MCAP3 cú khả năng sinh sản tốt, khỏng thể cú tớnh ủặc hiệu và hiệu giỏ khỏng thể cao ủể nhõn nuụi, gõy bỏng trờn chuột và bảo quản trong nitơ lỏng. 5. Cú sự khỏc nhau rừ rệt khi tinh sạch bằng hai phương phỏp SAS và sử dụng Propur Kit. Sử dụng Propur Kit tinh sạch khỏng thể sẽ cho hiệu suất cao hơn so với SAS.
6. Khỏng thể ủơn dũng chỳng tụi thu ủược cú phản ứng ủặc hiệu với progesteron và sử dụng trong ELISA ủó phõn biệt ủược ủộng vật cú chửa và ủộng vật khụng cú chửa.
64
5.2 ðỀ NGHỊ
Quy trỡnh sản xuất khỏng thể ủơn dũng gồm nhiều giai ủoàn khỏc nhau, trong quỏ trỡnh ủú việc sử dụng phương phỏp ELISA ủể sàng lọc, kiểm tra và ủỏnh giỏ khỏng thể ủơn dũng là cần thiết và thực sự ủó ủem lại hiệu quả. Tuy nhiờn ủể hoàn thành cỏc bước của quy trỡnh và cú ủược khỏng thể ủơn dũng chất lượng cao hơn ủỏp ứng ủược việc tạo kớt ủịnh lượng progesteron thỡ cần phải nghiờn cứu sõu hơn nữa. ðặc biệt, việc phõn tớch cỏc ủặc tớnh quan trọng của khỏng thể ủơn dũng thu ủược như xỏc ủịnh isotope ủặc hiệu, xỏc ủịnh ỏi lực khỏng nguyờn - khỏng thể vv.
ðề tài của chỳng tụi mới chỉ cú ủược những kết quả bước ủầu, tạo ủược những dũng tế bào lai sản xuất khỏng thể ủơn dũng khỏng progesteron năng suất cao, chất lượng tốt. Chỳng tụi mong muốn ủược tiếp tục nghiờn cứu theo hướng này ủể tạo ra ủược sản phẩm cuối cựng là bộ kớt chuẩn ủể ủịnh lượng progesteron trong dịch sinh học (mỏu, nước tiểu...) phục vụ cho nghành chăn nuụi nước nhà.
65
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Vũ Triệu An, Lờ ðức Cơ, Văn ðỡnh Hoa, Nguyễn Ngọc Lanh,
ðỗ Trung Phấn, Phạm Hoàng Phiệt (1981), Những kỹ thuật cơ
bản dựng trong miễn dịch học, NXB y dược học.Tr5-284
2. Vũ Triệu An, Jean Claude Homber (1998), Miễn dịch học, NXB Y học Hà Nội. Tr 7- 277.
3. Nguyễn Tấn Anh (1998), Sinh lớ sinh sản gia sỳc, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội.
4. Lờ Trần Bỡnh, Phan Văn Chi, Nụng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lờ Quang Huấn (2003), Áp dụng cỏc cỏc kỹ thuật phõn tử trong nghiờn cứu tài nguyờn sinh vật Việt Nam, NXB KHKT Hà Nội
5. Trần Tiến Dũng, Dương ðỡnh Long, Nguyễn Văn Thanh (2002), Sinh sản gia sỳc, NXB Nụng nghiệp, Hà Nội. Tr: 65, 107, 227- 231
6. Trần Tiến Dũng (2003), “ðịnh lượng một số hormon sinh sản và sử dụng hormon tổng hợp Estrumate khắc phục hiện tượng rối loạn sinh sản ở trõu”, Tạp chớ KHKT thỳ y, Hội thỳ y Việt Nam.Tr: 71- 74. 7. Nguyễn Thị Hà (2001), Húa sinh hormone, NXB Y học Hà Nội. Tr:
527.
8. Lờ Văn Hựng (2002), Miễn dịch học thỳ y, NXB Nụng nghiệp Tr7- 189
9. Phan Văn Kiểm, Nguyễn Quý, Quỳnh Hoa (2003), “ Kết quả nghiờn cứu hàm lượng progesteron ở bũ lai hướng sữa bằng kĩ thuật miễn dịch enzyme”, Hội nghị Cụng nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr: 607- 610.
66
10. Phan Văn Kiểm, Trịnh Quang Phong, Nguyễn Quý, Quỳnh Hoa, Tăng Xuõn Lưu (2003),“ Ứng dụng kết quả nghiờn cứu hàm lượng
progesteron ủể chẩn ủoỏn và ủiều trị rối loạn sinh sản ở bũ sữa”, Hội nghị Cụng nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr: 708-711.
11.Vừ Thương Lan (2002), Sinh học phõn tử, NXB ðại Học Quốc Gia Hà Nội.
12.ðỗ Phương Liờn (1999), Miễn dịch học cơ sở, NXB ðại Học Quốc Gia Hà Nội.
13.Nguyễn ðỗ Quyờn (2004), Một số yếu tố ảnh hưởng ủến quỏ trỡnh sản xuất khỏng thểủơn dũng, Luận ỏn tiến khoa học sĩ y dược
14.Nguyễn Xuõn Tịnh, Tiết Hồng Ngõn, Nguyễn Bỏ Mựi, Lờ Mộng Loan (1996), Sinh lớ học gia sỳc, NXB Nụng Nghiệp. Tr: 63- 68.
15.Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phương Thảo (2004), Giỏo trỡnh cụng nghệ sinh học nụng nghiệp. Tr: 112- 116.
16.Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học Thỳ y, NXB Nụng nghiệp. Tr: 7 - 10, 40- 45.
Tiếng Anh
17.Anil TM, Shankar TM, Mohan CV (2002) "Monoclonal Antibodies developed for sensitive detection and comparision of white spot syndrome virus isolates in India". Di Aquat Organ, 51(1)pp 67-75. 18.Ariana Celis, Kurt Dejgaard and Julio E.Celis(1994), Production of
moucse monoclonae antibodies cell biology V.2, pp. 269-275.
19.Christopher Daen, Philip Shepkerd (2000)."Monoclonal Antibodies". Cell biology (10-12, 26-28, 118).
67
20.Cole. S.P.C, Kozbor D and Roder J.C.C (1985), “Hybrodoma technology-Bioscicsees and midicine”, Springer- New York, pp.258- 266
21. Engvall E, PerlmanP (1971), Enzyme Linked Iimunosorbent Assay (ELISA).Quantitative assay of immunoglobulin G , Immunochemistry, Sep; 8(9):871-874PMID:5135623
22. Galjre G,Howe S.C, Milstein C, (1977), "Antibodies to major histology compability antigens producced by hybrid cell line. Nature (550-532).
23. Galjre G, and Milstein C, (1981), “Preparation of monoclonal
antibodies strategies and procedures”, Method enzymeol, pp. 34- 36. 24. Gefter.M.L et al (1977). "Simple method for PEG promoted
hybridization of mouse myeloma cell" Somat cell Genet (231-236) 25. Goncalves – S.C, Horta – A.E.M (1999), “The efect of blocking
progesterone in superovulated ewes”, Colectanea – da – EZN
26. Huang, C, X.Zhang, Q.Lin, X.Xu, Z.H.Hu, and, C.L.Hew (2002),
''proteomic analysic of shrimp white spot sydrome viral proteins and characterization of a noval envolope protein VP 466". Mol. Cell. Prot.1, pp 223-231.
27. Hunter.R (1972), “ Ovaries response of the pig to gonadotropin infeted at diference stage of oestrus cycle”, Animal Sience, pp. 457. 28. J. Eryl Liddell and A. Cryer (2002), A practical guide to Monoclonal
Antibody, pp. 25- 27.
29. John Wiley and Sons (2000), Immunology (11.4.2-11.8.2)
30. Juan. S, Bonifacino at al (2000), "Currennt protocols, Cell Biology
68
31. Maurice J. Sauner, John A. Foulkes and Alan D. Cookson (1981),
“Direct enzyme immunoassay of progesteron in bovine milk”, Steroids, volume 38, number 1. UK, pp 45- 52.
Nakao .T, Sugihashi . A, Saga .N, Tsunda .N and Kawata . K (1983),
“An improved Enzyme immunoassay of progesterone applied to bovine milk”, Br. Veterinary Japan, pp. 109- 117.
31. Oliver JP.Leger và Jose.Wsaldanha (2000), Monocnonal Antibodies, Cell Feeder (10-30, 150)
32. Philip Shepker, Chiristopher Dean (2000), Monoclonal Antibodies, Cell 0biology, pp. 10- 12, 26- 28, 118
33. Shuman M, Wild.c.d and Kohler G (1978), A better cell line for marking hybridoma seereting specific antibodies, Nature c. 276, pp. 269- 270.
34. Van De Weil .D.F.M and Koops. W (1986), “Development and validation of an Enzyme immunoassay for progesterone in bovine milk or blood plasma”, Annimal Reproduction Sience, pp. 201- 203. 35. Wu L.S, Guo I.C, Lin J.H (1997), “Pregnancy diagnosis on sows by
using an on farm blood progesterone test”, Asia- Australasian journal of Animal Science, pp. 603- 608.
36..http://www.Chemicon.com 37. http://www.biology.arizona.edu 38. http://www.accessexcellence.org 39. (http://vi.wikipedia.org/wiki/khangthe)