Hoàn thiện quy trình tinh chế kháng thể đơn dòng và sản xuất cộng hợp 6b6c gắn enzyme hrp dùng trong bộ kít mac elisa xét nghiệm sốt xuất huyết dengu

3 Chương I TỔNG QUAN 1.1) VIRUS DENGUE Virus Dengue thành viên nhóm Flavivirus Nhóm nhóm virus thuộc họ Flaviviridae bao gồm khoảng 70 loài virus gây nhiều bệnh khác người động vật virus Dengue gây bệnh sốt Dengue/Sốt xuất huyết Dengue (SD/SXHD), virus viêm não Nhật Bản, virus viêm não St Louis virus West Nile gây bệnh viêm não- viêm màng não người [11], [28] Hình 1.1: Những Flavivirus điển hình (WHO, 2010) Virus Dengue gồm bốn type huyết khác tính chất kháng nguyên DEN–1, DEN–2, DEN–3, DEN–4, gây bệnh SD/SXHD nặng hội chứng sốc Dengue (HCSD) với tỷ lệ tử vong cao, trẻ em Virus truyền bệnh thông qua vector muỗi Aedes aegypti Lâm sàng bệnh Dengue biết hai trăm năm nhiên virus gây bệnh năm 1944 phát Sabin A.B binh lính Calcutta, New Guinea Hawaii Thế chiến thứ II Các virus Ấn Độ, Hawaii chủng New Guinea có kháng nguyên giống gọi chủng mẫu DEN–1 (DEN–1 Hawaii) Ba chủng lại New Guine có kháng nguyên khác với chủng gọi chủng mẫu DEN–2 (DEN-2 New Guinea) Sau hai type huyết khác phát Hammon W.McD tìm bệnh nhân SXH Mannila vào 1956 DEN–3 DEN–4 Hiện nay, virus Dengue có mặt khắp nơi giới trừ Nam cực thuộc type phân lập Từ năm 1956, theo báo cáo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), virus Dengue tác nhân gây 4.600.000 ca nhập viện 55.000 ca tử vong Đông Nam Á, Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Sri Lanka, Pakistan, Cuba, Venezuela, Colombia, Guyana, Puerto Rico Trung Mỹ Ở Đông Nam Á, SXHD 10 nguyên nhân hàng đầu gây tử vong trẻ em từ đến 14 tuổi Hiện nay, có 50 triệu ca bệnh năm 2,5 tỷ người sống vùng lưu hành virus Dengue toàn giới [28] Ở Việt Nam, SXHD vấn để sức khỏe nghiêm trọng Năm 1998 năm có dịch lớn số mắc tử vong SXHD tăng cao (234.920 ca mắc, 337 ca tử vong 56/61 tỉnh thành phố) SXHD xảy chủ yếu miền Nam (chiếm 80% tổng số ca mắc nước) [6] Hình 1.2: Trung bình số ca mắc SD/SXHD số quốc gia báo cáo WHO hàng năm (WHO, 2009) 1.1.1) CẤU TRÚC PHÂN TỬ Virus Dengue virus RNA sợi đơn dương Hạt virus có hình cầu đường kính khoảng 40–60 nm chứa lõi nucleotide đồng kích thước (đường kính khoảng 30 nm) bao quanh lớp lipid kép Phần vỏ virus gồm protein cấu trúc vỏ màng Phần nucleocapsid virus bao gồm protein lõi gene virus [28] Hình 1.3: Cấu trúc phân tử virus Dengue Các virus Dengue trưởng thành gồm protein cấu trúc nucleocapsid hay protein lõi (C; 12kd), protein màng không glycosyl hóa (M; kd), protein vỏ (E; 53kd) thường bị glycosyl hóa Các protein M E liên kết với màng lipid kép neo màng kị nước Protein vỏ E chứa epitop tham gia vào trình xâm nhập virus vào tế bào chủ gây đáp ứng miễn dịch xâm nhập vào thể người động vật Protein M đoạn ly giải protein tiền màng (prM) có vai trò quan trọng chín muồi virus thành dạng gây nhiễm Nucleocapsid gồm protein C RNA Bộ gene virus Dengue gồm RNA sợi đơn dương dài khoảng 11kb Đây RNA thông tin cho cho việc giải mã khung đọc mở đơn mã hóa cho polyprotein Trình tự protein mã hóa ORF virus Dengue 5’-C-prM-ENS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ Phần đầu 5’ gene mã hóa cho protein cấu trúc prM (M) E Các gene mã hóa cho protein khơng cấu trúc nằm phần lại gene Sự giải mã gene virus cho polyprotein, sau polyprotein gia cơng đồng thời sau giải mã cho 10 protein virus trưởng thành Hình 1.4: Cấu trúc gene virus Dengue 1.1.2) CƠ CHẾ SAO CHÉP VÀ NHÂN LÊN CỦA VIRUS DENGUE Virion xâm nhập gắn lên màng tế bào vật chủ xâm nhập vào bên tế bào qua trung gian receptor Khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, môi trường acid, virion Dengue cởi bỏ lớp vỏ giải phóng gene Bộ gene RNA (sợi dương) giải phóng tham gia hai trình Một mặt dịch mã tạo chuỗi polyprotein virus Mặt khác tham gia vào trình tổng hợp nên RNA virus Dengue cách làm khuôn tổng hợp nên sợi RNA bổ xung (sợi -), sợi làm khuôn để tổng hợp nên sợi dương khác Polyprotein virus sau tổng hợp gia công để tạo thành 10 protein virus C, prM, … với có tham gia protease tế bào chủ Sau thành phần virus tổng hợp đầy đủ trình lắp ghép virus xảy bề mặt mạng lưới nội chất Sau q trình giải phóng hạt virus Các hạt virus lại tiếp tục chu trình xâm nhiễm 1.1.3) SỐT DENGUE/SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE 1.1.3.1)Tác nhân gây bệnh Hình 1.5: Cơ chế nhân lên virus Dengue Cả type virus Dengue gây bệnh Tuy nhiên khơng có bảo vệ chéo type người sống vùng có lưu hành virus Dengue có khả mắc Dengue lần đời Và thông thường lần mắc sau thường bị nặng lần mắc đầu 1.1.3.2) Túc chủ Có ba loại túc chủ tự nhiên virus Dengue người, loại khỉ muỗi Aedes Người vật chủ virus Dengue vùng đô thị Ở khỉ nhiễm virus Dengue thường khơng có biểu triệu chứng triệu chứng lâm sàng nhiễm virus Dengue thường thấy người Ngồi túc chủ chưa thấy động vật có xương sống khác nhiễm virus Dengue 1.1.3.3) Vector truyền bệnh Theo Bancroft (1960), muỗi Aedes túc chủ tự nhiên quan trọng virus Dengue gồm có : A.aegypti, A.albopictus, A.scutellaris., A.africanus A.leuteocephalus Hình 1.6: Muỗi Aedes aegypti Ở nước ta có lưu hành hai loại A.aegypti và, A.albopictus Có ba chu kỳ truyền bệnh là: - Chu kỳ rừng rú xảy khỉ loài Aedes rừng - Chu kỳ nông thôn hay bán thành thị người loài Aedes gần người 10 - Chu kỳ thành phố người lồi muỗi Aedes sống nhà Hình 1.7: Chu kì truyền bệnh virus Dengue Rừng rú Nông thôn/bán Thành thị thành thị Châu Phi Châu Á Châu Mỹ Aedes (Diceromyia) Aedes albopictus Aedes aegypti Aedes (Stegomyia) Aedes polynesiensis Aedes albopictus Aedes (Finlaya) Aedes aegypti Aedes polynesiensis Aedes (Stegomyia) Aedes mediovittatus Aedes sp 1.1.3.4) Triệu chứng lâm sàng Triệu chứng lâm sàng bệnh nhiễm virus Dengue thay đổi, từ triệu chứng khơng đặc trưng đến có biểu lâm sàng nặng sốt dengue cổ điển, SXHD, HCSD [1], [28] 11 Sơ đồ 1.1: Các biểu lâm sàng nhiễm virus Dengue Sốt dengue cổ điển Sốt 2-7 ngày với hai số triệu chứng sau: - Đau đầu - Đau sau hốc mắt - Đau cơ/đau khớp - Buồn nơn, ói - Ban đỏ da - Biểu xuất huyết [dấu dây thắt (+), tử ban điểm, chảy máu mũi, chảy máu chân răng, xuất huyết tiêu hóa, rong kinh] - Hematocrit bình thường - Tiểu cầu bình thường Sốt xuất huyết Dengue - Sốt cao 2-7 ngày - Biểu xuất huyết: có biểu sau  Dấu dây thắt (+) 12  Tử ban điểm mảng xuất huyết, bầm nơi tiêm,  Chảy máu mũi, chân  Ói máu, phân đen 100.000/mm3) - Giảm tiểu cầu ( - Thất huyết tương tăng tính thẩm thấu thành mạch, biểu dấu hiệu sau:  Cô đặc máu: Hematocrit tăng 20% so với giá trị bình thường  Các dấu hiệu thất huyết tương (tràn dịch màng phổi, báng bụng, giảm protein máu) Hội chứng sốc Dengue Có tiêu chuẩn sốt xuất huyết Dengue dấu hiệu sốc: - Mạch nhanh, yếu - Huyết áp kẹp (HAmax – HAmin 20 mm Hg) hạ huyết áp (trẻ