KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA VÀ HẤP PHỤ ĐỘC TỐ NẤM MỐC AFLATOXIN CỦA CHẤT HẤP PHỤ AGROLITE MYCOBIND TRONG BẢO QUẢN BẮP

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA VÀ HẤP PHỤ ĐỘC TỐ NẤM MỐC AFLATOXIN CỦA CHẤT HẤP PHỤ AGROLITE MYCOBIND TRONG BẢO QUẢN BẮP Họ tên sinh viên: TRẦN THỊ NGỌC QUYÊN Ngành: BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM Niên khóa: 2007-2011 Tháng 08/2011 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA VÀ HẤP PHỤ ĐỘC TỐ NẤM MỐC AFLATOXIN CỦA CHẤT HẤP PHỤ AGROLITE MYCOBIND TRONG BẢO QUẢN BẮP Tác giả Trần Thị Ngọc Quyên Khóa luận đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp kỹ sư ngành công nghệ thực phẩm Giáo viên hướng dẫn ThS Nguyễn Ngọc Diệp Tháng 08/2011 i LỜI CẢM ƠN Trân trọng bày tỏ lòng biết ơn đến:  Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho làm đề tài tốt nghiệp trường  Giáo viên hướng dẫn Thạc Sĩ Nguyễn Ngọc Diệp tận tình bảo, đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho việc hoàn chỉnh luận văn  Phân viện Cơ Điện Nông Nghiệp Công Nghệ Sau Thu Hoạch, 45 Đinh Tiên Hồng, Quận Thành Phố Hồ Chí Minh, Thạc Sĩ Bùi Quốc Anh thầy Nguyễn Ngữ anh chị Phân Viện giúp đỡ tiến hành thí nghiệm  Cơng ty sản xuất chế phẩm hấp phụ Agrolite Mycobind cung cấp cho vật liệu để phục vụ đề tài  Các bạn nhóm Nguyễn Ngọc Diệp hướng dẫn, bạn lớp DH06VT DH07VT chia sẻ kinh nghiệm, tài liệu kham khảo ý kiến đóng góp cho đề tài  Cha mẹ, em trai anh chị em họ người thân ủng hộ động viên tinh thần, đặc biệt khoản thời gian nằm viện dị ứng với độc tố nấm mốc  Trong q trình thực tập làm khóa luận khơng tránh khỏi thiếu sót, chúng tơi xin chân thành đón nhận ý kiến đóng góp quý báu thầy cô Phân Viện Tp HCM, tháng năm 2011 Trần Thị Ngọc Quyên ii TÓM TẮT Đề tài “Khảo sát khả ngăn ngừa hấp phụ độc tố nấm mốc Aflatoxin chất hấp phụ Agrolite Mycobind bảo quản bắp” tiến hành Phòng thí nghiệm Hóa sinh – Phân Viện Cơ Điện Nơng Nghiệp Công Nghệ Sau Thu Hoạch, 45 – Đinh Tiên Hồng, Quận 1, Thành Phố Hồ Chí Minh Thời gian tiến hành từ tháng 3/2011 đến tháng 7/2011 Đối tượng thí nghiệm bắp trồng Ninh Thuận Chất có khả hấp phụ độc tố chế phẩm Agrolite Mycobind công ty Unimex Engineering Ltd A/S, Đan Mạch Đề tài gồm hai thí nghiệm sau: 1) Thí nghiệm 1: khảo sát khả ngăn ngừa độc tố cách trộn chất hấp phụ Agrolite Mycobind nồng độ 0.5% 1% 2) Thí nghiệm 2: khảo sát khả hấp phụ độc tố aflatoxin chế phẩm Agrolite Mycobind cách trộn chất hấp phụ vào bắp lên mốc sinh độc tố Kiểm tra dư lượng độc tố sau ngày Kết nghiên cứu cho thấy: chất hấp phụ độc tố Agrolite Mycobind ngăn ngừa phát sinh độc tố cách hút ẩm nơng sản từ ngăn cản hình thành phát triển nấm mốc Đồng thời hấp phụ độc tố aflatoxin hình thành bắp, mức bị nhiễm ban đầu 48ppb, nồng độ chất hấp phụ sử dụng 1% cho kết âm tính đo lại sau ngày bảo quản iii MỤC LỤC Trang Trang tựa i LỜI CẢM ƠN ii TÓM TẮT iii MỤC LỤC iv DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii DANH SÁCH CÁC HÌNH viii Chương MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3 2.1 Tổng quan Mycotoxin 2.2 Đặc điểm loài nấm mốc sinh AF 2.2.1 Đặc điểm phân loại Aspergillus flavus .4 2.2.2 Đặc điểm hình thái Aspergillus flavus 2.2.3 Đặc điểm sinh thái Aspergillus flavus .5 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến tạo thành AF nấm mốc .5 2.3 Cấu trúc hóa học tính chất lý hóa AF .6 2.4 Bệnh nhiễm độc AF (Aflatoxicosis) 2.5 Tình hình nhiễm AF mức AF tối đa nguyên liệu thực phẩm 2.6 Các biện pháp phòng chống AF nơng sản 10 2.6.1 Ngăn ngừa xâm nhập phát triển nấm mốc nông sản 10 2.6.2 Loại bỏ giảm thiểu AF nông sản bị nhiễm độc tố 11 2.6.2.1 Phương pháp vật lý 11 2.6.2.2 Phương pháp hóa học .13 iv 2.6.2.3 Phương pháp sinh vật học 14 2.7 Các phương pháp phát đo lường AF 14 2.7.1 Phương pháp sinh vật học 14 2.7.2 Phương pháp hóa học .14 2.7.3 Phương pháp miễn dịch học 15 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 Vật liệu .16 3.2 Phương pháp nghiên cứu 16 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát khả ngăn ngừa độc tố aflatoxin Agrolite Mycobind 16 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát khả hấp phụ độc tố aflatoxin Agrolite Mycobind 18 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 4.1 Thí nghiệm 1: Khả ngăn ngừa độc tố aflatoxin chất hấp phụ Agrolite Mycobind 19 4.2 Thí nghiệm 2: Khả hấp phụ độc tố aflatoxin chất hấp phụ Agrolite Mycobind 21 4.3 Các mặt hạn chế chất hấp phụ Agrolite Mycobind thí nghiệm .21 4.4 Những hạn chế đề tài 22 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .24 5.1 Kết luận 24 5.2 Đề nghị .24 TÀI LIỆU THAM KHẢO 25 PHỤ LỤC .27 v DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT FAO: Food and Agriculture Organization - Tổ Chức Nông Lương Thế Giới IARC: International Agency for research on cancer - Cơ quan quốc tế nghiên cứu ung thư A flavus: Aspergillus flavus HPLC: High Pressure Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng cao áp TLC: Thin Layer Chromatography - Sắc ký lớp mỏng ELISA: Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay - Phản ứng ELISA AF: Aflatoxin AFB : Aflatoxin B AFB : Aflatoxin B AFG : Aflatoxin G AFG : Aflatoxin G Ppb: Part per billion- phần tỷ (µg/kg) Bao PP: Bao poly-propylene Cơng ty TNHH: Cơng ty Trách Nhiệm Hữu Hạn TP HCM: Thành Phố Hồ Chí Minh vi DANH SÁCH CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Tóm tắt lịch sử phát độc tố nấm mốc (FAO, 1990) Bảng 2.2: Tương quan lượng AFB1 ăn vào tỷ lệ ung thư gan số vùng…9 Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm Việt Nam 10 Bảng 3.1: Bố trí thí nghiệm kiểm tra độ ẩm theo thời gian………………………… 17 Bảng 4.1: Độ ẩm mẫu bắp bảo quản theo thời gian 19 Bảng 4.2: Dư lượng AF sau bảo quản mẫu bắp bị nhiễm mốc Agrolite Mycobind .21 vii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Hình dạng cấu tạo Aspergillus flavus .4 Hình 2.2: Cơng thức cấu tạo loại aflatoxin (B , B , G G ) Hình 2.3: Đường lây nhiễm độc tố gây bệnh độc tố nấm nguyên phát thứ phát Hình 4.1: Đồ thị độ ẩm mẫu bắp bảo quản theo thời gian 21 viii Chương MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Dân số giới ngày tăng, nhu cầu mua bán dự trữ thức ăn với lượng lớn điều kiện nóng ẩm tạo điều kiện cho nấm mốc phát triển Khi nấm mốc phát triển chúng sinh độc tố ảnh hưởng đến sức khỏe người vật ni, gây ngộ độc cấp tính, mãn tính hay ung thư Việt Nam có khí hậu nóng ẩm điều kiện thuận lợi cho loại nấm mốc phát triển sinh độc tố khó tránh khỏi tình trạng nơng sản bị nhiễm độc tố Theo thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam năm 2005, 51.8% tổng số vụ ngộ độc có nguyên nhân từ vi sinh vật 25.5% thực phẩm có độc tố Năm 1960, hàng trăm ngàn gà tây Anh bị chết nhiễm độc tố Aflatoxin (AF) Sau người ta phát AF nhiều loại nơng sản Theo FAO (1995) (trích dẫn Lê Anh Phụng, 2002), có 70 quốc gia có qui định mức tối đa chấp nhận AF lương thực thực phẩm Nếu nguyên liệu thực phẩm chứa độc tố cao mức tối đa cho phép không sử dụng, gây tổn thất lớn mặt kinh tế Yêu cầu đặt để bảo quản lương thực thực phẩm, đặc biệt nơng sản khỏi nấm mốc, đồng thời có biện pháp xử lí nơng sản bị nhiễm độc tố nấm Từ trước đến nay, có nhiều biện pháp vật lý (dùng nhiệt, chiếu xạ,…), biện pháp hóa học (trích ly dung mơi, dùng ammonia,…) hay biện pháp vi sinh vật nghiên cứu ứng dụng Trong phương pháp dùng ammonia triển khai qui mô công nghiệp Đề tài thực nhằm mục đích tìm biện pháp mới, rẻ tiền dễ sử dụng để giảm thiểu tác hại mà aflatoxin gây cho người, gián tiếp qua nông sản Đề tài thử nghiệm khả ngăn ngừa hấp phụ độc tố aflatoxin chế phẩm Agrolite Mycobind bắp điều kiện khí hậu độ ẩm miền Nam Việt Nam (Thành Phố Hồ Chí Minh) Bảng 4.2: Dư lượng AF sau bảo quản mẫu bắp bị nhiễm mốc Agrolite Mycobind Phương pháp đo Nồng độ AF ban đầu Dư lượng AF sau ngày bảo quản AM HPLC 48ppb Không phát ELISA 48ppb Không phát AM: Agrolite Mycobind LOD HPLC 0.5 ppb LOD ELISA ppb Theo bảng 4.2 thì: - Với mẫu bắp làm giàu aflatoxin 48 ppb ban đầu đem bảo quản với Agrolite Mycobind 1% cho kết chất hấp phụ hoàn toàn aflatoxin sau ngày bảo quản - Mẫu đem phân tích HPLC ELISA cho kết tương tự không phát với ngưỡng phát HPLC 0.5 ppb ELISA ppb 4.3 Các mặt hạn chế chất hấp phụ Agrolite Mycobind thí nghiệm - Sự phân bố không đồng độc tố nơng sản: gây trở ngại đến liên kết hóa học chất hấp phụ độc tố - Sự bền vững liên kết chất hấp phụ-độc tố: vấn đề liên kết chất hấp phụ độc tố có bền vững điều kiện đặc biệt pH khác đường tiêu hóa hay khơng Vậy điều kiện chất kết dính bị giải phóng khỏi độc tố nghĩa liên kết chất hấp phụ-độc tố bị đứt Tiến sĩ H Clarijs’s nhóm nghiên cứu HAS Hà Lan phát triển mơ hình hệ tiêu hóa để kiểm tra độc tố (trích dẫn Ir Vanderborght Tom, 2009), số yếu tố quan trọng mơ hình là: mơi trường kỵ khí, nhiệt độ (khơng đổi) thể thú, pH thay đổi đường ruột, thời gian thức ăn lưu lại đường tiêu hóa, mật tiết ra, ezyme tiêu hóa… - Chất hấp phụ có tác dụng giới hạn vài độc tố, nói chung độc tố có cực AF - Hiệu thực phòng thí nghiệm khơng giống thú hay người 21 - Vấn đề ô nhiễm môi trường: chất hấp phụ kết dính với độc tố lại hình thức tập trung độc tố ngồi mơi trường, gây nhiễm cho môi trường hay không? Vấn đề chưa quan tâm nghiên cứu Tuy nhiên kết nghiên cứu cho thấy việc sử dụng chất hấp phụ có ưu điểm đáng ý như: - Dễ sử dụng - Giảm độc tố aflatoxin cách rõ rệt - Mang lại hiệu kinh tế, đặc biệt nông sản bắp bị nhiễm lượng độc tố định, sử dụng chất hấp phụ để loại bỏ độc tố 4.4 Những hạn chế đề tài - Đề tài bước khảo sát ban đầu vấn đề sử dụng chất hấp phụ độc tố bảo quản nơng sản Chúng tơi khơng có kinh phí để lặp lại thí nghiệm nghiên cứu sâu hiệu hoạt động chế phẩm Agrolite Mycobind - Vấn đề chất hấp phụ: đề tài không nghiên cứu chế hoạt động chất hấp phụ, chưa quan tâm đến cấu trúc chế phẩm - Kỹ thuật thao tác làm thí nghiệm: • Khả sai số lớn phương pháp lấy mẫu: thí nghiệm 1, mẫu bắp trộn với chấp hấp phụ đem bảo quản, đo độ ẩm lấy lần 10g mẫu vị trí khác bao PP chứa bắp bảo quản, sau trộn lại chia làm lần đo độ ẩm Tuy nhiên, khối lượng mẫu nhỏ (10kg) không đủ đại diện cho đối tượng khảo sát • Phản ứng ELISA: chưa có kinh nghiệm nên thao tác thực ảnh hưởng đến tính xác kết Ví dụ dùng pipette hút cho kháng thể, mẫu hay cộng hợp vào giếng, cần lưu ý không để bọt khí xuất - Vấn đề liên quan đến độc tố: • Ở thí nghiệm 2, đối tượng thí nghiệm bắp lên mốc với mức nhiễm aflatoxin lên đến 48ppb, tuân thủ qui tắc bảo vệ phòng thí nghiệm mặc áo blouse trắng, đeo găng tay trang người trực tiếp tiến hành thí nghiệm bị dị ứng với độc tố Triệu chứng mẫn đỏ khắp người (xem phụ lục hình ảnh dị ứng da), lòng bàn tay bàn chân, sốt cao (390C), nhức đầu tiêu chảy Sự việc giải thích lý sau: bất cẩn thao 22 tác làm lây nhiễm chéo độc tố từ bắp qua dụng cụ thí nghiệm, sách vở, bút… vào da hay xâm nhập vào thể người tiến hành thí nghiệm qua đường hơ hấp Hoặc nhạy cảm với nấm mốc Aspergillus flavus hay độc tố aflatoxin, mức độ nhạy cảm tùy theo địa người (từng cá thể lồi) hay tình trạng sức khỏe (chế độ ăn uống dinh dưỡng), sức đề kháng đặc biệt khoảng thời gian tiếp xúc với độc tố Bác sĩ chuẩn đốn tơi bị dị ứng da nấm mốc cho điều trị với corticoide • Phòng thí nghiệm Phân Viện chưa có phân loại rác độc hại, rác thông thường rác tái chế Điều dễ dẫn đến việc phát sinh côn trùng gây hại, gây nhiễm chéo độc tố 23 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chất hấp phụ Agrolite Mycobind có khả ngăn ngừa hình thành độc tố nấm mốc bắp có khả hấp phụ ẩm, làm giảm độ ẩm thực liệu, từ hạn chế phát triển nấm mốc Chất hấp phụ Agrolite Mycobind có khả hấp phụ độc tố aflatoxin bắp, với mức nhiễm AF ban đầu 48 ppb, sau trộn với chất hấp phụ để ngày kết đo dư lượng độc tố lại khơng phát 5.2 Đề nghị - Liều khuyến cáo nhà sản xuất 10-15kg chất hấp phụ/tấn hay 1-1.5% Theo kết từ thí nghiệm nồng độ 10kg chất hấp phụ/tấn cho kết - Vấn đề liên quan đến chất hấp phụ: nên có nghiên cứu sâu chế hoạt động chất hấp phụ, đặc biệt nghiên cứu in vivo hay mơ hình mơ theo hệ tiêu hóa tiến sĩ H Clarijs’s nhóm HAS - Vấn đề liên quan đến độc tố: cẩn thận đối tượng thí nghiệm có chứa độc tố aflatoxin độc tố nói chung Những dụng cụ dùng phải rửa lại methanol dùng biện pháp khử trùng khác Những qui định chưa đủ để bảo vệ người tiến hành thí nghiệm chúng tơi chưa thật nghiêm túc tn thủ Cần có qui định nghiêm ngặt phải đảm bảo việc tuân thủ theo qui định đặt 24 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Xuân Đồng Nguyễn Huy Văn, 2000 Vi nấm dùng công nghệ sinh học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội Bộ Y Tế, 1992 Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm (Mycotoxin), Một số tiêu chuẩn tạm thời vệ sinh, ban hành kèm theo QĐ số 505 BYT/QĐ ngày 13/4/1992 Bộ Y Tế, trang 18 Dương Thanh Liêm, 1998 Mycotoxin ngộ độc thực phẩm mycotoxin, Bài giảng môn dinh dưỡng, Khoa Chăn Nuôi-Thú Y, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Dương Thanh Liêm, 1998 Tình hình nhiễm độc tố Mycotoxin - Qui định mức nhiễm cho phép – Chiến lược phòng ngừa Mycotoxin, Bài giảng môn dinh dưỡng , Khoa Chăn Ni-Thú Y, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Dương Thanh Liêm, 2001 Độc chất học, Trường Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Ivan Kennedy Giới thiệu phương pháp ELISA phát dư lượng thuốc trừ sâu, Đại Học Sydney, Úc Phân tích nhanh dư lượng thuốc trừ sâu độc tố nấm mốc, Hà Nội 22-23/04/2004 Lê Anh Phụng, 1996 Ảnh hưởng số biện pháp làm giảm độc tính aflatoxin bánh dầu phộng ni dưỡng gia cầm Luận án thạc sĩ, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Lê Anh Phụng, 2002 Ảnh hưởng số chất có khả hấp phụ độc tố Aflatoxin phần nuôi dưỡng vịt siêu thịt Luận án tiến sĩ nông nghiệp, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG ANH Bailey, R.H., L.F Kubena, R.B Harvey, S.A Buckley, and G.E Rottinghous 1998 Efficacy of various inorganic sorbents to reduce the toxicity of aflatoxin and T-2 toxin in broiler chickens Poult Sci 77:1623-1630 10 FAO (1990) Manuals of food quanlity control 10 Training in mycotoxin analysis, Rome 11 Galvano, F., Piva, A Ritieni, and G Galvano 2001 Dietary strategies to counteract the effects of mycotoxins: A review J Food Prot 64:120-131 12 Ir Vanderborght Tom 2009 Mycotoxins2009 Where next with mycotoxin control?, Bangkok, Thailand, 10 March, 2009 Pp 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO TRÊN INTERNET Wikipedia, Độc tố aflatoxin, ngày 16 tháng năm 2011 26 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp phá hủy độc tố aflatoxin NH , nhiệt độ thấp - Theo quy trình Trần Văn An (1994) khô dầu phộng Khô dầu phộng đem nghiền thành bột mịn đường kính d < 1mm, gia ẩm lên 15%, dùng máy khuấy trộn phun xịt trộn tay để tránh bị vón cục Cho vào bao PE (loại 25 – 30 lít), bên ngồi có bao sợi nhựa Bơm NH từ đáy vào bao, buộc miệng bao thật kỹ để tránh bị thất thoát NH nhồi bao cho NH bị hút hết vào khối khô dầu phộng Lập lại lần, thời gian cho tác động 21 ngày nhiệt độ phòng Sau đó, trải khối khơ dầu phộng chỗ thoáng ngày đêm Phơi nắng cho thật khơ - Vào mùa mưa sấy nhiệt độ 800C hay 400C 16 giờ, khô dầu phộng phải nghiền nát cho mịn bảo quản bao nhựa kín chống ẩm - Công nhân thực phải đeo mặt nạ phòng độc Khơ dầu sau xử lý có hàm lượng aflatoxin lại 100 ppb 27 Phụ lục 2: Phương pháp phân tích aflatoxin B sắc ký lỏng cao áp HPLC Dựa tương tác khác chất khác pha động pha - tĩnh theo thời gian lưu khác cột sắc ký Trong đó, pha động chuyển động dung môi gồm hỗn hợp acetonitril: methanol: nước (15+15+70), pha tĩnh chất nhồi cột sắc khí - Cần xây dựng đường chuẩn nồng độ aflatoxin riêng biệt trước đo lường mẫu afltoxin phát đầu dò huỳnh quang Phương trình đường chuẩn dựa diện tích sắc ký đồ nồng độ AFB tương ứng, ta tính phương trình tuyến tính có dạng y= a + bx, với x nồng độ aflatoxin (ppb), y diện tích peak sắc ký đồ - Phương pháp đòi hỏi mẫu phải làm sạch, tốt làm cột sắc ký lực miễn dịch đặc hiệu có độ nhạy cao Phương pháp sắc ký lỏng cao áp đòi hỏi chi phí cao, máy móc đắt tiền, người thực phải có trình độ phân tích tốt nên phòng thí nghiệm lớn thực hiên - Đo dư lượng độc tố nấm mốc thí nghiệm hấp phụ aflatoxin HPLC tiến hành công ty Giám Định Khử Trùng FCC, 45 Đinh Tiên Hoàng, Phường Bến Nghé, Quận 1, Thành Phố Hồ Chí Minh 28 Phụ lục 3: Quy trình phân tích Aflatoxin B phương pháp ELISA (Quy trình kỹ thuật ELISA thực hướng dẫn Phân Viện Sau Thu Hoạch TP.HCM theo tài liệu Ivan Kennedy, Đại Học Sydney) 1.Dụng cụ - Cân: để cân mẫu - Máy đọc ELISA - Pipette kênh: 50- 200 µl - Máy lắc dùng cho phân đoạn chiết mẫu - Máy xay dùng để xay mẫu - Dụng cụ thủy tinh: bình Erlen, ống nghiệm, ống đong, phễu lọc, cốc thủy tinh - Bình tia nhựa để rửa mẫu Chuẩn bị thuốc thử Pha dịch rửa: pha loãng Tween 20 nước cất để đạt nồng độ 0.05% Chuẩn bị mẫu Một kết xác bảo đảm việc lấy mẫu tiến hành để có mẫu đại diện - Mẫu đem xay nhỏ trộn đều, lấy 5g mẫu + 25 ml methanol 75% cho vào bình Erlen lắc 30 phút - Để lắng vòng 10-15 phút - Lọc qua giấy lọc lấy khoảng 10ml dịch lọc đem phân tích - Pha lỗng mẫu lần Phân tích - Đưa tồn thuốc thử nhiệt độ phòng - Cho 50µl methanol 25% vào giếng đối chứng âm, 50µl aflatoxin B1 chuẩn vào giếng đối chứng dương Tương tự cho 50µl dịch chiết pha lỗng vào giếng mẫu (tối thiểu loại lặp lại giếng) - Để yên 5-6 phút - Dùng pipette nhiều kênh cho nhanh 50µl cộng hợp enzyme (đã pha sẵn) vào tất giếng - Để yên 10 phút - Sau thời gian ủ, đổ mạnh hỗn hợp khỏi giếng vào chậu đựng nước javen 29 5% đập lên khăn giấy, sau rửa lần dung dịch rửa Cách rửa sau: dùng bình tia đổ đầy dung dịch rửa vào giếng, để khoảng giây, vấy mạnh để đổ toàn dịch rửa ra, lặp lại lần Rửa lại nước cất lần cho hết bọt Đập lên khăn giấy nhiều lần cho thật nước - Trong vòng 15 phút trước sử dụng pha hỗn hợp chất sau: trộn chất A chất B theo tỉ lệ 0.5ml chất A/ 15ml chất B Cho 100µl hỗn hợp tất giếng Màu xanh từ từ xuất giếng - Sau khoảng 10-15 phút cho 50µl dịch hãm vào tất giếng, đọc bước sóng 450nm bước sóng kép 450/630nm máy đọc ELISA Diễn giải kết Màu đậm = aflatoxin B1 Màu nhạt = nhiều aflatoxin B1 30 Phụ lục 4: Bảng số liệu đo độ ẩm bắp bảo quản theo thời gian Điều kiện bảo quản Độ ẩm ban đầu Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 10 12 14 16 28.3 27.2 27 26 25.6 25.9 25.4 22.9 21 28.6 27.9 28 26 25.7 25.9 24.3 23.6 22 28.6 27.1 27 26 26.1 25.9 24.7 23.7 21 28.85 27.9 27 26 24.8 25.1 22 21 20 28.6 26.5 25 26 23.9 23.9 23.9 20.9 20 28.1 26.9 26 24 26 23.9 22 20.8 20 28.4 26.7 26 23 23.9 22.5 22 21.1 21 28.6 26.3 27 24 24.2 23 21.1 20.9 21 28.5 27.4 26 24 22.7 22.9 22 21 20 20 19.5 19.6 19 18.8 18.2 17.9 17.4 17.6 19.8 19.7 19.2 18.8 18.5 18.5 18.3 17.6 17.8 20.8 20.2 19.7 19.8 18.2 18.5 17.5 17.5 17.1 20.3 19.2 19 19 17.8 17.5 17.4 16.8 17 20.4 18.7 19 19 17.9 17.9 17.9 16.3 16 19.9 19.1 19 19 CHP AM: Chất hấp phụ Agrolite Mycobind 17.7 18.3 17.2 17 18 10 kg bắp tươi (đối chứng) 10kg bắp tươi + 50 g CHP AM 10 kg bắp tươi + 100 g CHP AM 10 kg bắp độ ẩm 20% + 50 g CHP AM 10 kg bắp độ ẩm 20% + 100 g CHP AM 31 Phụ lục 5: Xử lý thống kê cho thí nghiệm theo kiểu khối yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên Two-way Analysis of Variance Analysis of Variance for am Source DF SS MS F P khoi 154.299 19.287 19.49 0.000 mau 423.599 105.900 107.02 0.000 Error 32 31.665 0.990 Total 44 609.563 One-way Analysis of Variance Analysis of Variance for am@ Source DF SS MS F P mau@ 423.60 105.90 22.78 0.000 Error 40 185.96 4.65 Total 44 609.56 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev 25.611 2.186 24.289 2.919 23.878 2.772 18.722 1.000 18.178 1.124 -+ -+ -+ -+( -* ) ( * ) ( * -) ( -* ) ( * -) -+ -+ -+ -+- Pooled StDev = 2.156 18.0 32 21.0 24.0 27.0 PHỤ LỤC HÌNH ẢNH Hình 1: Chất hấp phụ độc tố Agrolite Mycobind Hình 2: Mẫu bắp đối chứng Hình 3: Mẫu bắp tươi bảo quản với 0.5% Agrolite Mycobind 33 Hình 4: Mẫu bắp độ ẩm 20%, 1% chất hấp phụ Hình 5: Mẫu bắp cho lên mốc tháng 34 Hình 6: Dị ứng với Aspergillus flavus gây mẫn đỏ vùng lưng Hình 7: Dị ứng với Aspergillus flavus gây mẫn đỏ vùng cổ 35 ...KHẢO SÁT KHẢ NĂNG NGĂN NGỪA VÀ HẤP PHỤ ĐỘC TỐ NẤM MỐC AFLATOXIN CỦA CHẤT HẤP PHỤ AGROLITE MYCOBIND TRONG BẢO QUẢN BẮP Tác giả Trần Thị Ngọc Quyên Khóa luận... độc tố cách trộn chất hấp phụ Agrolite Mycobind nồng độ 0.5% 1% 2) Thí nghiệm 2: khảo sát khả hấp phụ độc tố aflatoxin chế phẩm Agrolite Mycobind cách trộn chất hấp phụ vào bắp lên mốc sinh độc. .. sát khả ngăn ngừa độc tố aflatoxin chế phẩm Agrolite Mycobind thông qua việc khảo sát khả hút ẩm chế phẩm 2) Khảo sát khả hấp phụ độc tố nấm mốc aflatoxin hàm lượng Aflatoxin ban đầu làm giàu bắp