Nghiên cứu tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (spongia sp ) theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG KHOA COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM TRAÀN CAO PHÖÔNG VUÕ NGHIÊN CỨU TÁCH PHÂN ĐOẠN PROTEIN CÓ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA TỪ DỊCH CHIẾT HẢI MIÊN (SPONGIA SP.) THEO PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA BẰNG AMMONIUM SULFATE ÑOÀ AÙN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC Chuyeân ngaønh: Cheá bieán thuûy saûn NHA TRANG – 2015 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC NHA TRANG KHOA COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM TRAÀN CAO PHÖÔNG VUÕ NGHIEÂN CÖÙU QUAÙ TRÌNH CHIEÁT VAØ KHAÛO SAÙT HOAÏT TÍNH CHOÁNG OXY HOÙA CUÛA DÒCH CHIEÁT TÖØ CAÂY SAÛ CHANH (CYMBOPOGON CITRATUS STAPF) ÑOÀ AÙN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC Chuyeân ngaønh: Cheá bieán thuûy saûn Giaùo vieân höôùng daãn: TS. HUYØNH NGUYEÃN DUY BAÛO NHA TRANG – 2015 i Lời cảm ơn Để hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này ngoài nỗ lực không ngừng của bản thân em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ phía gia đình, thầy cô, bạn bè. Trước hết em xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm khoa Công Nghệ thực Phẩm, Phòng Đào tạo niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin được giành cho Thầy Huỳnh Nguyễn Duy Bảo đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn Thầy Vũ Ngọc Bội - Chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Chế biến thủy sản, Ban giám đốc và các anh chị quản lí phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, phòng thí nghiệm Công nghệ Chế biến thuộc Trung tâm thí nghiệm thực hành trường Đại học Nha Trang và các anh chị học viên cao học đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Nha Trang, ngày 28/06/2015 Sinh viên thực hiện Trần Cao Phương Vũ ii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn .................................................................................................................. i MỤC LỤC.................................................................................................................. ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH...........................................................................................v DANH MỤC CÁC BẢNG....................................................................................... vii Lời mở đầu ..................................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................3 1.1. Giới thiệu về hải miên..................................................................................3 1.1.1. Đặc điểm sinh học và tập tính sống của hải miên.............................3 1.1.2. Phân loại, môi trường sống ...............................................................9 1.1.3. Cấu tạo cơ thể..................................................................................11 1.1.4. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxy hóa có trong hải miên.........................................................................................................................15 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về hải miên trên thế giới và Việt Nam.........17 1.2. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và khả năng chống oxy hóa của protein21 1.2.1. Quá trình oxy hóa............................................................................21 1.2.1.1.Gốc tự do...............................................................................................21 1.2.1.2. Nguồn gốc hình thành các gốc tự do .......................................22 1.2.2. Chất chống oxy hóa.........................................................................22 1.2.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa .................................................22 1.2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa .............................................................22 1.2.3. Khả năng chống oxy hóa của protein..............................................23 1.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa và phân đoạn protein ....25 1.3.1. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa............................25 1.3.2. Các phương pháp tinh sạch protein.................................................27 1.3.2.1. Phương pháp kết tủa protein bằng muối..................................27 1.3.2.2. Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ ..............29 iii 1.3.2.3. Phương pháp kết tủa protein ở điểm đẳng điện.......................29 1.3.2.4. Phương pháp kết tủa protein bằng các non–ionic polymer .....29 1.3.2.5. Phương pháp kết tủa protein bằng ion kim loại ......................30 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................31 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất .......................................................................31 2.1.1. Nguyên liệu .....................................................................................31 2.1.2. Hóa chất ..........................................................................................31 2.2. Phương pháp nghiên cứu............................................................................31 2.2.1. Bố trí thí nghiệm .............................................................................31 2.2.1.1 Quy trình tách chiết phân đoạn protein lần 1 dịch chiết từ hải miên.33 2.2.1.2. Quy trình tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1........35 2.2.1.3. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn protein...............36 2.2.2. Các phương pháp phân tích.............................................................39 2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH..........39 2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lượng khử .........................39 2.2.2.3. Phương pháp Lowry ................................................................40 2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm..................................40 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...........................41 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn lần 1 từ dịch chiết hải miên...................................41 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn lần 2 từ dịch chiết hải miên...................................46 3.3. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế đến hoạt tính sinh học của các phân đoạn protein từ dịch chiết hải miên...................................................................55 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................59 1. Kết luận .........................................................................................................59 2. Kiến nghị. ......................................................................................................59 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................60 PHỤ LỤC..................................................................................................................62 iv DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine. AS: Ammonium sulfate. AA: Ammonium acetate. UV – Vis (Ultraviolet – Visite): Tử ngoại – khả kiến. v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hải miên ......................................................................................................3 Hình 1.2. Hải miên nước ngọt Spongilla lacustris ......................................................4 Hình 1.3. Loại tế bào chính của Porifera [13]...........................................................11 Hình 1.4. Giải phẩu cấu tạo cơ thể hải miên .............................................................14 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Purpurone ...............................................................19 Hình 1.6. Các dẫn xuất của Subergorgic axit............................................................19 Hình 1.7. Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối. .............................28 Hình 2.1. Loài hải miên Spongia sp. lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc ......................31 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát..............................................................32 Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên ......33 Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1. ............35 Hình 2.5. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn. ............................................38 Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn lần 1 từ nồng độ AS bão hòa 20% đến 80% và dịch chiết hải miên thô ban đầu. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ................................................................................41 Hình 3.2. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn protein dịch chiết hải miên lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................43 Hình 3.3. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). .........................................................................44 Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa protein và khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein từ phân đoạn lần 1. .........................................................45 Hình 3.5. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa tổng năng lực khử của các phân đoạn lần 1 với protein có trong các phân đoạn đó. ............................................................46 vi Hình 3.6. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn protein lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..............................48 Hình 3.7. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05)..........................50 Hình 3.8. Đồ thị so sánh khả hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn tốt nhất trong phân đoạn lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). .....51 Hình 3.9. Hàm lượng protein trong phân đoạn protein lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ................................................................................53 Hình 3.10.Đồ thị thể hiện mối tương quan giữ khả năng khử gốc tụ do DPPH với hàm lượng protein ................................................................................54 Hình 3.11. Đồ thị thể hiên mối tương quan giữa protein và tổng năng lực khử của các phân đoạn protein lần 2.......................................................................................54 Hình 3.12. Đồ thị tổng năng lực khử của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ............................................................55 Hình 3.13. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ..............................................56 Hình 3.14. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). ...............................................57 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. So sánh giữa các lớp hải miên. .................................................................10 Bảng 1.2. Sự khác nhau giữa các lớp hải miên sống trong các phạm vi khác nhau của môi trường sống .........................................................................................11 Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hòa ở 40C và 100C.........................................................34 1 Lời mở đầu 1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay khi cuộc sống ngày càng phát triển, khi cái ăn cái mặt không còn là vấn đề lớn thì người ta bắt đầu quan tâm hơn tới sức khỏe của mình, họ luôn đòi hỏi những sản phẩm có chất lượng ngày càng tốt hơn, chính điều này cùng với sự phát triển của các thiết bị khoa học hiên đại đã thúc đẩy các nhà khoa học trên thế giới không ngừng tìm tòi, nguyên cứu, để tìm ra các chất mới từ các loài sinh vật mới có các tác dụng đặt biệt có khả năng phòng ngừa, đều trị và nâng cao sức khỏe cho con người. Đến nay, con người đã nhận biết và gọi tên được hơn 1.400.000 loài sinh vật trên thế giới. Nhưng trong những khu rừng nhiệt đới hay trong lòng đại dương bao la vẫn còn nhiều loài sinh vật mà con người chưa từng biết về chúng. Theo ước tính của các nhà khoa học, trên trái đất có khoảng 10 triệu loài sinh vật. Cũng có con số thống kê lên đến 30.000.000 loài. Từ đó có thể thấy rằng, hiểu biết của loài người chúng ta về thế giới sinh vật phong phú này còn rất khiêm tốn. Việt Nam với diện tích đất liền hơn 330 ngàn km2 và diện tích phần nước gấp hơn 4 lần diện tích đất liền bao gồm các sông, hồ, biển và đại dương cùng với việc là quốc gia nằm ở vùng nhiệt đới nên có nhiều điều kiện cho các sinh vật phát triển và tạo ra sự phong phú của nhiều loài động thực vật và nhiều hệ sinh thái khác nhau, đặc biệt là các sinh vật biển, có nhiều loài sinh vật có giá trị cao mang lại nhiều lợi ích về khoa học, y tế, kinh tế chưa được quan tâm nguyên cứu vì vậy vấn đề cấp thiết đặc ra là phải phát huy được những giá trị mà sinh vật đó mang lại bằng những phương pháp nguyên cứu đúng đắng, thích hợp, có hệ thống. Hải miên là một động vật biển còn rất xa lạ với người Việt Nam, với số lượng nhiều, đa dạng về chủng loài. Ở Việt Nam có rất nhiều điều kiện thuận lợi cho các loài hải miên cùng với các động vật ký sinh sinh sống và phát triển. Tuy nhiên các nghiên cứu về hoạt chất sinh học từ hải miên vẫn còn khá mới mẻ, những nghiên cứu, đánh giá cũng như ứng dụng các hoạt tính sinh học của hải miên ở Việt Nam vẫn còn rất khiêm tốt, chưa khai thác được nguồn tài nguyên biển vô cùng quý 2 giá này, mặt dù giá trị mà nó mang lại là rất lớn, đặc biệt là giá trị vệ mặt y tế, dược phẩm. Vì vậy em xin chọn đề tài "Nghiên cứu tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate" từ đó làm cơ sở cho các nguyên cứu tách chiết, tinh chế các chất chống oxy hóa từ Hải Miên sau này. 2. Mục tiêu của đề tài Tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) theo phương pháp kết tủa bằng ammonium sulfate (AS). 3. Ý nghĩa thực tiễn và ý nghĩa khoa học của đề tài. - Ý nghĩa khoa học: Lần đầu tiên nghiên cứu một cách có hệ thống từ việc tìm chọn các thông số cho việc kết tủa phân đoạn protein có hoạt tính sinh học từ hải miên, vì vậy là nguồn bổ sung các tư liệu có tính khoa học về các protein có hoạt tính sinh, hóa của hải miên. Các kết quả thu được của đề tài sẽ bổ sung hữu ích nguồn tài liệu phong phú cho các nhà nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học từ hải miên nói riêng và các loài động vật khác nói chung, đồng thời khuyến khích các công trình nguyên cứu, tìm tòi các loại sinh vật chưa được biết đến dưới đại dương nhằm bổ sung 1 lượng kiến thức khoa học lớn cho nhân loại và nâng cao được giá trị của các loài sinh vật đó, cũng như lợi ích mà đại dương đem lại cho chúng ta. - Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở cho các nhà thực nghiệm thử nghiệm sử dụng các chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ hải miên trong y, dược học và đời sống con người, góp phần nâng cao giá trị sử dụng của hải miên. Thành công của đề tài mở ra một hướng mới trong việc sản xuất các loại sản phẩm chức năng và các loại thuốc dùng trong y học nhằm nâng cao sức khỏe con người, thúc đẩy nền kinh tế nước nhà. 4. Nội dung. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn protein kết tủa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp.) bằng ammonium sulfate có nồng độ khác nhau. - Thử nghiệm tinh chế protein từ các phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa cao. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về hải miên `Hình 1.1. Hải miên Hải miên là loài động vật không xương sống có cấu tạo rất đơn giản sống vĩnh viễn gắn liền với một vị trí trong nước. Có từ 5.000 đến 10.000 loài đã được biết. Hầu hết hải miên sống ở nước mặn, chỉ có khoảng 150 loài sống ở nước ngọt. Hải miên là một sinh vật cổ đại đã sống trong các vùng biển trên thế giới hơn 600 triệu năm. Cơ thể của động vật hoang dã này có hàng ngàn lỗ nhỏ để cho nước chảy qua liên tục và nhờ đó nó được nuôi dưỡng và lấy oxytừ dòng nước chảy qua cơ thể chính vì thế hải miên còn được gọi là động vật thân lỗ. 1.1.1. Đặc điểm sinh học và tập tính sống của hải miên - Đặc điểm sinh học: Hải miên là động vật đa bào, dị dưỡng, thiếu các vách tế bào và sản xuất các tế bào tinh trùng. Không giống như các loài động vật khác, chúng thiếu mô và bộ phận cơ thể, và không có đối xứng cơ thể. Các hình dạng cơ thể sẽ thích nghi cho hiệu quả tối đa lượng nước chảy qua khoang trung tâm, nơi đó có các cơ quan thu 4 nhận các chât dinh dưỡng thông qua một lỗ gọi là osculum. Nhiều loài hải miên có bộ xương bên trong và/hoặc có gai của canxi cacbonat hoặc silicon dioxide. Tất hải miên là động vật không xương sống. Có một số sống ở nước ngọt, nhưng đại đa số sống ở biển có nhiều loài khác nhau, từ các khu thủy triều đến độ sâu vượt quá 8.800 m. Có khoảng 5.000 - 10.000 loài hải miên đã được biết đến, chúng ăn vi khuẩn và thức ăn khác trong nước. Một vài loài hải miên sống trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng đã trở thành động vật ăn thịt mà chủ yếu là ăn các động vật nhỏ, động vật giáp xác [4]. Cơ thể hải miên có hai lớp bên ngoài ngăn cách bởi một lớp gel (không có tế bào) gọi là mesohyl (còn gọi là mesenchyme). Trong lớp gel hoặc là spicules (kim hỗ trợ tạo từ canxi cacbonat) hoặc sợi spongin (một loại xương linh hoạt có cấu tạo từ protein). Hải miên không có mô tạng, các loại hải miên khác nhau tạo thành hình dạng khác nhau, bao gồm cả ống, quạt, ly, nón, đụn, thùng và lớp vỏ có kích thước từ vài mm cho tới 2 mét. Giống như các động vật ngành Thích ty bào như sứa và sứa phiến lược và không giống như tất cả các động vật đa bào khác đã biết, cơ quan hải miên bao gồm một phi sinh khối thạch giống như kẹp giữa hai lớp chính của các tế bào. - Sinh sản: + Sinh sản vô tính: Hình 1.2. Hải miên nước ngọt Spongilla lacustris 5 Hải miên có ba phương pháp sinh sản vô tính: phân mảnh; nảy chồi; và bằng cách sản xuất gemmules. Những mảnh vỡ của hải miên có thể được tách ra bởi các dòng chảy hoặc sóng. Chúng sử dụng các tính di động của pinacocytes, choanocytes và tái định hình của mesohyl lại gắn mình vào một bề mặt phù hợp và sau đó xây dựng lại bản thân như hải miên nhỏ nhưng diễn ra theo một quá trình trong một vài ngày. Một mảnh hải miên chỉ có thể tái sinh nếu nó chứa cả collencytes để sản xuất mesohyl và archeocytes để sản xuất tất cả các loại tế bào khác [18]. Một số rất ít loài sinh sản bằng cách nảy chồi [9]. Gemmules là "kén sống còn" mà một vài loài hải miên và nhiều loài hải miên nước ngọt sản xuất hàng ngàn khi chết và một số trong đó, chủ yếu là các loài hải miên nước ngọt, thường xuyên sản xuất vào mùa thu. Spongocytes làm gemmules bằng cách gói vỏ spongin, thường được gia cố bằng gai, cụm vòng của archeocytes có đầy đủ các chất dinh dưỡng [9]. Gemmules nước ngọt cũng có thể bao gồm phytosynthesizing vật cộng sinh [18]. Các gemmules sau đó trở thành không hoạt động, và trong trạng thái này có thể tồn tại ở các điều kiện lạnh, khô, thiếu oxyvà các biến thể cực đoan ở độ mặn [9]. Gemmules thường không hồi sinh cho đến khi nhiệt độ giảm xuống, giữ lạnh cho một vài tháng và sau đó đạt đến một mức bình thường [10]. Khi một hạt nảy gemmule, các archeocytes quanh bên ngoài của cụm biến thành pinacocytes, các cụm tế bào từ từ nổi lên và hầu hết các archeocytes còn lại biến thành các loại tế bào khác cần thiết để làm cho một miếng hải miên hoạt động. Gemmules từ cùng một loài nhưng các cá nhân khác nhau có thể tham gia lực lượng để tạo thành một miếng hải miên [9]. + Sinh sản hữu tính: Hầu hết hải miên là loài lưỡng tính (có chức năng như cả hai giới cùng một lúc), mặc dù hải miên không có tuyến sinh dục (cơ quan sinh sản). Tinh trùng được sản xuất bởi choanocytes hoặc toàn bộ buồng choanocyte đó chìm vào mesohyl và tạo thành tinh nang trong khi trứng được hình thành bởi sự biến đổi của archeocytes, hoặc của choanocytes ở một số loài. Mỗi quả trứng thường có được một lòng đỏ bằng cách tiêu thụ các tế bào cung cấp dinh dưỡng. Trong thời gian đẻ trứng, tinh 6 trùng vỡ ra khỏi nang và bị trục xuất qua các osculum. Tinh trùng được dòng nước mang đi, khi gặp các hải miên cùng loài, thay vì bị tiêu hóa, chúng được ameboid hình thức qua mesohyl với trứng. Một vài loài đẻ trứng đã được thụ tinh vào trong nước, nhưng hầu hết giữ lại những quả trứng cho đến khi chúng nở. Có bốn loại ấu trùng, nhưng tất cả là bóng của các tế bào với một lớp bên ngoài của các tế bào có roi hoặc lông mao cho phép ấu trùng di chuyển. Sau khi bơi trong một vài ngày ấu trùng thu thập dữ liệu cho đến khi chúng tìm thấy một nơi thích hợp để sinh sống. Hầu hết các tế bào biến đổi thành archeocytes và sau đó thành các loại phù hợp với vị trí đã chọn sau đó phát triển đầy đủ như một miếng hải miên trưởng thành nhưng với kích thước thu nhỏ [9]. - Phòng thủ: Hầu hết các loài hải hiên sống trong trạn nhiệt đới đã phát triển các phương tiện để tạo ra một loạt các hợp chất hóa học để tự vệ hoặc để ngăn chặn các sinh vật khác phát triển trên cơ thể của mình. Các Nudibranch màu sắc rực rỡ là một ví dụ rõ ràng về một nhóm động vật mà không chỉ sản xuất các hợp chất phòng thủ độc hại mà nó muốn cảnh báo bởi màu sắc rực rỡ. Trong khi nhiều hải miên không phô trương độc tính của nó qua những màu sắc rực rỡ mà nó có thể sản xuất ra một số các hợp chất phức tạp nhất được tìm thấy ở bất cứ đâu trên rạn san hô trên thế giới. Từ nhiều năm nay, khoa học đã thu thập và phân tích một hợp chất trên nhiều miếng hải miên để sử dụng trong các lĩnh vực y tế để chống lại căn bệnh ung thư của con người và cho họ sử dụng như một chất kháng khuẩn. Nhiều người nghĩ rằng trong số các hợp chất này có thể được hải miên sử dụng như một hình thức chiến tranh hóa học (allelopathic) chống đóng cặn hoặc ngăn cản các sinh vật xâm lấn bao gồm các hải miên khác. Hải miên không có hệ thống miễn dịch phức tạp như của hầu hết các loài động vật khác. Tuy nhiên nó từ chối ghép từ các loài khác, nhưng chấp nhận chúng từ các thành viên khác của cùng một loài. Trong một vài loài hải miên, các tế bào màu xám giữ vai trò chủ đạo trong việc từ chối các loài khác. Khi chiếm được, nó sản xuất ra một chất hóa học làm dừng chuyển động của các tế bào khác trong khu vực bị ảnh hưởng, do đó ngăn ngừa sự xâm nhập từ việc sử dụng hệ 7 thống giao thông nội bộ của miếng hải miên. Nếu sự xâm nhập vẫn tồn tại, các tế bào màu xám tập trung trong khu vực và giải phóng độc tố giết chết tất cả các tế bào trong khu vực. Hệ thống "miễn dịch" có thể ở trong trạng thái kích hoạt này cho đến ba tuần [10]. - Tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và bài tiết: Hải miên không có khác biệt về hệ thống tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa và bài tiết thay vào đó hệ thống dòng chảy hỗ trợ tất cả các chức năng này. Nó lọc các hạt thức ăn ra khỏi nước khi cho dòng nước chảy qua. Các hạt lớn hơn 50 micromet không thể vào, Ostia và pinacocytes tiêu thụ chúng bằng các thực bào (engulfing và tiêu hóa nội bộ). Các hạt từ 0,5 micromet đến 50 micromet đang bị mắc kẹt trong Ostia, những hạt này được xử lý bởi pinacocytes hoặc bởi archaeocytes. Vi khuẩn có kích thước hạt, dưới 0,5 micromet, đi qua Ostia và sau đó được giữ lại bởi choanocytes [9], choanocytes giữ lại 80% nguồn cung cấp chất dinh dưỡng của một miếng hải miên [18]. Tại đây các chaeocytes có nhiệm vụ đóng gói, vận chuyển chất dinh dưỡng trong các túi từ tế bào trực tiếp tiêu hóa thức ăn cho những cơ quan khác. Tế bào hải miên hấp thụ oxykhuếch tán từ nước vào tế bào khi nước chảy qua thân, đồng thời carbon dioxide và các sản phẩm chất thải hòa tan khác như amoniac cũng lan tỏa. Archeocytes loại bỏ các hạt có kích thước lớn đang đe dọa sẽ chặn các Ostia, vận chuyển chúng qua mesohyl và thường thải chúng lại vào trong nước, mặc dù một số loài kết hợp chúng vào xương của chúng [9]. Một vài loài sống trong vùng biển nơi các loại thức ăn dạng hạt rất nghèo chỉ có các loại động vật giáp xác và động vật nhỏ khác. Vì vậy, đến nay chỉ có 137 loài đã được phát hiện [4]. Hầu hết thuộc về loài Cladorhizidae, nhưng một vài thành viên của loài Guitarridae và Esperiopsidae cũng là loài ăn thịt [15]. Trong hầu hết các trường hợp ít được biết về cách thức thực sự của hải miên khi bắt mồi, mặc dù một số loài được cho là sử dụng một trong hai cách dính hoặc tạt gai [15][16]. Hầu hết hải miên ăn thịt sống ở vùng nước sâu, lên đến 8840 m [7] và sự phát triển của kỹ thuật thăm dò đại dương sâu dẫn đến việc phát hiện ra nhiều thông tin hơn. Tuy nhiên một trong những loài đã được phát hiện trong một hang động ở độ sâu 17-23 8 m (56-75 ft) ở Địa Trung Hải, thì việc ăn các động vật giáp xác và động vật nhỏ thường xuyên hơn viêc ăn bằng cách lọc. Các loại hải miên ăn thịt động vật giáp xác ,trong các hang đông, bằng cách chụp lấy chúng sau đó quấn lấy và tiêu hóa chúng bằng cách bao bọc chúng trong một vài ngày, và sau đó quay trở lại hình dạng bình thường của nó; không có bằng chứng cho thấy chúng sử dụng nọc độc [18]. Các loài hải miên ăn thịt được biết hầu hết đã hoàn toàn mất hệ thống dòng chảy và choanocytes. Tuy nhiên các chi Chondrocladia sử dụng một hệ thống dòng chảy đã đươc tiến hóa để làm tăng khả năng săn bắt con mồi [15][8]. - Vòng đời: Hải miên trong vùng ôn đới sinh sống trong ít nhất một vài năm, nhưng một số loài sống ở vùng nhiệt đới và cũng có thể ở những đại dương sâu có thể sống 200 năm hoặc hơn. Một số bị vôi hóa demosponges chỉ tăng 0,2 mm (0,0079 in) mỗi năm và nếu tỷ lệ đó là hằng số thì vật mẫu có kích thước 1 m (3.3 ft) phải được khoảng 5.000 năm tuổi. Một số loài hải miên bắt đầu sinh sản hữu tính khi chỉ một vài tuần tuổi, trong khi những loài khác chờ đợi cho đến khi vài năm tuổi [18]. - Kẻ thù: Hải miên có kẻ thù là Sponge ruồi, còn được gọi là spongilla-ruồi (bộ cánh gân , Sisyridae), là loài chuyên săn các loại hải miên nước ngọt. Con cái đẻ trứng của mình trên thảm thực vật nước nhô. Ấu trùng nở và duy chuyển vào nước, sau đó tìm hải miên để ăn. Chúng sử dụng phần miệng thuôn dài của chúng để xuyên qua miếng mải miên và hút chất lỏng bên trong. Ấu trùng của một số loài bám vào bề mặt của miếng hải miên trong khi những loài khác thì nương náu trong hốc trong của miếng hải miên. Các ấu trùng trưởng thành hoàn toàn thoát ra khỏi nước và quay một cái kén, trong đó để thành nhộng [7]. - Phối hợp với các sinh vật khác: Hải miên được ghi nhận của chúng về sự hợp tác với các sinh vật khác trên phạm vi rộng [18]. Việc đóng cặn xốp Lissodendoryx colombiensis là phổ biến nhất trên bề mặt đá, nhưng hải miên đã mở rộng phạm vi của chúng nhờ cỏ biển, bằng cách cho phép cỏ biển được bao quanh hoặc mọc trên người chúng, ngăn chặn sự 9 lấn áp của các loài sao biển bản địa và do đó bảo vệ Lissodendoryx; bù lại hải miên-cỏ biển có được vị trí cao hơn đi từ trầm tích biển tầng [10]. Tôm thuộc chi Synalpheus là loại tôm sống bên trong miến hải miên, mỗi loài tôm sống ở một loài hải miên khác nhau. Cụ thể, synalpheus regalis sử dụng miếng hải miên không chỉ như là một nguồn thức ăn, mà còn là một bảo vệ chống lại các loài tôm và động vật ăn thịt khác [11], số lượng có thể lên tới 16.000 cá nhân sống trong một đơn sponge caretta, ăn thức ăn là các hạt lớn hơn mà chúng thu thập trên các miếng hải miên khi được các miếng hải miên lọc ra [12]. 1.1.2. Phân loại, môi trường sống - Phân loại: Hải miên được phân phối theo truyền thống thành ba lớp: hải miên đá vôi (Calcarea), hải miên thủy tinh (Hexactinellida) và Demosponges (Demospongiae). Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trong nhóm Demospongiae có sự khác biệt về phylogenetically nên người ta chia ra thành Demospongiae và Homoscleromorpha. Gần đây họ đã công nhận Homoscleromorpha là lớp thứ tư của hải miên [18][9]. Hải miên được chia thành các lớp chủ yếu theo các thành phần của xương theo bảng sau: 10 Bảng 1.1. So sánh giữa các lớp hải miên. Loài Loại tế bào Gai Spongin Bộ xương sợi ngoài lớn Hình dáng cơ thể Calcarea Calcite Asconoid, Nhân đơn, Có thể là cá Được làm syconoid, màng đơn nhân hoặc Không bằng calcite leuconoid hoặc bên ngoài khối lượng nếu có. điện từ lớn Hexactinellidas Chủ yếu là Silica syncytia Có thể là cá Không trong tất cả nhân hoặc các loài hợp nhất Không Demospongiae Nhân đơn, màng đơn bên ngoài Silica Ở một số loài. Ở nhiều Xuất xứ của loài aragonit nếu có. Homoscleromorpha Nhân đơn, màng đơn bên ngoài Silica Ở nhiều Không bao loài giờ Leuconoid Leuconoid Sylleibid hoặc leuconoid - Môi trường sinh sống: Hải miên hầu như là có mặt trên toàn thế giới, chúng sống trong một loạt các môi trường sống dưới đại dương, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới [15]. Hầu hết sống trong vùng biển yên tĩnh, bởi vì trầm tích khuấy động bởi sóng hoặc dòng sẽ chặn các lỗ chân lông, làm cho chúng khó khăn trong việc ăn và thở [12]. Phần lớn hải miên thường được tìm thấy trên bề mặt vững chắc như đá, nhưng một số loài có thể gắn vào trầm tích mềm mại bằng phương tiện của một cơ sở gốc như thế nào [14]. Hải miên dồi dào hơn ở vùng biển ôn đới nhưng ít đa dạng hơn so với ở vùng nhiệt đới, có thể vì các sinh vật và con mồi của chúng phong phú ở vùng biển nhiệt 11 đới [15]. Hải miên kính là phổ biến nhất ở vùng biển Bắc cực và trong chiều sâu của vùng biển ôn đới và nhiệt đới, cơ thể rất xốp cho phép họ trích xuất thực phẩm từ các vùng biển nghèo thức ăn mà không cần phải hoạt động nhiều. Demosponges và hải miên đá vôi phong phú và đa dạng ở các vùng nước không phân cực nông hơn [16]. Bảng 1.2. Sự khác nhau giữa các lớp hải miên sống trong các phạm vi khác nhau của môi trường sống Loài Calcarea Loại nước Ở biển Hải miên Ở biển thủy tinh Biển, nước lợ Demospon hoặc nước ges ngọt Độ sâu ít hơn 100 m (330 ft) Sâu Loại bề mặt Cứng Mềm hoặc trầm tích Một Demosponge ăn thịt đã được Bất kỳ tìm thấy tại 8840 m 1.1.3. Cấu tạo cơ thể Mesohyl Pinacocyte Choanocyte Lophocyte Porocyte Tế bào trứng Archeocyte Sclerocyte Spicule Lưu lượng nước Hình 1.3. Loại tế bào chính của Porifera [13] 12 - Loại tế bào: Cơ thể của miếng hải miên là rỗng và được tổ chức hình dạng bằng các mesohyl, một chất giống như thạch được làm chủ yếu bằng collagen và củng cố bởi một mạng lưới dày đặc của sợi cũng được làm bằng collagen. Bề mặt bên trong được phủ bằng choanocytes, các tế bào có hình trụ hoặc hình nón đai xung quanh mỗi một roi là một choanocyte. Các chuyển động sóng của roi lái nước qua cơ thể của miếng hải miên. Tất cả hải miên có Ostia, các kênh vận chuyển hàng đầu với các cơ quan thông qua các mesohyl và trong hầu hết các miếng xốp này được điều khiển bởi ống giống như porocytes hình thành van hút gió closable. Pinacocytes, các tế bào giống như tấm, tạo thành một làn da bên ngoài duy nhất, lớp trên tất cả các bộ phận khác của mesohyl không được bao phủ bởi choanocytes và pinacocytes cũng tiêu hóa các hạt thức ăn quá lớn để nhập Ostia [9][10], trong khi những cơ quan khác có trách nhiệm giữ nó [10]. Mesohyl (mesenchyme) - lớp gelatin giữa các cơ thể bên ngoài của miếng hải miên và các spongocoel (khoang bên trong). Các loại tế bào sống và di chuyển trong mesohyl [9][10]: • Lophocytes là amip tế bào mà di chuyển chậm qua mesohyl và tiết ra các sợi collagen. • Collencytes là một loại tế bào collagen sản xuất. • Rhabdiferous tế bào tiết ra polysaccharides đó cũng là một phần của mesohyl. • Tế bào trứng và tinh trùng là những tế bào sinh sản. • Sclerocytes tiết ra các khoáng gai (gai nhỏ) đã hình thành bộ xương của nhiều hải miên và trong một số loài này cung cấp một số bảo vệ chống lại kẻ thù.. • Thêm vào hoặc thay vì sclerocytes, demosponges có spongocytes tiết ra một dạng collagen polymerizes vào spongin, một loại vật liệu dạng sợi dày cứng mesohyl. • Tế bào cơ (các tế bào cơ bắp) tiến hành các tín hiệu. • "Các tế bào xám" hành động như một hệ thống miễn dịch . 13 Archaeocytes (hoặc amoebocytes ) là totipotent. Các tế bào có giả hành, nằm trong mesohyl, có khả năng chuyển đổi thành bất kỳ loại hình khác của tế bào. Chúng được sử dụng trong tiêu hóa thức ăn, phân phối nó tới các tế bào khác, và cho các chức năng khác. Một số loại tế bào có một nhân đơn và màng nhân, nhưng được kết nối với các tế bào nhân đơn khác và các hợp bào chính bởi cầu nối làm bằng tế bào chất. Các sclerocytes được tạo thành gai có nhiều hạt nhân, và trong ấu trùng hải miên thủy tinh chúng kết nối với các mô khác bằng cầu tế bào chất; các kết nối như vậy giữa sclerocytes đến nay vẫn không được tìm thấy ở hải miên trưởng thành. Những cây cầu được kiểm soát bởi mối nối cắm có thể cho phép hoặc ngặn một số chất vượt qua[15]. - Lưu lượng nước và cấu trúc cơ thể: Choanocyte - còn được gọi là tế bào cổ áo, choanocytes lót khoang bên trong của miếng hải miên. Chúng có một nếp, hình phễu cổ áo (thu thập các hạt thức ăn) và một roi (roi xung quanh, di chuyển nước). Các miếng hải miên có được chất dinh dưỡng và oxycủa nó bằng cách xử lý choanocytes nước chảy qua. Choanocytes cũng tham gia vào tái sản xuất xốp; bắt nổi tinh trùng. Lớp biểu bì (pinacocyte) - lớp biểu bì là lớp tế bào bao gồm các bề mặt bên ngoài của miếng hải miên. Các tế bào mỏng, phẳng của lớp biểu bì được gọi là pinacocytes. Flagellum - cấu trúc giống như cái roi của một choanocyte; di chuyển roi, đẩy nước (trong đó có chứa chất dinh dưỡng) thông qua các miếng hải miên. Osculum - một cửa trong một miếng hải miên qua đó nước có thể chảy ra. Hải miên có thể có nhiều hơn một oscula. Pinacocyte - là tế bào mỏng, phẳng của lớp biểu bì, lớp ngoài của miếng hải miên của các tế bào. Porocyte - tế bào với lỗ chân lông cho phép nước vào miếng hải miên; chúng được đặt trên khắp cơ thể của miếng Hải Miên. Spicule - spicules là gai nhọn (calcium carbonate) nằm trong mesohyl. 14 Spicules tạo thành bộ xương của hải miên. Spongin - các, sợi xơ linh hoạt tạo thành bộ khung của hải miên sừng; spongin nằm trong mesohyl. Spongocoel - các trung tâm, khoang mở trong một miếng hải miên, mà qua đó nước chảy vào miếng hải miên. Nước chảy vào một miếng hải miên thông qua các tế bào với các lỗ chân lông (các tế bào được gọi là porocytes) nằm trên khắp cơ thể của nó. Nước chảy ra từ một miếng Hải Miên qua các lỗ hở lớn gọi oscula (số nhiều). Mỗi một lỗ lớn được gọi là một osculum. Hình 1.4. Giải phẩu cấu tạo cơ thể hải miên Hầu hết các miếng xốp làm việc giống như ống khói: chúng lấy nước ở phía dưới và đẩy nó từ osculum (miệng nhỏ) ở đầu. Kể từ môi trường xung quanh là dòng nhanh hơn ở phía trên, các hiệu ứng hút mà họ sử dụng bằng nguyên lý Bernoulli. Bọt biển có thể kiểm soát lưu lượng nước bằng cách kết hợp khác nhau của toàn bộ hoặc một phần đóng osculum và Ostia (các lỗ chân lông hấp thu) và thay đổi nhịp đập của hai roi, và có thể đóng cửa nếu có nhiều cát hoặc bùn trong nước [9]. Các cấu trúc cơ thể đơn giản nhất trong miếng xốp là một ống hoặc lọ hình dạng gọi là "asconoid", nhưng điều này bị giới hạn kích thước của con vật. Các cấu 15 trúc cơ thể được đặc trưng bởi một spongocoel cuống giống như được bao quanh bởi một lớp duy nhất của choanocytes. Nếu chúng chỉ đơn giản là mở rộng quy mô, tỷ lệ khối lượng cho các diện tích bề mặt tăng lên, bởi vì bề mặt tăng theo bình phương của chiều dài hoặc chiều rộng trong khi khối lượng tăng lên tương ứng với các khối lập phương. Số lượng mô cần thức ăn và oxy được xác định bởi khối lượng, nhưng năng lực bơm mà nguồn cung cấp thức ăn và oxyphụ thuộc vào diện tích của các choanocytes. 1.1.4. Đặc điểm của các nhóm hoạt chất sinh học chống oxy hóa có trong hải miên a) Nhóm hợp chất phenol: Các hợp chất phenol là nhóm hợp chất hữu cơ có chứa một hay nhiều nhóm hydroxyl (-OH) gắn với một hay nhiều vòng thơm. Cấu trúc của chúng tương tự các hợp chất dạng rượu nhưng lớp phenol có các thuộc tính duy nhất chỉ chúng có (do nhóm hydroxyl không liên kết với nguyên tử cacbon no). Trong cấu trúc của chúng, vòng thơm kết hợp mạnh với nguyên tử oxyvà liên kết tương đối lỏng lẻo giữa nguyên tử oxynày với nguyên tử hydro trong nhóm hydroxyl do đó dễ tách nguyên tử hydro ra khỏi nhóm nên chúng có tính acid tương đối cao. Một số polyphenol thực vật tiêu biểu như catechine, flavanone, anthocyanidin, flavones, flavonol, isoflavone, acid hydroxycinnamic, lignin, tachin. Polyphenol là những hợp chất phân cực nên thường dùng các dung môi phân cực để chiết tách chúng ra khỏi nguyên liệu, các dung môi thường dùng để tách chiết như nước cất, ethanol, methanol,… Trong đó, dung môi được sử dụng phổ biến là nước cất và ethanol do tính an toàn, có khả năng hòa tan tốt các polyphenol, cũng như giá thành rẻ. b) Nhóm hợp chất sterol: Sterol là rượu đa vòng, no đơn chức và là dẫn xuất của steran. Các sterol là các chất kết tinh, dễ tan trong cloroform, ete, rượu nóng…, không tan trong nước. Đặc tính của sterol là không phân cực, nên rất kém tan trong nước nhưng tan trong dầu béo và các dung môi hữu cơ không phân cực như ete, dầu hỏa, benzen, cloroform, aceton,… nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol ra khỏi nguyên liệu. Đối với các sterol glycoside có thể chiết bằng ethanol. Sản phẩm chiết 16 bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của sterol và các chất béo, các chất kém phân cực khác có trong nguyên liệu như lipid (đối với sterol động vật), caroten, leucithin (đối với sterol thực vật). Phải thực hiện phản ứng xà phòng hóa để tách các chất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Thực hiện sắc ký (cột, lớp mỏng, giấy,...) để phân lập hoặc kết tinh phân đoạn, tinh chế sterol. c) Nhóm hợp chất flavonoid: Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, có ở phần lớn các bộ phận của các loại thực vật bậc cao. Flavonoid có khung cơ bản là C6-C3-C6 gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon, cấu trúc có thể là vòng kín hoặc mở. Trong thực vật, flavonoid tồn tại chủ yếu ở hai dạng: dạng tự do (aglycol) và dạng liên kết với đường (glycoside). Trong đó, dạng aglycol thường tan trong các dung môi hữu cơ như ete, aceton, cồn nhưng hầu như không tan trong nước, còn dạng glycoside thì tan trong nước nhưng không tan trong các dung môi không phân cực như aceton, benzen, chloroform. d) Nhóm hợp chất saponin: Saponin là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, galactose, pentose, metyl pentose,...) và phần sapogenin (aglycol). Phân sapogenin có thể là steroid hay triterpenoid. Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị hắc và làm hắt hơi mạnh. Thường các steroid saponin thì tả truyền còn triterpenoid saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy của các sapogenin thường rất cao. Saponin là hợp chất phân cực nên thường sử dụng các dung môi phân cực để chiết xuất saponin. e) Nhóm hợp chất polypeptide: Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với nhau bằng liên peptide. Khác với protein, polypeptide có khối lượng phân tử dưới 10.000 Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống 17 oxy hóa in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hóa acid linoleic (Elias và cộng sự, 2008). Đặc tính chống oxy hóa của polypeptide phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần acid amin và khối lượng phân tử của peptide (Tang và cộng sự, 2009; Udenigwe và Aluko, 2011). Nước và các dung môi phân cực hòa tan tốt polypeptide nên chúng được sử dụng để chiết xuất peptide. f) Nhóm hợp chất glycoside Glycoside là hợp chất hữu cơ được cấu tạo gồm phần đường (glucose, ramnose, digitoxose, xymarose,...) và phần aglycol (steroid, sterol, acid mật, hormon,...). Tùy theo đặc điểm cấu tạo của aglycol mà glycoside có hoạt tính sinh học khác nhau. Hoạt tính chống oxy hóa của glycoside khác nhau phụ thuộc vào độ hòa tan và sự oxy hóa aglycon chứa monosaccharide hoặc disaccharide ở vị trí C3. Glycoside là hợp chất phân cực nên hòa được trong các dung môi phân cực như nước cất, methanol, ethanol,... Vì vậy, để chiết xuất glycoside thường sử dụng các dung môi phân cực. 1.1.5. Tình hình nghiên cứu về hải miên trên thế giới và Việt Nam - Tình Hình nguyên cứu trên thế giới: Trên thế giới, hải miên đã được biết đến và nguyên cứu từ khá lâu nhưng các công trình nguyên cứu mang tính chiều sâu thì chỉ mới xuất hiện trong vòng 20 năm trở lại đây. Hầu hết các loài bọt biển có chứa một lượng lớn các hợp chất hóa học, đôi khi các loài khác nhau chứa các chất cụ thể khác nhau. Điều này, nhân với hơn 9000 loài hải miên được biết đến, đại diện cho một nguồn lực rất lớn của các sản phẩm tự nhiên mới. Nhiều chất chuyển hóa thứ cấp trong hải miên đã trải qua một quá trình chọn lọc đối với hoạt động sinh học trong quá trình tiến hóa, và vì chúng phải khắc phục hiện tượng pha loãng của nước biển trong quá trình lọc nước, chúng thường rất mạnh để có hiệu quả trong môi trường biển. Do đó các công trình nguyên cứu chủ yếu tập trung vào các hoạt tính sinh học có khả năng chống oxy hóa và kháng khẩn trong hải miên và nguyên cứu ứng dụng những khả năng đó của hải miên vào 18 trong y học để nâng cao sức khỏe của con người. Cho đến nay, hơn 4000 sản phẩm tự nhiên mới đã được phân lập từ hải miên (hơn 10000 từ sinh vật biển nói chung). Sau đây là chỉ là một số nguyên cứu có liên quan. Nhiều nghiên cứu trong những năm gần đây phát hiện ra những hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải miên như chất chống oxy hóa, đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV (Mehbub và cộng sự, 2014). Trong số các nguồn hoạt chất sinh học chống oxy hóa từ tự nhiên, hải miên được xếp vào hạng có chứa hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao. Một số chất chuyển hóa có nguồn gốc từ loài hải miên như polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside và các hợp chất phenol cho thấy có khả năng chống oxy hóa mạnh so với vitamin E và vitamin C (Halliwell, 1994; Li và cộng sự, 1994; Chairman và Singh, 2012). Nghiên cứu của Li và cộng sự (1994) cho thấy các hoạt chất sinh học chiết xuất từ hải miên Aspergillus có khả năng chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với hydroxytoluene butylated (BHT). Ngoài ra Sato và cộng sự (2006) cũng đã tìm thấy các hợp chất carotenoids, polyphenol, glutathione trong một số loài hải miên, đây là những hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao. Yonghong Liu và các cộng sự (2008 ) đã nguyên cứu khả năng chống oxy hóa của các Alkaloid chiết từ Hải Miên thuộc chi Iotrochota đến từ vùng biển phía nam Trung Quốc. Đối tượng nguyên cứu là Alkaloid Purpurone được phân lập từ các miếng hải miên Iotrochota sp. Các hợp chất chống oxy hóa cho thấy hoạt động bằng cách sử dụng các xét nghiệm DPPH (DPPH được đo theo quy trình được mô tả bởi Blois (1958) và Braham et al. (2005)). Cấu trúc được thành lập trên cơ sở dữ liệu NMR và so sánh với số liệu báo cáo. Kết quả xét nghiêm cho IC50 là 19 µm cho thấy Purpurone Alkaloid là một chất chống gốc tự do mạnh 19 Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Purpurone Tiến sĩ D. Rama Sekhara Reddy thuộc viện khoa học trường đại học Washington, Mỹ và các cộng sự (2011) đã nguyên cứu khả năng chống oxy hóa, chống viêm và chống nấm của một loài hải miên Subergargoria Suberosa. Từ dịch chiết ethanol của hải miên Subergargoria Suberosa họ tiến hành phân lập đươc một Subergorgic axit và hai dẫn xuất có hoạt tính sinh học tương tự 2 và 7 đã được tổng hợp bằng cách giảm NaBH4 của hợp chất 1. Hình 1.6. Các dẫn xuất của Subergorgic axit 20 Trong nghiên cứu này, chất chống oxy hóa của ba dẫn xuất subergargoric acid 1, dẫn xuất 2 và dẫn xuất 7 cho thấy tiềm năng hoạt động chống gốc tự do triệt để được chứng minh trong IC50 cho giá trị 50 mg / ml, 0,27 mg / ml và 38 mg / ml tương ứng. Kết quả cho thấy acid subergargoric 1 có tác dụng chống oxy hóa và viêm cao nhất và cũng cho thấy hợp chất 7 có hoạt tính chống oxy hóa và chống viêm cao hơn hợp chất 2. Những kết quả này gợi ý rằng acid subergorgic cũng như các dẫn xuất của nó tương tự hợp chất 2 và hợp chất 7 có tiềm năng lớn như một chất có nguồn gốc tự nhiên có khả năng chống oxy hóa và chống viêm. Nghiên cứu của Kristina Sepcic (2010) về các hoạt tính sinh học của các chất chiết xuất từ hải miên nhiệt đới. Trong nghiên cứu này họ đã tiến hành thí nghiệm sàng lọc 66 chiết xuất được chiết từ 35 loài bọt biển biển từ Biển Caribbean (Curaçao) và từ tám loài từ Great Barrier Reef (Đảo Lizard). Dịch chiết xuất đã được chuẩn bị trong các dung môi hữu cơ và dung dịch nước và đã được thử nghiệm cho máu huyết tán, hemagglutinating, kháng khuẩn và các hoạt động chống acetylcholinesterase (AChE), cũng như khả năng của chúng để ức chế hoặc kích hoạt protein phosphatase tế bào 1 (PP1). Họ kết luận rằng hầu như tất cả các chất chiết xuất từ hải miên trong nghiên cứu này cho thấy chúng có ít nhất là một hoạt tính, nhưng chỉ có vài đại diện cho một nguồn đầy hứa hẹn cho các nghiên cứu về thành phần hoạt tính của chúng. Hầu hết các thành phần này là các hợp chất hữu cơ mà hoạt tính không bị phá hủy bởi nhiệt. Tuy nhiên, một số hoạt tính hoạt động có thể bị mất khi sưởi ấm như là kết quả của sự biến tính. Ilkay Erdogan Orhan (2012) và các cộng sự tiến hành cứu các chất chiết xuất từ hải miên từ nhiều loại khác nhau trên biển Địa trung hải thuộc địa phận Thổ Nhĩ Kỳ. Kết quả các chất chiết xuất hải miên cho thấy tính kháng khuẩn đáng chú ý, hoạt động chống AChE và gốc tự do DPPH hiệu quả. Newman và Cragg (2004) đã công bố về các chất có công dụng trong y dược được chiết xuất từ hải miên. + Vidarabine, một loại thuốc chống virus (dùng để chống lại các loại virus viêm não Herpes simplex), và Ara-C, một loại thuốc chống ung thư, cô lập khỏi hải 21 miên Tethya crypta. Cả hai hợp chất được sử dụng lâm sàng trong nhiều năm. + Halichondrin B được phân lập từ loài hải miên Halichondria okadai, nhưng cũng đã được tìm thấy trong các loài hải miên Lissodendoryx. Các hợp chất đã được đánh giá hoạt tính chống ung thư. Một chất tổng hợp của chúng được gọi là E7389, hiện đang trong thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh ung thư phổi. + Discodermolide, được tìm thấy trong các loài Hải miên Discodermia dissolute, chúng đang trong các thử nghiệm lâm sàng đối với các khối u rắn. + Agelasphins từ loài Hải miên mauritianus Agelas có hoạt tính chống ung thư và kích thích miễn dịch. Hiện trong các thử nghiệm lâm sàng cho điều trị miễn dịch ung thư. + Psammaplin A là một hợp chất lần đầu tiên được tìm thấy trong loài Hải miên Psammaplysilla. Nó là một cấu trúc dẫn cho các hợp chất chống ung thư tổng hợp NVP-LAQ824 và cho kháng sinh chống lại các vi khuẩn Staphylococcus aureus. + Contignasterol được phân lập từ các loài hải miên Petrosia contignata. Các dẫn xuất tổng hợp của hợp chất này trong các thử nghiệm lâm sàng đối với bệnh hen suyễn và viêm da và mắt. - Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Nguyễn Xuân Cường và các cộng sự (2007) đã nguyên cứu và phân lập các thành phần hóa học của loài hải miên xestospongia testudinaria thu thập tại Việt nam. Trong nguyên cứu này họ đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất là: sairingosterol, 5,8-epidioxychlost-6-en-3-ol, cholest-7-en-3-one, cholesterol, thymidine, thymine, batilo và chimyl alcohol. 1.2. Quá trình oxy hóa, chất chống oxy hóa và khả năng chống oxy hóa của protein 1.2.1. Quá trình oxy hóa Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa 1.2.1.1. Gốc tự do Theo định nghĩa, gốc tự do ( Free radical) là bất cứ chất nào chỉ có một điện tử duy nhất ( electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử. 22 Chính do chứa electron tự do mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn mang tính "huỷ hoại", sẵn sàng thực hiện tính oxyhoá, cướp điện tử của chất mà nó tiếp xúc để ghép đôi với electron tự do của nó và làm chất bị nó oxyhoá bị huỷ hoại nặng nề. Phản ứng oxyhoá thường thấy hàng ngày là phản ứng đốt cháy, còn trong cơ thể phản ứng oxyhoá của gốc tự do êm ái hơn nhưng lại gây huỷ hoại tế bào, đặc biệt ở màng tế bào hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào, nó phá huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá. Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào. Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ có ở ngoài cơ thể. 1.2.1.2. Nguồn gốc hình thành các gốc tự do Nguồn gốc hình thành các gốc tự do (OH-, -O -, NO-.,...) như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,... Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,... và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch.. .Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống ôxi hóa bổ sung như VTM A, VTM C, VTM E, polyphenol,... 1.2.2. Chất chống oxy hóa 1.2.2.1 Khái niệm chất chống oxy hóa Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác. Sự oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng. 1.2.2.2. Cơ chế chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa hoạt động theo các cơ chế khác nhau, dựa vào cơ chế hoạt động phân loại chất chống oxy hóa thành 2 nhóm là chất chống oxy hóa sơ cấp và chất chống oxy hóa thứ cấp. 23 - Chất chống oxy hóa sơ cấp: Chất chống oxy hóa sơ cấp hoạt động theo cơ chế phá vỡ chuỗi phản ứng. Cơ chế này được giải thích như sau: Các gốc tự do có chứa điện tử độc thân chưa ghép đôi nên hoạt động kích hoạt sự oxy hóa. Khi quá trình oxy hóa xảy ra lại tạo thành các gốc tự do và tiếp tục tham gia kích hoạt làm cho quá trình oxy hóa diễn ra ngày càng mãnh liệt hơn. Những chất hợp chất có khả năng nhường nguyên tử hydro làm trung hòa gốc tự do và nhờ đó làm chậm hoặc ngăn chặn quá trình oxy hóa được gọi là chất chống oxy hóa. Các phản ứng xảy ra như sau: R• + AH → RH + A• RO• + AH → ROH + A• ROO• + AH → ROOH + A• R• + A• → RA RO• + A• → ROA ROO• + A• → ROOA - Chất chống oxy hóa thứ cấp: Chất chống oxy hóa thứ cấp không chuyển các gốc tự do thành phân tử ổn định, nhưng nó có tác dụng tạo phức với ion kim loại ức chế xúc tác cho quá trình oxy hóa, nhường nguyên tử hydro cho chất chống oxy hóa sơ cấp, phân hủy hydroperoxide thành các phân tử không phải là gốc tự do, ức chế hoạt động của oxynguyên tử, hấp thụ tia cực tím hoặc khử oxy. 1.2.3. Khả năng chống oxy hóa của protein a) Peptide và hợp chất polypeptide Polypeptide là hợp chất hữu cơ được cấu tạo từ các acid amin liên kết với nhau bằng liên peptide. Khác với protein, polypeptide có khối lượng phân tử dưới 10.000 Da trong khi protein có khối lượng phân tử lớn hơn. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng các polypeptide có hoạt tính chống oxy hóa in vitro như khử các gốc tự do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, tạo phức càng với ion kim loại, khử sắt và chống oxy hóa acid linoleic (Elias và cộng sự, 2008). Đặc tính chống oxy hóa của polypeptide phụ thuộc vào cấu 24 trúc, thành phần acid amin và khối lượng phân tử của peptide (Tang và cộng sự, 2009; Udenigwe và Aluko, 2011). Peptide là một chuỗi các axít amino tương tự như protein nhưng ngắn hơn. Peptide không kèm theo các hóa chất khác và đuợc chiết xuất từ các amino axit có nguồn gốc tự nhiên. chúng cũng kích thích sản xuất collagen và làm tăng tác dụng của chất chống oxy hóa. Trong cơ thể động vật và thực vật peptide làm nhiệm vụ bảo vệ cho cơ thể. Loại peptide đầu tiên phải kể đến ở động vật có xương sống là các peptide kháng thể trong máu, chúng là những yếu tố nhận biết đắc lực các tác nhân vi khuẩn, virus và các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể và để loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Ngoài ra trong máu của động vật trên còn có các interferon với nồng độ nhỏ có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của virus. Trong máu của động vật còn có các peptide chống chảy máu như fibrin... Ở thực vật có nhiều loại tạo ra những peptide độc tố, chỉ với liều lượng nhỏ cũng có khả năng giết chết người và động vật. Ngoài ra trong cơ thể động vật, thực vật và các sinh vật khác nói chung đều tồn tại một hợp chất có bản chất peptide làm nhiệm vụ bảo về đó là lectin. Vì có khả năng liên kết đường ruột một cách đặc hiệu và chọn lọc nên lectin có thể kết tủa các tác nhân hay tế bào lạ có cấu trúc đường xâm nhập vào cơ thể để bảo vệ cơ thể. b) Thành phần chống oxy hóa của protein thủy phân Không chỉ có peptit và các acid amin thu được từ quá trình thủy phân protein có hoạt tính chống oxy hóa mà bản thân protein cũng có hoạt tính chống oxy hóa. Trong phân tử protein đã chứa sẵn những đoạn peptite có hoạt tính sinh học. tuy nhiên, khi nằm trong mạch protein (hay polypeptide) các hoạt tính này tồn tại dưới dạng tiềm ẩn, không được thể hiện. Khi được giải phóng ra khỏi mạch bằng cách thủy phân với enzyme đặc hiệu, các đoạn peptide và các acid amin tự do này sẽ thể hiện được hoạt tính của chúng. Các acid min tự do thương thể hiện hoạt tính chống oxy hóa không cao trong thực phẩm và các hệ thống sinh học; sự phân giải triệt để protein tạo thành các acid amin tự do thường làm giảm hoạt tính chống oxy hóa. Hoạt tính chống oxy hóa của các peptide thường cao hơn so với các acid amin tự do, khả năng đó có liện quan tới tính chất đặc biệt được hình thành từ thành phần 25 cấu tạo, tính chất vật lý và sự ổn định của các peptide. Phần lớn các peptide chống oxy hóa có nguồn gốc thực phẩm có khối lượng khoảng 500-800 Da, một số peptide có khối lượng phân tử 8-15 kDal. Trong thành phần cấu tạo của các peptide này có chứa các acid amin kị nước như valine, leucine tại đầu nitơ tận cùng và proline, histidine, tyrosine, tryptophan, methionine trong thành phần chuỗi. Các acid amin kị nước như valine và leucine có thể làm tăng sự tương tác giữa peptide và acid béo để loại gốc tự do . Hoạt tính chống oxy hóa của histidine trong chuỗi peptide được xác định là do khả năng cho hydro, giữ gốc peroxylipid, khả năng tạo phức kim loại của vòng amidazol. Trong chuỗi peptide, acid min histidine và proline đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa và peptide có cấu trúc proline-histidine-histidine có khả năng chống oxy hóa cao hơn. Hơn thế nữa peptide này có sự tương tác với các chất chống oxy hóa tan trong lipide như α-tocopherol, BHA và tăng hoạt tính chống oxy hóa của chúng. 1.3. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa và phân đoạn protein 1.3.1. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hóa - Hoạt tính khử gốc tự do DPPH Vào năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không phân hủy, không nhị trùng hóa, không phản ứng với oxyđó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine). DPPH• là một gốc tự do có màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bước sóng 517nm và sản phẩm khử của nó là DPPH-H thì có màu vàng cam. Ngày nay DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng khử gốc tự do. Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định. Nguyên tắc các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của 26 dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa được minh họa bằng phản ứng được mô tả bên dưới: Z• + AH = ZH + A• Trong đó: Z• : là gốc tự do DPPH, AH là chất chống oxy hóa. - Hoạt động khử ion sắt III (Fe3+) Cơ chế của hoạt động khử ion Fe3+ là sự ghép đôi electron và đình chỉ phản ứng oxy hóa dây chuyền bằng sự khử dạng oxy hóa thành dạng tự do. Nguồn gốc chính của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Haber-Weiss, trong đó gốc tự do superoxit khử Fe3+ thành Fe2+, sau đó nó xúc tác cho phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa nó sẽ khử gốc tự do superoxit nên hạn chế sự khử Fe3+ thành Fe2+ và làm cho dung dịch giữ màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ tăng lên. O2•- + Fe3+ = O2 + Fe2+ Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- +•OH - Hoạt động khử gốc H2O2 Hydroperoxit có thể làm tăng sự hình thành gốc tự do hydroxyl trong tế bào và gây độc. Nguồn gốc của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2 Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + •OH - Hoạt động chuyển ion sắt II (Fe2+) Nguồn gốc của các gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2. Như vậy, khi có mặt của chất chống oxy hóa sẽ hạn chế sự chuyển Fe2+ thành Fe3+ nên màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt hơn, do đó độ hấp thụ sẽ giảm đi. Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + •OH - Phương pháp phân tích tổng năng lực khử Nguyên lý: Khi cho chất chống oxy hóa phản ứng với kali ferricyanide, acid trichloroacetic và clorua sắt III ở 50oC trong thời gian 20 phút sẽ tạo thành phức 27 màu xanh làm tăng độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sóng 700nm. Hoạt tính chống oxy hóa tăng tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 700nm. 1.3.2. Các phương pháp tinh sạch protein Các phương pháp tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hóa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hòa tan... của protein cần chiết tách. Nhiều protein còn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết tách các protein này còn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể (protein có tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nó) cần sử dụng các phương pháp khác nhau. Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để tách phân đoạn các phân tử protein có hoạt tính sinh học. Có nhiều phương pháp kết tủa khác nhau như: kết tủa bằng muối, kết tủa bằng các dung môi hữu cơ hoặc kết tủa ở pH đẳng điện (pI) của protein. 1.3.2.1. Phương pháp kết tủa protein bằng muối Kết tủa protein bằng muối là phương pháp được áp dụng phổ biến để tách phân đoạn các protein có hoạt tính sinh học. Khả năng hòa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính lý hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out). Tính tan của protein tăng nhẹ ở nồng độ muối thấp (salting in) được giải thích đầu tiên bởi Debye và Huckel (1923). Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân tử protein không mang điện tích, nhờ đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi. Debye và Huckel cho rằng tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch. Ở nồng độ muối cao tính tan của protein giảm mạnh (salting out), hiện tượng này được Kirkwood giải thích rằng sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự kết tủa. 28 Độ hòa tan protein ở nồng độ muối cao tuân theo công thức sau của Cohn: log S = B - KI Trong đó: S: độ hòa tan của protein B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch) I: cường độ ion của muối. Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối như ở hình sau. Hình 1.7. Độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối. Khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp để tách được protein mục tiêu. Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngoài ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp kết tủa giảm xuống. Hiệu quả kết tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate. 29 1.3.2.2. Phương pháp kết tủa protein bằng dung môi hữu cơ Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi trường giảm xuống. Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và hằng số điện môi: ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D) Trong đó S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ Sw: độ hòa tan của protein trong nước D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào Dw: hằng số điện môi của nước R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối A: hằng số khí Công thức trên cho thấy khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung môi hữu cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đó, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng độ thấp, ngoại trừ một số dung môicó thể được sử dụng ở nồng độ cao như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol. 1.3.2.3. Phương pháp kết tủa protein ở điểm đẳng điện Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ kết tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amin bị proton hóa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carboxyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi trường. 1.3.2.4. Phương pháp kết tủa protein bằng các non–ionic polymer Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non–ionic vào trong dung dịch protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm xuống. Các chất thường được sử dụng là dextrans và polyethylen glycols. µi = µi0 + RT (ln mi + fii mi + fij + mj) 30 Trong đó µi0: điện thế hóa học chuẩn của phần tử i µi: điện thế hóa học của phần tử i R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j fii: hệ số tương tác của phần tử i fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH môi trường vượt ra ngoài điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein. Loại non–ionic polymer sử dụng tùy thuộc vào khối lượng phân tử của protein mục tiêu. Tương tự như kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện, tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi thêm non–ionic polymer) thì khả năng hòa tan của protein cũng giảm xuống. Ưu điểm của phương pháp kết tủa bằng cách sử dụng non–ionic polymers là protein ổn định và có thể sử dụng ở nhiệt độ phòng. 1.3.2.5. Phương pháp kết tủa protein bằng ion kim loại Phương pháp này dựa vào sự gắn kết của ion kim loại với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng. Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhóm có chứa lưu huỳnh. Trong số các phương pháp kết tủa protein, phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sutfate có nhiều ưu điểm cho phép tách phân đoạn các protein từ dịch chiết rất hiệu quả (Burgess và Deutscher, 2009). Vì vậy, nghiên cứu này đã áp dung phương pháp kết tủa bằng ammonium sutfate để tách phân đoạn các protein có trong dịch chiết hải miên nhằm sàng lọc hoạt chất sinh học chống oxy hóa cao từ hải miên. 31 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu Hải miên (Spongia sp.) sử dụng trong nghiên cứu này được lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc vào tháng 12 năm 2014. Hình 2.1. Loài hải miên Spongia sp. lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc Ngay sau khi lấy mẫu, hải miên được ướp lạnh và vận chuyển về phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Tại phòng thí nghiệm, hải miên được bảo quản đông ở nhiệt độ - 20oC để sử dụng cho nghiên cứu này. 2.1.2. Hóa chất - 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), Bovine serum albumin (BSA), Folin–Ciocalteu reagent được mua từ công ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ. - Các hóa chất còn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hóa học, được mua từ công ty Loba Chemie, Ấn Độ và công ty Wako, Nhật Bản 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Bố trí thí nghiệm Quy trình thực hiện tổng quát: 32 Dịch chiết hải miên thô Tách phân đoạn protein lần 1 bằng AS Phân tích hoạt tính Phân tích hàm lượng chống oxy hóa protein Phân tích kết quả chọn phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao Tách phân đoạn protein lần 2 bằng AS Phân tích Phân tích hàm hoạt tính lượng protein Phân tích kết quả chọn các phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein cao Tinh chế Phân tích hoạt chống oxy hóa tính Phân tích hàm lượng protein Xử lý thống kê, so sánh giữa các phương pháp, chọn ra phương pháp thích Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 33 2.2.1.1 Quy trình tách chiết phân đoạn protein lần 1 dịch chiết từ hải miên. Dịch chiết hải miên thô Nồng độ AS dựa Cho kết tủa bằng AS theo bảng 2.1 (bắt đầu kết tủa bằng AS T0 = 100C. có nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ τ= V Ly tâm = 6000 vòng/phút. τ = 15 phút. Dịch (lặp lại Kết tủa cho đến khi nồng độ AS là 80% Pha loãng với nước cất Dịch Hải Miên phân đoạn - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: + Khử gốc tự do DPPH. + Tổng năng lực khừ. - Phân tích hàm lượng protein: phương Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên 34 Cách tiến hành: - Dịch chiết hải miên được chiết từ hải miên Spongia sp được bảo quản trong tủ đông phòng công nghệ chế biến 3 tai trường Đại học Nha Trang ở nhiệt độ ≤ -200C. Hải miên sau khi rã đông được ép ra bằng lực cơ học. - Sau đó tiến hành kết tủa bằng ammonium sulfate (AS). Lúc bắt đầu, kết tủa phân đoan ở nồng độ AS bão hòa 20% (nồng độ AS cho vào dựa theo bảng 2.1. lượng AS cho vào tính ở 100C). Lấy AS cho vào 1 lít dịch chiết hải miên, khuấy điều, chờ 30 phút để kết tủa được tạo hết, trong thời gian chờ phải đảm bảo nhiệt độ kết tủa là 100C. Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hòa ở 40C và 100C Nồng độ AS bão hòa (%) 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4oC gam/lít 109,9 56,6 58,3 60,2 62,2 64,3 66,6 69,0 71,7 10oC gam/lít 111,2 57,3 59,1 61,1 63,1 65,3 67,7 70,2 73,0 *Lưu ý nhiệt độ có ảnh hưởng đến nồng độ bão hòa và hoạt tính protein. - Sau khi chờ 30 phút ta tiến hành ly tâm lạnh theo thông số sau: + Vận tốc : 6000 vòng/phút. + Nhiệt độ: 100C. + Thời gian 15 phút. - Sau khi ly tâm song ta tiến hành tách ra làm 2 phần: + Phần kết tủa pha loãng với nước cất (tùy vào lượng kết tủa mà ta pha loãng thích hợp). Sau đó đem đi bảo quản ở nhiệ độ ≤ -800C. + Phần dịch tiếp tục đi phân đoạn bằng AS, mỗi lần lặp lại thì nồng độ AS bão hòa đi kết tủa phân đoạn protein tăng thêm 10% cho tới khi nào nồng độ AS bão 35 hòa là 80% thì dừng lại. - Sau quy trình ta thu được các phân đoạn là 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. - Cuối cùng ta tiến hành phân tích các chỉ tiêu chống oxy hóa và hàm lượng protein để chọn ra phân đoạn tốt nhất. 2.2.1.2. Quy trình tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1 Các phân đoạn protein có hoạt tính cao ở phân đoạn lần 1 Kết tủa bằng AS nồng độ bão hòa (bắt đầu kết tủa bằng AS có nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ AS thêm 10%) Ly tâm Dịch (tới khi nào hết kết tủa thì dừng lại). Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0 = 100C. τ = 30 phút V=6000vòng/phút. τ = 15 phút. T0 = 100C Kết tủa Pha loãng với nước cất Các phân đoạn - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: + Khử gốc tự do DPPH. + Tổng năng lực khử. - Phân tích hàm lượng protein: phương pháp Lowry. Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1. 36 Cách tiến hành: - Sau khi phân đoạn lần 1 ta thu được các phân đoạn protein, chọn các phân đoạn có hoạt tính sinh học tốt nhất sau đó ta tiến hành đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn lần 1 này. - Sau đó tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hóa và hàm lượng protein. - Phân tích số liệu chọn các phân đoạn tốt nhất. 2.2.1.3. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn protein 37 Các phân đoạn Các phân đoạn tốt tốt nhất của phân nhất khi đi phân đoạn lần 1. đoạn lần 2 từ các Dịch chiết thô V=6000 vòng/phút Τ=15phút. Ly tâm phân đoạn tốt nhất T0 = 100C của phân đoạn lần 1 Kết tủa phân đoạn protein bằng AS tổng Cho trực tiếp AS nồng độ bão hòa 80% tổng nồng (theo độ 80% quy trình Tỷ lệ phenol:mẫu 1:1 Chiết protein bằng phenol pH: 7 ÷ 9. Votex: 5 phút Ly tâm Vận tốc: 6000 vòng/phút Tách dịch phenol có chứa protein τ = 15 phút Nồng độ AA/metanol: 0,1M Kết tủa bằng AA trong metanol Tỷ lệ AA : mẫu 5:1 T0C: -200C. τ = để qua đêm Ly tâm τ = 10 phút. Các thông số còn lại như trên 1 38 1 Tách kết tủa AA/metanol tỉ lệ 1:1 Siêu âm 1 phút trong Rửa kết tủa Ly tâm (lập lại 3 lần) Tách protein Acetonl 80% Tỉ lệ 1:1 Rử lại Làm khô Hòa tan Ly tâm τ = 5 phút Thu dịch protein - Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: + Khử gốc tự do DPPH. + Tổng năng lực khừ. - Xác định hàm lượng protein: phương pháp Lowry. Hình 2.5. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn. Cách tiến hành: Sau khi xử lý số liệu chọn các phân đoạn tốt nhất của phân đoạn lần 1 và các phân đoạn tốt nhất khi đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn tốt nhất lần 1 ta tiến hành 39 đi tinh sạch để loại bỏ bớt cặn, tạp. Đồng thời đi phân đoạn protein bằng AS tổng nồng độ bão hòa 80% dịch chiết từ dịch chiết hải miên thô đã qua ly tâm, tiến hành như sau : hút 30 ml dịch chiết sau ly tâm sau đó cho 14,52g AS (cách tính: dựa vào bảng 2.1. Ta tính tổng của các nồng độ AS bão hòa từ 20%÷80% sau đó nhân 3 chia 1000) vào kết tủa và làm như hình 2.1 sau đó cũng đem đi tinh sạch. Quy trình tinh sạch thực hiện như sau: - Mẫu trước khi cho phenol phải đi đo pH và đảm bảo độ pH 7÷9 thì đem đi cho phenol tỉ lệ phenol: mẫu 1:1 vào và tiến hành votex trong vòng 5 phút, sau đó đem đi ly tâm ở vận tốc 6000 vòng/phút trong vòng 15 phút ở nhiệt độ 100C, tiếp theo ta tách dịch phenol có chứa protein đem đi kết tủa bằng AA trong metanol nồng độ 0,1M có tỉ lệ với mẫu ban đầu là 5:1, sau đó để lắng qua đêm ở nhiệt độ -200C, sáng hôm sau ta tiến hành ly tâm trong 10 phút với cùng các thông số ở trên, sau khi ly tâm ta tách kết tủa rồi rửa bằng AA trong metanol nồng độ 0,1M có tỉ lệ với mẫu ban đầu là 1:1, đem đi siêu âm 1 phút trong nước đá, tiếp tục ly tâm, tách kết tủa, rửa kết tủa cứ như vậy trong 3 lần. Khi đó đã tách được protein ta tiến hành rửa lại bằng acetol 80% tỉ lệ 1:1, làm khô bằng cách bỏ vào ngăn đông cho tới khi nào bay hết acetol. Tiếp theo ta hòa tan với 10ml nước cất, ly tâm trong 5 phút thu dich protein. - Cuối cùng đem dịch protein đi kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa, hàm lượng protein. - Xử lý thống kê, so sánh giữa các phương pháp. 2.2.2. Các phương pháp phân tích. 2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.1. 2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lượng khử Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp của Oyaizu và cộng sự (1986). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.2. 40 2.2.2.3. Phương pháp Lowry Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp Lowry và cộng sự (1951). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.3. 2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Số liệu trình bày trong báo cáo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Tính giá trị trung bình, vẽ đồ thị và so sánh sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0.05). Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê và vẽ đồ thị với sự hỗ trợ của phần mềm Kingsoft Spreadsheets và phần mềm R 3,1,2 41 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Hoạt tính chống oxy hóa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn lần 1 từ dịch chiết hải miên. Như chúng ta đã biết hải miên là loài sinh vật có hoạt tính sinh học cao. Các hợp chất chiết từ hải miên có hoạt tính sinh học cao có khả năng chống oxy hóa, đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV. Theo các nguyên cứu gần đây cho thấy trong dịch chiết hải miên có nhiều hợp chất protein và họ cho rằng có mối liên quan giữa protein và các hoạt tính sinh học có trong Hải miên. Từ đó tôi sử dụng muối Ammonium sufate để tách phân đoạn protein có hoạt tính sinh học. Sau khi phân đoạn lần 1 tôi tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hóa và xác định hàm lượng protein, kết quả nghiên cứu được thể hiện qua các hình sau Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn lần 1 từ nồng độ AS bão hòa 20% đến 80% và dịch chiết hải miên thô ban đầu. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). 42 Dựa vào đồ thị Hình 3.1 và bảng xử lý số liệu R (phục lục2a), ta nhận thấy: - Việc phân đoạn protein có ảnh hưởng tới hoạt tính chống gốc tự do DPPH hơn là ảnh hưởng của nồng độ các phân đoạn, tuy nhiên cả 2 ảnh hưởng điều có ý nghĩa thống kê do cả 2 điều có trị sô P rất thấp < 0.05. - Nếu đem so sánh dịch chiết chưa phân đoạn với các phân đoạn khác thì ta thấy rằng: + Phân đoạn 20% khử nhiều hơn 0.2058 mM/ml DPPH so với dịch chưa phân đoạn với sai số chuẩn là 0.1047, tuy nhiên sư khác biệt này không có ý nghĩa thống kê do trị số P > 0.05. + Phân đoạn 30% khử nhiều hơn 0.7717 mM/ml DPPH, phân đoạn 40% khử nhiều hơn 1.6483 mM/ml DPPH, phân đoạn 50% khử nhiều hơn 2.4376 mM/ml DPPH, phân đoạn 60% khử nhiều hơn 2.0137 mM/ml DPPH, phân đoạn 70% khử ít hơn 1.9805 mM/ml DPPH, phân đoạn 80% khử ít hơn 1.6687 mM/ml DPPH. Với sai số chuẩn là 0.1047 và có trị số P < 0.05 nên các giá trị trên điều có ý nghĩa về mặt thống kê. - Phân đoạn 50% có khả năng khử gốc tự do là tốt nhất, sau đó theo thứ tự là phân đoạn 60%, phân đoạn 40%, phân đoạn 30%, phân đoạn 20% và dịch chiết chưa phân đoạn vì có trị số p = 0.5116, nên khả năng khử gốc tự do DPPH là như nhau, phân đoạn 70% và 80% có giá trị P = 0.0703 nên chúng không có sự khác nhau trong việc khử gốc tự do DPPH. 43 Hình 3.2. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn protein dịch chiết hải miên lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Qua đồ thị Hình 3.2 và bảng xử lý số liệu bằng phần mềm R (phụ lục 3a) ta có thể thấy rằng nếu lấy giá trị BHT của dịch chiết chưa phân đoạn làm giá trị để so sánh với giá trị BHT của các phân đoạn khác với độ sai số chuẩn là 3.163 thì ta có các kết quả như sau: Phân đoạn 20% có giá trị BHT thấp hơn khoảng 33.162 mg/ml, với trị số P < 0.05; phân đoạn 30% có giá trị BHT thấp hơn khoảng 32.1 mg/ml, với trị số P < 0.05; phân đoạn 40% có giá trị BHT thấp hơn khoảng 1.961, với trị số P > 0.05 vì vậy nó không có ý nghĩa về mặt thống kê; phân đoạn 50% và phân đoạn 60% có giá trị BHT cao hơn lần lượt là 24.229 mg/ml và 26.239 mg/ml, với trị sô P < 0.05; phân đoạn 70% và 80% có giá trị BHT thấp hơn lần lượt là 42.195 mg/ml và 35.522 mg/ml, với trị số P < 0.05. Vì vậy ta có thể kết luận được rằng phân đoạn 60% có giá trị BHT cao nhất, tuy nhiên khi so sánh giữa phân đoạn 60% và 50% ta nhận thấy rằng trị số P= 0.9995, vì vậy giá trị BHT của phân đoạn 50% và 60% là không không khác biệt về ý nghĩa thống kê, giá trị BHT cao tiếp theo là phân đoạn 40% và dịch chưa phân đoạn, khi so sánh giá trị BHT của cả hai thì cho trị số P=0.9996, vì vậy chúng có giá trị BHT không khác nhau về mặt thống kê, khi đi so sánh giá trị của phân đoạn 20%, 44 30%, 70%, 80%, thi chúng cho các trị số P > 0.05, do đó chúng không khác nhau về mặt ý nghĩa thống kê. Qua 2 phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa từ phân đoạn protein lần 1 từ Hải miên ta có thể thấy rằng hoạt tính sinh học tăng dần từ dịch chưa phân đoạn đến cao nhất là phân đoạn 50% và 60% sau đó giảm dần đến phân đoạn cuối cùng là 80%. Ta có thể giải thích là do trong dịch chiết chưa phân đoạn có lượng protein nhiều nhưng hàm lượng lại không cao do có quá nhiều tạp chất khác nhau dẫn tới hoạt tính không cao, khi ta đi phân đoạn bằng muối AS sẽ loại bỏ một phần được các tạp chất có trong dich chiết làm tăng hàm lượng protein dẫn đến hoạt tính cao lên. Trong phân đoạn 50% có hàm lượng protein cao nhất nên hoạt tính là cao nhất, tiếp theo là các phân đoan 60% và 40%. Để chứng minh cho lập luận trên ta có thể dựa vào đồ thị Hình 3.3. Hình 3.3. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0,05). Dựa vào đồ thị và bảng xử lý số liệu từ phần mềm R (phụ lục 3a) thì ta có thể nhận thấy rằng hàm lượng protein tăng dần từ dịch chiết chưa phân đoạn đến phân đoạn 20%, 30%, 40% và đạt cực đại ở phân đoạn 50% và sau đó giảm dần ở phân đoạn 60%, 70%, 80%. Ngoài ra ta cũng có thể nhận thấy rằng hàm lượng protein tăng 45 đột biến từ phân đoạn 30% lên phân đoạn 40% (49.50 mg/ml so với 68.98 mg/ml) và hàm lượng protein giảm đột ngột từ phân đoạn 60% lên phân đoạn 70% (77.28 mg/ml so với 35.65 mg/ml), đồng thời hàm lượng protein của dịch chiết chưa phân đoạn không có sự khác biệt về mặt thống kê so với hàm lượng protein trong dich chiết phân đoạn 70% vì có trị số P =1 Nguyên nhân dẫn đến các phân đoạn 40%, 50%, 60% có hàm lượng protein cao là do khi do muối AS có nồng độ thấp 20%, 30% không đủ nồng độ để làm kết tủa protein trong dịch chiết hải miên vì trong hải miên chứa đa số là các protein có tính tan trung binh, khi cho nồng độ muối thấp chỉ kết tủa được các protein, khó tan dẫn đến không thu được nhiều protien, các nồng độ muối cao 70%, 80% cũng không thu được nhiều do các protein co tính tan trung bình nên các nồng độ muối trung bình đã thu được phần lớn protein chỉ còn một số protein có tính tan cao. Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa protein và khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein từ phân đoạn lần 1. Dựa vào kết quả phân tích số liệu bằng phần mềm R (phụ lục 3a) ta thấy rằng với giá trị kiểm định t = 6.5204 và trị số P = 3.288e-07, ta có thể kết luận rằng protein trong các phân đoạn và khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn lần 1 có liên quan tới nhau. 46 Hình 3.5. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa tổng năng lực khử của các phân đoạn lần 1 với protein có trong các phân đoạn đó. Dựa vào kết quả phân tích bằng phần mềm R (mục lục 2a) ta thấy giá trị kiểm định t = 8.6234 và trị số P = 1.278e-09, ta có thể kết luận được rằng protein trong các phân đoạn lần 1 có ảnh hưởng đến tổng năng lực khử của các phân đoạn protein lần 1. Dựa vào các kết quả nguyên cứu và phân tích trên có thể thấy rằng: - Protein có ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết hải miên. - Phân đoạn nào có hàm lượng protein càng cao thì khả năng chống oxy hóa càng cao. - Phân đoạn protein 50% có hàm lượng protein cao nhất, do đó khả năng chống oxy hóa là cao nhất, các phân đoạn 40%, 60% cũng có hàm lượng protein cao nên hoạt tính cao. Vì vậy nguyên cứu này chọn các phân đoạn protein 40%, 50% và 60% để tiếp tục các bước tiếp theo. 3.2. Hoạt tính chống oxy hóa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn lần 2 từ dịch chiết hải miên. Sau khi phân tích kết quả từ phân đoạn lần 1 chọn các phân đoạn protein 40%, 50% và 60% có hoạt tính chống oxy hóa cao để tiếp tục phân đoạn lần 2. Sau khi phân 47 đoạn lần 2 thu được các phân đoạn protein sau: + Phân đoạn AS nồng độ bão hòa 20%, 30%, 40% của phân đoạn 40% lúc đầu, được ký hiệu lần lượt là 20% (40%), 30% (40%), 40% (40%), số trong ngoặc là phân đoạn lần 1. + Phân đoạn AS nồng độ bão hòa 20%, 30%, 40%, 50% của phân đoạn 50% lúc đầu, được ký hiệu lần lượt là 20% (50%), 30% (50%), 40% (50%), 50% (50%), số trong ngoặc là phân đoạn lần 1. + Phân đoạn AS nồng độ bão hòa 20%, 30%, 40%, 50% của phân đoạn 60% lúc đầu, được ký hiệu lần lượt là 20% (60%), 30% (60%), 40% (60%), 50% (60%), số trong ngoặc là phân đoạn lần 1 Kết quả phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn được thể hiện qua hình 3.6. 48 Hình 3.6. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn protein lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Đồ thị hình 3.6a thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn 20% (40%), 20% (50%), 20% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả xử lý số liệu (phụ lục2b) có thể thấy rằng khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn này khá cao, chứng tỏ hàm lượng protein trong các phân đoạn này cao. Nếu ta lấy phân đoạn 20% (40%) làm chuẩn để so sánh khả năng khử gốc tự do DPPH với các phân đoạn khác thì ta có: phân đoạn 20% (50%) có thể khử nhiều gốc tự do hơn phân đoạn 20% (40%) khoảng 1.8833 mM DPPH, với trị số P < 0.05; còn phân đoạn 20% (60%) khử được nhiều 49 hơn 1.7867 mM DPPH so với phân đoạn 20% (40%), với trị số P < 0.05. Khi ta đi so sánh giữa 2 phân đoạn 20% (50%) và 20% (60%) thì ta thấy rằng phân đoạn 20% (50%) khử được gốc tự do nhiều hơn phân đoạn 20% (60%) là 0.0967 mM DPPH. Tuy nhiên trị số p = 0.528 do đó sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Vì vậy ta kết luận rằng trong phân đoạn 20% của phân đoạn 40%, 50%, 60% thì phân đoạn 20% (50%) và 20% (60%) có khả năng khử gốc tự do DPPH là tốt nhất. Đồ thị hình 3.6b là đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn 30% (40%), 30% (50%), 30% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích số liệu ( phụ lục 3b) có thể nói rằng khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 30% (50%) và 30% (60%) là cao nhất, cụ thể nếu lấy phân đoạn 30% (40%) làm chuẩn để so sánh khả năng khử gốc tự do DPPH thì: phân đoạn 30% (50%) khử được nhiều gốc tự do hơn phân đoạn 30% (40%) là 0.7696 mM DPPH với trị số P < 0.05; phân đoạn 30% (60%) khử được nhiều hơn 0.7632 mM DPPH so với phân đoạn 30% (40%). Còn nếu đi so sánh khả năng khử gốc tự do của phân đoạn 30% (50%) và 30% (60%) thì khả năng khử gốc tự do của phân đoạn 30% (50%) cao hơn phân đoạn 30% (60%) là 0.0063 mM với trị số P = 0.9904 không có khác biệt về ý nghĩa thống kê. Như vậy có thể kết luận được rằng phân đoạn 30% lần 2 từ các phân đoạn 40%, 50%, 60% thì phân đoạn 30% (50%) và phân đoạn 30%(60%) có khả năng khử gốc tự do DPPH là tốt nhất. Đồ thị hình 3.6c là đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn 40% (40%), 40% (50%), 40% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3b) ta có thể nhận xét rằng khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 40% (40%), 40% (50%) thấp đi đáng kể, còn khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 40% (60%) vẫn còn khá cao, cụ thể nếu ta lấy phân đoạn 40% (40%) làm chuẩn để so sánh thì ta nhận thấy rằng phân đoạn 40% (50%) khử được ít hơn 0.1075 mM DPPH với trị số p < 0.05, còn phân đoạn 40% (60%) khử được nhiều hơn 2.3225 mM DPPH với trị số P < 0.05. Đồng thời ta có thể thấy rõ rằng phân đoạn 40% (60%) có khả năng khử gốc tự do là cao nhất tiếp theo là 40% (40%) cuối cùng là 40% (50%). Đồ thị hình 3.6d là đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của phân đoạn 50% 50 (60%) và 50% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả xử lí số liệu (mục luc 2b) ta có thể thấy rằng khả năng khử gốc tự do của 2 phân đoạn này là khá thấp, phân đoạn 40% (60%) khử được nhiều hơn phân đoạn 50% (50%) là 0,304 mM DPPH với trị số p 0.05. Đồ thị hình 3.7d là đồ thị biểu diễn tổng năng lực khử của các phân đoạn 50% (50%), 50% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3b) thấy: chỉ số BHT của 2 phân đoạn này không cao, phân đoạn có chỉ số BHT cao hơn là phân đoạn 50% (60%), cao hơn 3.1692 mg/ml BHT so với phân đoạn 50% (50%), với trị số P < 0.05. Dựa vào các kết quả phân tích trên nhận thấy phân đoạn 20% (40%), 30% (40%), 20% (50%), 30% (50%), 20% (60%), 30% (60%), 40% (60%) có hoạt tính cao nên đi so sánh hoạt tính của các phân đoạn này qua hình sau. Hình 3.8. Đồ thị so sánh khả hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn tốt nhất trong phân đoạn lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). 52 Dựa vào 2 đồ thị hình 3.8a và 3.8b có thể nhìn thấy rõ là các phân đoạn chia làm 2 nhóm khác nhau, nhóm có hoạt tính cao là nhóm có các phân đoạn 20% (40%), 20% ( 50%), 20% (60%) nhóm còn lại là các phân đoạn 30% (40%), 30% (50%), 30% (60%), 40% (60%), cụ thể hơn dựa vào kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3b). Đồ thị hình 3.8a, dựa vào kết quả phân tích số liệu (phục lục 2b), lấy khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 20% (40%) làm chuẩn để so sánh khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn còn lại thì được kết quả như sau: phân đoạn 20% (50%), 20% (60%) khử được nhiều gốc tự do hơn phân đoạn 20% (40%) lần lượt là 1.8833 và 1.7867 mM DPPH với trị số P 0.05. Đồ thị hình 3.8b, dựa vào kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3b), chọn chỉ số BHT của phân đoạn 20% (40%) làm chuẩn để so sánh chỉ số BHT của các phân đoạn còn lại thì được kết quả như sau: BHT của phân đoạn 20% (50%) và 20% (60%) cao hơn BHT của phân đoạn 20% (40%) lần lược là 10.088 và 24.764mg/ml; BHT của các phân đoạn 30% (40%), 30%(50%), 30%(60%), 40%(60%) thấp hơn BHT của phân đoạn 20%(40%) lần lược là 48.045, 44.019, 39.618, 53.093 mg/ml, với trị số P 0.05. Các phân đoạn protein lần 2 điều có quy luật chung là hàm lượng protein giảm dần khi tiếp tục phân đoạn ví dụ như 20% (50%) có hàm lượng protein là 6.66 mg/ml nhưng khi đi phân đoạn lên 30% (50%) thì hạm lượng protein còn 5.50 mg/ml, phân đoạn 40% (50%) có hàm lượng protein là 0.52 mg/ml, phân đoạn 50% (50%) chỉ còn 0.04 mg/ml lý dó như đã giải thích ở trên là các protein ở phân đoạn 50% là các protein có tính tan trung bình khi đi kết tủa phân đoạn lần 1 tính tan của các protein này bị giảm xuống, một số khó tan dẫn đến khi đi phân đoạn lần 2 bằng nồng độ muối 20% nhưng kết tủa một số lượng lớn protein đồng thời trong bản thân phân đoạn lần 1 vẫn còn dư một lượng muối chưa kết tủa hết làm tăng nồng độ muối kết tủa nên làm cho lượng protein giảm dần mặt dù chưa tới đúng nồng độ kết tủa ban đầu là 50%, các phân đoạn protein khác cũng tương tự 54 . Hình 3.10. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữ khả năng khử gốc tụ do DPPH với hàm lượng protein Kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3b) cho thấy giá trị kiểm định t = 3.8068 và trị số P = 0.0007723, như vậy ta có bằng chứng để chứng minh rằng protein có liên quan đến khả năng khử gốc tự do DPPH. Hình 3.11. Đồ thị thể hiên mối tương quan giữa protein và tổng năng lực khử của các phân đoạn protein lần 2 55 Kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3b) cho thấy giá trị kiểm định t = 8.658 và trị số P = 3.894e-09, như vậy ta có bằng chứng để chứng minh rằng protein có liên quan đến tổng năng lực khử. Chọn ra được phân đoạn protein có hoạt tính cao để đi tinh chế là phân đoạn 20% (40%), 20%(50%), 20%(60%). 3.3. Ảnh hưởng của phương pháp tinh chế đến hoạt tính sinh học của các phân đoạn protein từ dịch chiết hải miên. Từ kết quả nguyên cứu 1 và nguyên cứu 2 ta chọn được các phân đoạn tốt nhất sau để đem đi tinh chế là các phân đoạn lần 1 là 40%, 50%, 60% và các phân đoạn lần 2 là 20% (40%), 20%(50%), 20%(60%) đồng thời ta cũng tiến hành phân đoạn protein bằng AS nồng độ tổng 80% sau đó cũng đem đi tinh chế. Kết quả đạt được biểu diển qua các hình sau: Hình 3.12. Đồ thị tổng năng lực khử của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Dựa vào đồ thị hình 3.13 và kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3c) ta thấy rằng phân đoạn tổng 80% có chỉ số BHT cao nhất, nhưng ta không xét tới phân đoạn này, ta tập trung so sánh giữa phân đoạn lần 1 và phân đoạn lần 2. Ta thấy rằng phân đoạn lần thứ 2 chỉ số BHT cao hon phân đoạn lần 1. Cụ thể, ta đi so sánh giữa phân đoạn 56 60% với phân đoạn 20% (60%) ta nhân thấy rằng phân đoạn 20% (60%) có chỉ số BHT cao hơn phân đoạn 60% cụ thể là cao hơn 2.02 mg/ml BHT với trị số P < 0.05, tiếp theo ta đi so sánh giữa phân đoạn 50% và 20% (50%) ta thấy chỉ số BHT của 20% (50%) cao hơn của phân đoạn 50%, cụ thể là cao hơn 3.22 mg/ml BHT, khi đi so sánh chỉ số BHT của phân đoạn 40% với phân đoạn 20% (40%) thì ta thấy phân đoạn 20% (40%) có chỉ số BHT cao hơn phân đoạn 40% là 0.67 mg/ml BHT tuy nhiên sự khác nhau đó không có ý nghĩa thống kê P > 0.05. Xét chung tất cả các phân đoạn (không tính phân đoạn tổng 80%) thì ta thấy phân đoạn 20% (60%) có chỉ số BHT là cao nhất,tiếp theo là phân đoạn 20% (50%), 60%, 50% cuối cùng là phân đoạn 40% và 20% (40%) Hình 3.13. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Cũng giống như phương pháp tổng năng lực khử thì phân đoạn tổng 80% có hoạt tính cao nhất, nhưng ta không xét đến nó, ta đi so sánh phân đoạn 60% và phân đoạn 20% (60%), phân đoạn 50% và phân đoạn 20% (50%), phân đoạn 40% và phân 57 đoạn 20% (40%). Dựa vào đồ thị 3.14 và kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3c), ta có phân đoạn 20% (60%) khử được nhiều gốc tự do DPPH hơn phân đoạn 60%, cụ thể là nhiều hơn 1.6117 mM DPPH; phân đoạn 20% (50%) khử được nhiều hơn phân đoạn 50% là 1,1067 mm DPPH và phân đoạn 20% (40%) khử được nhiều hơn phân đoạn 40% là 0.20833 mM DPPH. Xét chung cho tất cả các phân đoạn thì phân đoạn 20% (60%) có khả năng khử DPPH là cao nhất, tiếp theo là phân đoạn 20% (50%), 50%, 20% (40%), 60% cuối cùng là phân đoạn 40%. Hình 3.14. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn sau khi tinh chế. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (P < 0.05). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích số liệu, ta thấy hàm lượng protein của phân đoạn tổng 80% là 3.0892 mg/ml, sau đó đến các phân đoạn 60% là 1.0618 mg/ml, 50% là 1.7365 mg/ml, 40% là 1.4049 mg/ml, 20%(50%) là 1.2475 mg/ml, 20%(60%) là 1.0618 mg/ml, 20%(40%) là .0.9267 mg/ml. Dựa vào phân tích ở trên thì những phân đoạn có hàm lượng protein thấp lại có hoạt tính cao hơn những phân đoạn có hàm lượng protein cao lại có hoạt tính thấp (trừ phân đoạn tổng 80% và phân đoạn 20%(40%)) nguyên nhân là do trong quá trình tinh chế thì những tạp chất đã bị loại bỏ đồng thời protein trong các phân đoạn cũng bị 58 biến tính đáng kể dẫn đến hàm lượng protein bị giảm sau khi tinh chế, các protein trong phân đoạn lần 2 bị biến tính nhiều hơn do trải qua hai lần phân đoạn các liên kết protein yếu dần, tính tan thay đổi dẫn đến protein bị mất nhiều hơn trong quá trình tinh chế nhưng protein ta thu được tinh sạch hơn, đồng thời tuy hàm lượng protein thấp nhưng hoạt tính sinh học vẫn cao do đó có nghĩa là không chỉ hàm lượng protein quyết định hoạt tính chống oxy hóa mà còn do loại protein quyết định, điều đó có nghĩa là phân đoạn 20% (60%) và 20%( 50%) đang chứa các prottein có hoạt tính cao. Phân đoạn 50%, 60% có hàm lượng protein cao nhưng hoạt tính không bằng các phân đoạn 20% (50%) và 20% (60%) do nó chứa nhiều loại protein khác nhau nhưng mà hàm lượng protein có chứa hoạt tính lại không nhiều do đó hoạt tính không cao bằng. Dựa vào đồ thị hình 3.13, 3.14, 3.15, có thể thấy rằng hoạt tính sinh học và hàm lượng protein của phân đoạn protein tổng 80% là cao nhất. Cụ thể khả năng khử gốc tư do DPPH của phân đoạn protein tổng 80% cao hơn 2 phân đoạn 20% (60%) và 20% (50%) lần lượt là 0.42 và 2.032 mM DPPH; chỉ số BHT của phân đoạn tổng 80% cao hơn phân đoạn 20%(60%) và 20%(50%) lần lượt là 2.6325 và 6.3758; phân đoạn tổng 80% có hàm lượng protein là 3.0892 mg/ml nhiều hơn 2 phân đoạn 60% và 50% lần lượt là 1.3527 và 0.7593 mg/ml. Nguyên nhân là do khi đi phân đoạn protein, phân đoạn này dược phân đoạn bằng cách cho tổng nồng độ AS từ 20% tới 80% nên phân đoạn tổng 80% bao gồm tổng tất cả các phân đoạn protein trong phân đoạn lần 1 do đó hàm lượng protein và hoạt tính cao, tuy nhiên phân đoạn này không được lựa chọn là do vì nó bao gồm tất cả các protein của các phân đoạn nên khi ta di tinh chế rất khó khăn để tinh chế loại protein thích hợp và khó xác định loại protein có hoạt tính cao sau này. Có thể thấy: - Phân đoạn 20% (60%) và 20% (50%) là 2 phân đoạn có hoạt tính cao nhất - Các protein có hoạt tính cao nằm ở phân doạn 20% (50%) và 20% (60%) và có tính tan trung bình. - Sau khi phân đoạn protein lần 1 nên tiếp tục đi phân đoạn protein 20% của lần 1 sau đó mới đi tinh chế thì cho kết quả tốt hơn. 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua 3 tháng thực hiện đồ án em đã rút ra được các kết luận sau: - Đã thực hiện thành công tách phân đoạn các protein có hoạt tính chống oxy hóa trong dịch chiết hải miên bằng AS. - Chứng minh được protein trong dịch chiết hải miên có hoạt tính sinh học chống oxy hóa. - Xác định được phân đoạn protein 20%(50) và phân đoạn protein 20%(60%) có hoạt tính sinh hoc chống oxy hóa cao nhất khi tinh chế. - Xác định được các loại protein có hoạt tính sinh học cao kết tủa ở nồng độ muối AS bão hòa 50%, 60% ở phân đoạn protein ần 1 và nồng độ muối bão hòa 20% ở phân đoạn protein lần 2. 2. Kiến nghị. Mặc dù đã cố gắng trong quá trình làm đề tài, song do thời gian và điều kiện nghiên cứu có giới hạn nên đề tài vẫn còn nhiều hạn chế và thiếu sót. Do vậy em xin đề xuất một số ý kiến sau: - Phạm vi đề tài chỉ mới là bước đầu tinh chế nên cần tiếp tục nghiên cứu tìm ra các phương pháp tinh chế tiếp theo, tốt hơn để thu được protein tinh sạch phục vụ cho các nghiên cứu sau. - Cần tiếp tục nghiên cứu xác định thành phần protein trong các phân đoạn để đi tinh chế ra loại protein có hoạt tính cao, ứng dụng vào các lĩnh vực phục vụ cho cuộc sống. - Cần nâng cấp hệ thống trang thiết bị trong phòng thí nghiệm để các nghiên cứu sau được thuận lợi và nhanh chóng hơn. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Thị Quỳnh Nga (2014), Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết xuất đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ rễ cây mật nhân, Đồ án tốt nghiệp đại học, trường Đại học Nha Trang, Khánh Hòa. 2. Phan Thị Kim Ngân (2012), Nghiên cứu tách chiết và tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ tim sen, Đồ án tốt nghiệp đại học, trường Đại học Nha Trang, Khánh Hòa. 3. Nguyễn Thị Mỹ Nương (2012), Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ vỏ quả thanh long, Đồ án tốt nghiệp đại học, trường Đại học Nha Trang, Khánh Hòa. Tài liệu tiếng Anh 4. Antcliffe, J. B. (2013). Stouge, Svend, ed, Questioning the evidence of organic compounds called sponge biomarkers, Palaeontology 5. Bergquist, P.R, (1998), Porifera, In Anderson, D.T., Invertebrate Zoology. Oxford University Press, USA. pp. 10–27. 6. Borchiellini, C., Manuel, M., Alivon, E., Boury-Esnault, N., Vacelet J., and Le Parco, Y. (2001). Sponge paraphyly and the origin of Metazoa, Journal of Evolutionary Biology 14 (1): 171–179. 7. Butterfield, N.J and C. J. Nicholas (1996), Burgess Shale-type preservation of both non-mineralizing and "shelly" Cambrian organisms from the Mackenzie Mountains, northwestern Canada, Journal of Paleontology 70 (6): 893–899. 8. Cavalcanti, F.F., Klautau, M. (2011), Solenoid: a new aquiferous system to Porifera, Zoomorphology 130: 255–260 9. Duffy, J.E. (1996), Species boundaries, specialization, and the radiation of sponge-dwelling alpheid shrimp, Biological Journal of the Linnean Society 58 (3): 307–324 10. Etchells, L, Sardarian A., Whitehead R. C, (2005), A synthetic approach to the 61 plakoridines modeled on a biogenetic theory, Tetrahedron Letters 46 (16): 2803–2807 11. Exposito, J-Y., Cluzel, C., Garrone, R., and Lethias, C. (2002), Evolution of collagens, The Anatomical Record Part A: Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology 268 (3): 302–316. 12. Gage, J. D., and Tyler, P. A. (1996), Deep-sea Biology: A Natural History of Organisms at the Deep-Sea Floor, Cambridge University Press, pp, 91–93. 13. Gazave, E.; Lapébie, P.; Ereskovsky, A.; Vacelet, J.; Renard, E.; Cárdenas, P.; Borchiellini, C., (2012), No longer Demospongiae: Homoscleromorpha formal nomination as a fourth class of Porifer, Hydrobiologia 687: 3–10 14. Hartman, W. D., and Goreau, T. F. (1970), Jamaican coralline sponges: Their morphology, ecology and fossil relatives, Symposium of the Zoological Society of London25: 205–243. 15. Hinde, R. T., (1998), The Cnidaria and Ctenophora, In Anderson, D.T, Invertebrate Zoology, Oxford University Press, pp. 28–57 16. McClenachan, L. (2008), Social conflict, Over-fishing and Disease in the Florida Sponge Fishery, 1849–1939, In Starkey, D. J. Holm, P., and Barnard, M. Oceans Past: Management Insights from the History of Marine Animal Populations, Earthscan, Pp, 25–27. 17. Vacelet, J., and Boury-Esnault, N., (1995), Carnivorous sponge, Nature 373(6512) 333–335 18. Weaver, James C.; Aizenberg, Joanna; Fantner, Georg E.; Kisailus, David; Woesz, Alexander; Allen, Peter; Fields, Kirk; Porter, Michael J.; Zok, Frank W.; Hansma, Paul K.; Fratzl, Peter; Morse, Daniel E. (2007), Hierarchical assembly of the siliceous skeletal lattice of the hexactinellid sponge Euplectella aspergillum, Journal of Structural Biology158 (1): 93–106. 62 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 1.1 Xác định hoạt tính khử gốc tự do DPPH Nguyên tắc: các chất nguyên cứu có tác dụng chống oxy hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dd DPPH. Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thụ ở bước sóng có hấp thụ cực tím tại bước sóng 517 nm. Mô tả: Dùng 0,2 - 0,5 ml mẫu cần đo cho vào 1,5-1,8 ml nước cất tiếp theo cho vào 1 ml cồn. Cuối cùng thêm 1ml dd DPPH (nồng độ 0.1 nM pha trong ethanol). Hỗn hợp được lắc đều và để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trong bóng tối. Mỗi lần đo 3 mẫu lấy giá trị trung bình. Mẫu trắng được tiến hành trong cùng 1 điều kiện nhưng không sử dụng mẫu thay vào đó là nước cất. Sau đó đem các mẫu đo ở máy UV-Vis ở bước sóng 517 nm. Tính kết quả. Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH của dung dịch bằng phương pháp dựa vào đường chuẩn. Xây dựng đường chuẩn: Pha 50 ml DPPH 0,1 nm bằng cách cân 0,00917 g DPPH pha vào 50 mlEthanol • 1,0 • 0,8ml DPPH + 2,2 ml nước cất + 1ml etanol. • 0,6ml DPPH + 2,4 ml nước cất + 1ml etanol. • 0,4ml DPPH + 2,6 ml nước cất + 1ml etanol. • 0,2ml DPPH + 2,8 ml nước cất + 1ml etanol. ml DPPH+2,0 ml nước cất + 1ml etanol. Hốn hợp được đo ở bước sóng 517 nM bằng máy đo quang phổ UVis ta được kêt quả : 63 Nồng độ DPPH (mM) 1.2 Xác định tổng năng lực khử Mô tả: Cho vào ống nghiệm 0,2-0,5 ml mẫu cần đo tiếp đó cho 0,5 ml K3Fe(CN)6 1% bổ sung tiếp 0,5- 0,8 ml dung dịch đệm (pH = 6,6) cho đủ 1,5 ml. Hỗn hợp được đem ủ ở 500C trong 20 phút. Sau đó ta bổ sung vào ống nghiệm 0,5ml CCl3COOH 10%. Tiếp tục bổ sung từ từ 2 ml nước cất và 0,4ml FeCl3 0,1%. Tương tự đo khử gốc tự do DPPH ta tiến hành làm mẫu đối chứng nhưng không cho mẫu đo mà thay bằng dung dịch đệm. Khả năng khử của hỗn hợp được đo ở bước sóng 700nm sử dụng máy đo quang phổ UVis. Kết quả được quy đổi theo số mgBHT/ml 64 Phụ lục 2: Phương pháp xác định hàm lượng protein Phương pháp lowry Cho 0,3 ml mẫu vào ống nghiệm tiếp tục bổ sung 0,3ml NaOH 2N đem thủy phân ở 1000C trong 10 phút. Sau đó làm nguội đến nhiệt độ phòng và bổ sung 3ml dung dịch lowry ( tủa đen ). Để 10 phút ở nhiệt độ phòng ( trong tối). Sau đó bổ sung 0,3ml thuốc thử folin 1N trộn đều ủ 30 phút trong bóng tối. Xây dựng đường chuẩn protein: Hốn hợp được đo ở bước sóng 750 nM bằng máy đo quang phổ Uvis 65 Phụ lục 3: Kết quả sử lý số liệu. a) Phân đoạn lần 1 Bảng PL 3.1. Số liệu đo DPPH 66 - Xử lý bằng phần mềm R > phandoanI nongdo id DPPH data data > attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: DPPH, id, nongdo, phandoanI > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: DPPH Df Sum Sq Mean Sq F value phandoanI 7 223.075 nongdo 3 Residuals 85 22.588 5.595 31.868 7.529 0.066 Pr(>F) 484.18 < 2.2e-16 *** 114.40 < 2.2e-16 *** 67 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = DPPH ~ phandoanI + nongdo) Residuals: Min 1Q -0.8696 -0.1156 Median 0.0044 3Q 0.1080 Max 0.7907 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 4.25760 0.08684 49.027 < 2e-16 *** phandoanI2 0.20575 0.10474 1.964 0.0527 . phandoanI3 0.77167 0.10474 7.368 1.04e-10 *** phandoanI4 1.64825 0.10474 15.737 < 2e-16 *** phandoanI5 2.43758 0.10474 23.274 < 2e-16 *** phandoanI6 2.01375 0.10474 19.227 < 2e-16 *** phandoanI7 -1.98050 0.10474 -18.909 < 2e-16 *** phandoanI8 -1.66867 0.10474 -15.932 < 2e-16 *** nongdo2 0.50404 0.07406 6.806 1.33e-09 *** nongdo3 0.87983 0.07406 11.880 < 2e-16 *** nongdo4 1.31871 0.07406 17.806 < 2e-16 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 0.2565 on 85 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.9777, Adjusted R-squared: 0.9751 68 F-statistic: 373.2 on 10 and 85 DF, p-value: < 2.2e-16 > anova(twoway F) 31.868 1978.038 < 2.2e-16 *** 22.588 7.529 phandoanI:nongdo 21 4.563 0.217 Residuals 1.031 0.016 64 F value 467.345 < 2.2e-16 *** 13.488 3.515e-16 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = DPPH ~ phandoanI + nongdo + phandoanI) $phandoanI diff lwr upr p adj 2-1 0.2057500 -0.11974107 0.53124107 0.5116095 3-1 0.7716667 0.44617559 1.09715774 0.0000000 4-1 1.6482500 1.32275893 1.97374107 0.0000000 5-1 2.4375833 2.11209226 2.76307441 0.0000000 6-1 2.0137500 1.68825893 2.33924107 0.0000000 7-1 -1.9805000 -2.30599107 -1.65500893 0.0000000 8-1 -1.6686667 -1.99415774 -1.34317559 0.0000000 3-2 0.5659167 0.24042559 0.89140774 0.0000159 4-2 1.4425000 1.11700893 1.76799107 0.0000000 69 5-2 2.2318333 1.90634226 2.55732441 0.0000000 6-2 1.8080000 1.48250893 2.13349107 0.0000000 7-2 -2.1862500 -2.51174107 -1.86075893 0.0000000 8-2 -1.8744167 -2.19990774 -1.54892559 0.0000000 4-3 0.8765833 0.55109226 1.20207441 0.0000000 5-3 1.6659167 1.34042559 1.99140774 0.0000000 6-3 1.2420833 0.91659226 1.56757441 0.0000000 7-3 -2.7521667 -3.07765774 -2.42667559 0.0000000 8-3 -2.4403333 -2.76582441 -2.11484226 0.0000000 5-4 0.7893333 0.46384226 1.11482441 0.0000000 6-4 0.3655000 0.04000893 0.69099107 0.0167993 7-4 -3.6287500 -3.95424107 -3.30325893 0.0000000 8-4 -3.3169167 -3.64240774 -2.99142559 0.0000000 6-5 -0.4238333 -0.74932441 -0.09834226 0.0027704 7-5 -4.4180833 -4.74357441 -4.09259226 0.0000000 8-5 -4.1062500 -4.43174107 -3.78075893 0.0000000 7-6 -3.9942500 -4.31974107 -3.66875893 0.0000000 8-6 -3.6824167 -4.00790774 -3.35692559 0.0000000 8-7 0.3118333 -0.01365774 0.63732441 0.0703167 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 0.5040417 0.3099619 0.6981214 0.00e+00 3-1 0.8798333 0.6857536 1.0739131 0.00e+00 4-1 1.3187083 1.1246286 1.5127881 0.00e+00 3-2 0.3757917 0.1817119 0.5698714 1.33e-05 4-2 0.8146667 0.6205869 1.0087464 0.00e+00 4-3 0.4388750 0.2447952 0.6329548 4.00e-07 70 Bảng PL 3.2. Số liệu đo tổng năng lực khử 71 Bảng PL3.3. Số liệu protein - Xử lý bằng phần mềm R group group protein data datta Error: object 'datta' not found > data > attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: group, protein > analysis anova(analysis) 72 Analysis of Variance Table Response: protein Df Sum Sq Mean Sq F value group 7 7270.9 1038.70 Residuals 16 3.4 Pr(>F) 4870.9 < 2.2e-16 *** 0.21 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > pairwise.t.test(protein,group,p.adj="bonferroni") Pairwise comparisons using t tests with pooled SD data: protein and group 1 2 2 7.0e-10 - 3 4 - 3 2.6e-15 2.8e-11 - 5 - 4 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 - - - - - 6 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 6.2e-12 8.5e-07 - 7 - - 5 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 1.8e-14 7 1.0000 6 - - - - - 3.9e-10 1.9e-15 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 - 8 7.7e-12 0.0013 3.8e-09 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 4.9e-12 P value adjustment method: bonferroni 73 b) Phân đoạn lần 2 Bảng PL3.4. Bảng số liệu DPPH 74 - Xử lý bằng phần mềm R > pd2a nongdo id score data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: id, nongdo, pd2a, score > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table 75 Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) pd2a 2 26.9939 13.4969 285.620 < 2.2e-16 *** nongdo 3 10.9662 Residuals 30 1.4176 3.6554 77.355 3.215e-14 *** 0.0473 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2a + nongdo) Residuals: Min 1Q -0.39333 -0.16528 Median 0.02722 3Q 0.16556 Max 0.39333 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 13.67000 0.08875 154.036 < 2e-16 *** pd2a2 1.88333 0.08875 21.222 < 2e-16 *** pd2a3 1.78667 0.08875 20.132 < 2e-16 *** nongdo2 0.72444 0.10247 7.069 7.35e-08 *** nongdo3 1.07000 0.10247 10.442 1.66e-11 *** nongdo4 1.50889 0.10247 14.724 2.87e-15 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 0.2174 on 30 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.964, Adjusted R-squared: 0.958 76 F-statistic: 160.7 on 5 and 30 DF, p-value: < 2.2e-16 > res res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2a + nongdo + pd2a) $pd2a diff lwr upr p adj 2-1 1.88333333 1.6645511 2.1021156 0.0000000 3-1 1.78666667 1.5678844 2.0054489 0.0000000 3-2 -0.09666667 -0.3154489 0.1221156 0.5279807 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 0.7244444 0.44580445 1.0030844 0.0000004 3-1 1.0700000 0.79136001 1.3486400 0.0000000 4-1 1.5088889 1.23024889 1.7875289 0.0000000 3-2 0.3455556 0.06691556 0.6241956 0.0105552 4-2 0.7844444 0.50580445 1.0630844 0.0000001 4-3 0.4388889 0.16024889 0.7175289 0.0009548 > > pd2d nongdo id score data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: id, nongdo, pd2d, score The following objects are masked from data (pos = 3): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 4): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 5): id, nongdo, score > twoway twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table 78 Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) pd2d 1 0.55510 0.55510 693.31 < 2.2e-16 *** nongdo 3 0.26658 0.08886 110.98 3.189e-12 *** Residuals 19 0.01521 0.00080 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2d + nongdo) Residuals: Min 1Q -0.04042 -0.02125 Median 0.00000 3Q 0.01667 Max 0.04708 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 1.00292 0.01292 77.654 < 2e-16 *** pd2d2 0.30417 0.01155 26.331 < 2e-16 *** nongdo2 0.07333 0.01634 4.489 0.000251 *** nongdo3 0.22000 0.01634 13.467 3.61e-11 *** nongdo4 0.25833 0.01634 15.813 2.17e-12 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 0.0283 on 19 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.9818, F-statistic: 256.6 on 4 and 19 DF, Adjusted R-squared: p-value: 3.017e-16 0.978 79 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2d + nongdo + pd2d) $pd2d diff lwr upr p adj 2-1 0.3041667 0.2799886 0.3283448 0 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 0.07333333 0.027397204 0.11926946 0.0013186 3-1 0.22000000 0.174063870 0.26593613 0.0000000 4-1 0.25833333 0.212397204 0.30426946 0.0000000 3-2 0.14666667 0.100730537 0.19260280 0.0000002 4-2 0.18500000 0.139063870 0.23093613 0.0000000 4-3 0.03833333 -0.007602796 0.08426946 0.1225259 > > pd2b nongdo id score data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: id, nongdo, pd2b, score The following objects are masked from data (pos = 3): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 4): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 5): id, nongdo, pd2b, score The following objects are masked from data (pos = 6): id, nongdo, score > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value pd2b Pr(>F) 2 4.6993 2.34965 172.595 < 2.2e-16 *** 81 nongdo 3 1.2218 0.40727 29.916 3.764e-09 *** Residuals 30 0.4084 0.01361 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2b + nongdo) Residuals: Min 1Q -0.20239 -0.08262 Median 0.01701 3Q 0.05657 Max 0.22045 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 3.15039 0.04763 66.138 < 2e-16 *** pd2b2 0.76956 0.04763 16.156 2.40e-16 *** pd2b3 0.76326 0.04763 16.024 2.99e-16 *** nongdo2 0.16460 0.05500 2.993 nongdo3 0.35237 0.05500 6.406 4.50e-07 *** nongdo4 0.48556 0.05500 8.828 7.67e-10 *** 0.00549 ** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 0.1167 on 30 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.9355, F-statistic: 86.99 on 5 and 30 DF, Adjusted R-squared: p-value: < 2.2e-16 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2b + nongdo + pd2b) $pd2b diff lwr upr p adj 2-1 0.7695583 0.6521291 0.8869876 0.0000000 3-1 0.7632583 0.6458291 0.8806876 0.0000000 3-2 -0.0063000 -0.1237292 0.1111292 0.9904055 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 0.1646000 0.01504271 0.3141573 0.0266749 3-1 0.3523667 0.20280938 0.5019240 0.0000026 4-1 0.4855556 0.33599827 0.6351128 0.0000000 3-2 0.1877667 0.03820938 0.3373240 0.0095017 4-2 0.3209556 0.17139827 0.4705128 0.0000127 4-3 0.1331889 -0.01636840 0.2827462 0.0945359 > > pd2c nongdo id twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) pd2c 2 45.242 22.6209 2724.501 < 2.2e-16 *** nongdo 3 Residuals 30 0.749 0.249 0.2495 30.052 3.58e-09 *** 0.0083 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2c + nongdo) Residuals: Min 1Q -0.187500 -0.061181 Median 0.000278 3Q 0.073125 Max 0.146944 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 1.05500 0.03720 28.361 < 2e-16 *** pd2c2 -0.10750 0.03720 -2.890 0.00710 ** pd2c3 2.32250 0.03720 62.434 < 2e-16 *** nongdo2 0.12889 0.04295 3.001 0.00538 ** nongdo3 0.28556 0.04295 6.648 2.32e-07 *** nongdo4 0.37556 0.04295 8.743 9.47e-10 *** 85 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 0.09112 on 30 degrees of freedom Multiple R-squared: F-statistic: 0.9946, 1108 on 5 and 30 DF, Adjusted R-squared: p-value: < 2.2e-16 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2c + nongdo + pd2c) $pd2c diff lwr upr p adj 2-1 -0.1075 -0.1992066 -0.01579336 0.0188897 3-1 2.3225 2.2307934 2.41420664 0.0000000 3-2 2.4300 2.3382934 2.52170664 0.0000000 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 0.1288889 0.01209177 0.2456860 0.0261742 3-1 0.2855556 0.16875844 0.4023527 0.0000013 4-1 0.3755556 0.25875844 0.4923527 0.0000000 3-2 0.1566667 0.03986955 0.2734638 0.0052191 4-2 0.2466667 0.12986955 0.3634638 0.0000164 4-3 0.0900000 -0.02679712 0.2067971 0.1777508 0.9937 86 Bảng PL3.5. Tổng năng lực khử. 87 - Xử lý số liệu bằng phần mềm R > pd2a nongdo id score data data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: id, nongdo, pd2a, score > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value pd2a 2 nongdo 3 23615.7 Residuals 30 3721.7 912.0 1860.8 Pr(>F) 61.209 2.578e-11 *** 7871.9 258.934 < 2.2e-16 *** 30.4 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway)\ Error: unexpected input in "summary(twoway)\" 88 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2a + nongdo) Residuals: Min 1Q Median -8.3125 -3.4565 -0.7063 3Q Max 4.0308 10.6392 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 41.772 2.251 18.558 < 2e-16 *** pd2a2 10.088 2.251 4.482 1e-04 *** pd2a3 24.764 2.251 11.002 4.73e-12 *** nongdo2 24.443 2.599 9.404 1.88e-10 *** nongdo3 46.612 2.599 17.933 < 2e-16 *** nongdo4 68.951 2.599 26.528 < 2e-16 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 5.514 on 30 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.9677, F-statistic: 179.8 on 5 and 30 DF, Adjusted R-squared: p-value: < 2.2e-16 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level 0.9623 89 Fit: aov(formula = score ~ pd2a + nongdo + pd2a) $pd2a diff 2-1 10.08833 lwr upr p adj 4.539082 15.63758 0.0002878 3-1 24.76417 19.214916 30.31342 0.0000000 3-2 14.67583 9.126582 20.22508 0.0000010 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 24.44333 17.37584 31.51083 0 3-1 46.61222 39.54472 53.67972 0 4-1 68.95111 61.88361 76.01861 0 3-2 22.16889 15.10139 29.23639 0 4-2 44.50778 37.44028 51.57528 0 4-3 22.33889 15.27139 29.40639 0 > > pd2b nongdo id score data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: 90 id, nongdo, pd2b, score The following objects are masked from data (pos = 3): id, nongdo, score > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value 426.4 pd2b 2 nongdo 3 4100.6 1366.85 1065.41 < 2.2e-16 *** Residuals 30 38.5 213.21 Pr(>F) 166.19 < 2.2e-16 *** 1.28 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2b + nongdo) Residuals: Min 1Q -2.1767 -0.4454 Median 0.1092 0.3004 3Q Max 2.3575 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 14.4033 0.4624 31.148 < 2e-16 *** 91 pd2b2 4.0258 0.4624 8.706 1.04e-09 *** pd2b3 8.4275 0.4624 18.225 < 2e-16 *** nongdo2 9.1633 0.5339 17.162 < 2e-16 *** nongdo3 19.9567 0.5339 37.376 < 2e-16 *** nongdo4 28.1833 0.5339 52.783 < 2e-16 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 1.133 on 30 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.9916, Adjusted R-squared: F-statistic: 705.7 on 5 and 30 DF, p-value: < 2.2e-16 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2b + nongdo + pd2b) $pd2b diff lwr upr p adj 2-1 4.025833 2.885867 5.165800 0 3-1 8.427500 7.287533 9.567467 0 3-2 4.401667 3.261700 5.541633 0 $nongdo diff 2-1 9.163333 lwr upr p adj 7.711477 10.615189 3-1 19.956667 18.504811 21.408523 0 0 0.9902 92 4-1 28.183333 26.731477 29.635189 0 3-2 10.793333 9.341477 12.245189 0 4-2 19.020000 17.568144 20.471856 0 4-3 8.226667 6.774811 9.678523 0 > > pd2c nongdo id score data data data > attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: id, nongdo, pd2c, score The following objects are masked from data (pos = 3): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 4): id, nongdo, score > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value pd2c 2 1372.22 nongdo 3 Residuals 30 844.02 197.36 Pr(>F) 686.11 104.294 3.105e-14 *** 281.34 42.766 5.934e-11 *** 6.58 --Signif. codes: > 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2c + nongdo) Residuals: Min 1Q -4.6906 -1.8567 Median 0.1153 3Q 1.8578 Max 5.0650 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 4.140 1.047 3.953 0.000434 *** pd2c2 0.190 1.047 0.181 0.857233 pd2c3 13.191 1.047 12.597 1.64e-13 *** nongdo2 3.808 1.209 3.149 0.003690 ** nongdo3 8.872 1.209 7.338 3.58e-08 *** nongdo4 12.724 1.209 10.524 1.37e-11 *** --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 94 Residual standard error: 2.565 on 30 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.9182, Adjusted R-squared: F-statistic: 67.38 on 5 and 30 DF, p-value: 2.135e-15 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2c + nongdo + pd2c) $pd2c diff 2-1 lwr 0.19000 -2.39141 upr p adj 2.77141 0.9820235 3-1 13.19083 10.60942 15.77224 0.0000000 3-2 13.00083 10.41942 15.58224 0.0000000 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 3.807778 0.5201064 7.095449 0.0183203 3-1 8.872222 5.5845508 12.159894 0.0000002 4-1 12.724444 9.4367731 16.012116 0.0000000 3-2 5.064444 1.7767731 4-2 8.916667 5.6289953 12.204338 0.0000002 4-3 3.852222 0.5645508 > > pd2d nongdo id score data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: id, nongdo, pd2d, score The following objects are masked from data (pos = 3): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 4): id, nongdo, score The following objects are masked from data (pos = 5): id, nongdo, score > twoway anova(twoway) Analysis of Variance Table Response: score Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F) 96 pd2d 1 60.262 60.262 39.921 4.598e-06 *** nongdo 3 179.682 59.894 39.677 2.225e-08 *** Residuals 19 28.681 1.510 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > summary(twoway) Call: lm(formula = score ~ pd2d + nongdo) Residuals: Min 1Q Median -1.53958 -0.90479 -0.01375 3Q 1.05458 Max 1.49042 Coefficients: Estimate Std. Error t value Pr(>|t|) (Intercept) 3.7504 0.5608 6.688 2.15e-06 *** pd2d2 3.1692 0.5016 6.318 4.60e-06 *** nongdo2 0.5867 0.7093 0.827 nongdo3 3.7417 0.7093 5.275 4.32e-05 *** nongdo4 6.8400 0.7093 9.643 9.43e-09 *** 0.418 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 Residual standard error: 1.229 on 19 degrees of freedom Multiple R-squared: 0.8932, F-statistic: 39.74 on 4 and 19 DF, Adjusted R-squared: p-value: 5.589e-09 > res TukeyHSD(res) Tukey multiple comparisons of means 95% family-wise confidence level Fit: aov(formula = score ~ pd2d + nongdo + pd2d) $pd2d diff lwr upr p adj 2-1 3.169167 2.119337 4.218997 4.6e-06 $nongdo diff lwr upr p adj 2-1 0.5866667 -1.407913 2.581246 0.8409807 3-1 3.7416667 1.747087 5.736246 0.0002333 4-1 6.8400000 4.845421 8.834579 0.0000001 3-2 3.1550000 1.160421 5.149579 0.0014449 4-2 6.2533333 4.258754 8.247913 0.0000002 4-3 3.0983333 1.103754 5.092913 0.0017258 98 Bảng PL3.6. Bảng số liệu protein. - xử lý bằng phần mềm R. > group group protein2 > data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: group, protein2 > analysis anova(analysis) Analysis of Variance Table Response: protein2 Df group Sum Sq Mean Sq F value 16 247.812 15.4882 Residuals 34 0.107 Pr(>F) 4936.9 < 2.2e-16 *** 0.0031 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > pairwise.t.test(protein2,group,p.adj="bonferroni") Pairwise comparisons using t tests with pooled SD data: protein2 and group 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 2.0e-08 - - - - 3 < 2e-16 < 2e-16 - 4 < 2e-16 < 2e-16 0.58290 - 5 < 2e-16 < 2e-16 1.00000 0.03483 - 6 9.3e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 - - - - 7 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 1.00000 - - - 8 1.00000 1.5e-07 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 2.5e-16 < 2e-16 - 9 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 5.0e-12 11 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 12 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 13 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 14 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 15 0.00019 0.39698 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 0.00172 < 2e-16 100 16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 17 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 1.00000 1.00000 < 2e-16 < 2e-16 10 11 12 2 - - - - - - - 3 - - - - - - - 4 - - - - - - - 5 - - - - - - - 6 - - - - - - - 7 - - - - - - - 8 - - - - - - - 9 - - - - - - - 10 - - - - - - - 11 < 2e-16 - 13 14 15 16 - - - - - 12 < 2e-16 1.00000 - - - - - 13 < 2e-16 0.00058 0.00013 - - 14 < 2e-16 0.00172 0.00037 1.00000 - - - - 15 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 - - 16 < 2e-16 8.3e-15 3.1e-15 1.6e-09 6.5e-10 < 2e-16 17 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 < 2e-16 P value adjustment method: bonferroni 101 c) số liệu sau tinh chế. Bảng PL3.7. Số liệu đo DPPH 102 Bảng PL3.8. Bảng số liệu tổng khử 103 Bảng PL3.9. Bảng số liệu protein. - Xử lý bằng phần mêm R > group group proteintc proteintc data attach(data) The following objects are masked _by_ .GlobalEnv: group, proteintc > analysis analysis anova(analysis) Analysis of Variance Table Response: proteintc Df group Sum Sq Mean Sq F value 6 10.8782 1.81304 Residuals 14 Pr(>F) 767.62 < 2.2e-16 *** 0.0331 0.00236 --Signif. codes: 0 ‘***’ 0.001 ‘**’ 0.01 ‘*’ 0.05 ‘.’ 0.1 ‘ ’ 1 > pairwise.t.test(proteintc,group,p.adj="bonferroni") Pairwise comparisons using t tests with pooled SD data: proteintc and group 1 2 2 1.9e-07 - 4 - 3 1.4e-05 1.6e-10 4 0.0306 3 5 - 6 - - - - - 2.6e-05 1.2e-07 - - - 105 5 2.7e-11 9.0e-14 1.2e-08 3.2e-12 6 1.3e-05 0.0830 1.9e-09 0.0083 3.7e-13 - 7 7.0e-15 < 2e-16 1.5e-13 2.0e-15 4.1e-10 5.4e-16 P value adjustment method: bonferroni [...]... chn ti "Nghiờn cu tỏch phõn on protein cú hot tớnh chng oxy húa t dch chit hi miờn (Spongia sp. ) theo phng phỏp kt ta bng ammonium sulfate" t ú lm c s cho cỏc nguyờn cu tỏch chit, tinh ch cỏc cht chng oxy húa t Hi Miờn sau ny 2 Mc tiờu ca ti Tỏch phõn on protein cú hot tớnh chng oxy húa t dch chit hi miờn (Spongia sp. ) theo phng phỏp kt ta bng ammonium sulfate (AS) 3 í ngha thc tin v ý ngha khoa... in (pI) ca protein 1.3.2.1 Phng phỏp kt ta protein bng mui Kt ta protein bng mui l phng phỏp c ỏp dng ph bin tỏch phõn on cỏc protein cú hot tớnh sinh hc Kh nng hũa tan ca protein ph thuc vo nhiu yu t nh: c tớnh lý húa t nhiờn ca protein, pH, nhit , nng ca mui nng mui thp, tớnh tan ca protein tng nh (salting in) Tuy nhiờn, nng mui cao, tớnh tan ca protein gim mnh (salting out) Tớnh tan ca protein. .. t bo l cú cu trỳc ng xõm nhp vo c th bo v c th b) Thnh phn chng oxy húa ca protein thy phõn Khụng ch cú peptit v cỏc acid amin thu c t quỏ trỡnh thy phõn protein cú hot tớnh chng oxy húa m bn thõn protein cng cú hot tớnh chng oxy húa Trong phõn t protein ó cha sn nhng on peptite cú hot tớnh sinh hc tuy nhiờn, khi nm trong mch protein (hay polypeptide) cỏc hot tớnh ny tn ti di dng tim n, khụng c th... v cỏc loi thuc dựng trong y hc nhm nõng cao sc khe con ngi, thỳc y nn kinh t nc nh 4 Ni dung - Kho sỏt hot tớnh chng oxy húa ca cỏc phõn on protein kt ta t dch chit hi miờn (Spongia sp. ) bng ammonium sulfate cú nng khỏc nhau - Th nghim tinh ch protein t cỏc phõn on cú hot tớnh chng oxy húa cao 3 CHNG 1: TNG QUAN 1.1 Gii thiu v hi miờn `Hỡnh 1.1 Hi miờn Hi miờn l loi ng vt khụng xng sng cú cu to rt... trỡnh oxy húa, nhng nguyờn t hydro cho cht chng oxy húa s cp, phõn hy hydroperoxide thnh cỏc phõn t khụng phi l gc t do, c ch hot ng ca oxynguyờn t, hp th tia cc tớm hoc kh oxy 1.2.3 Kh nng chng oxy húa ca protein a) Peptide v hp cht polypeptide Polypeptide l hp cht hu c c cu to t cỏc acid amin liờn kt vi nhau bng liờn peptide Khỏc vi protein, polypeptide cú khi lng phõn t di 10.000 Da trong khi protein. .. (200 7) ó nguyờn cu v phõn lp cỏc thnh phn húa hc ca loi hi miờn xestospongia testudinaria thu thp ti Vit nam Trong nguyờn cu ny h ó phõn lp v xỏc nh cu trỳc ca 8 hp cht l: sairingosterol, 5,8-epidioxychlost-6-en-3-ol, cholest-7-en-3-one, cholesterol, thymidine, thymine, batilo v chimyl alcohol 1.2 Quỏ trỡnh oxy húa, cht chng oxy húa v kh nng chng oxy húa ca protein 1.2.1 Quỏ trỡnh oxy húa Quỏ trỡnh oxy. .. oxy húa Cỏc cht chng oxy húa hot ng theo cỏc c ch khỏc nhau, da vo c ch hot ng phõn loi cht chng oxy húa thnh 2 nhúm l cht chng oxy húa s cp v cht chng oxy húa th cp 23 - Cht chng oxy húa s cp: Cht chng oxy húa s cp hot ng theo c ch phỏ v chui phn ng C ch ny c gii thớch nh sau: Cỏc gc t do cú cha in t c thõn cha ghộp ụi nờn hot ng kớch hot s oxy húa Khi quỏ trỡnh oxy húa xy ra li to thnh cỏc gc t do... (199 4) cho thy cỏc hot cht sinh hc chit xut t hi miờn Aspergillus cú kh nng chng oxy húa cao hn ỏng k so vi hydroxytoluene butylated (BHT) Ngoi ra Sato v cng s (200 6) cng ó tỡm thy cỏc hp cht carotenoids, polyphenol, glutathione trong mt s loi hi miờn, õy l nhng hp cht cú hot tớnh chng oxy húa cao Yonghong Liu v cỏc cng s (2008 ) ó nguyờn cu kh nng chng oxy húa ca cỏc Alkaloid chit t Hi Miờn thuc chi Iotrochota... cú hot tớnh chng oxy húa in vitro nh kh cỏc gc t do diphenyl-1-picryhydradzyl (DPPH), superoxide, hydroxyl, to phc cng vi ion kim loi, kh st v chng oxy húa acid linoleic (Elias v cng s, 200 8) c tớnh chng oxy húa ca polypeptide ph thuc vo cu 24 trỳc, thnh phn acid amin v khi lng phõn t ca peptide (Tang v cng s, 2009; Udenigwe v Aluko, 201 1) Peptide l mt chui cỏc axớt amino tng t nh protein nhng ngn... 16.000 cỏ nhõn sng trong mt n sponge caretta, n thc n l cỏc ht ln hn m chỳng thu thp trờn cỏc ming hi miờn khi c cỏc ming hi miờn lc ra [12] 1.1.2 Phõn loi, mụi trng sng - Phõn loi: Hi miờn c phõn phi theo truyn thng thnh ba lp: hi miờn ỏ vụi (Calcarea), hi miờn thy tinh (Hexactinellida) v Demosponges (Demospongiae) Tuy nhiờn, cỏc nghiờn cu ó ch ra rng trong nhúm Demospongiae cú s khỏc bit v phylogenetically ... đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp. ) theo phương pháp kết tủa ammonium sulfate" từ làm sở cho ngun cứu tách chiết, tinh chế chất chống oxy hóa từ Hải Miên. .. sát hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn protein kết tủa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp. ) ammonium sulfate có nồng độ khác - Thử nghiệm tinh chế protein từ phân đoạn có hoạt tính chống oxy hóa. .. Hải Miên sau Mục tiêu đề tài Tách phân đoạn protein có hoạt tính chống oxy hóa từ dịch chiết hải miên (Spongia sp. ) theo phương pháp kết tủa ammonium sulfate (AS) Ý nghĩa thực tiễn ý nghĩa khoa