Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên
Dịch chiết hải miên thơ
Cho kết tủa bằng AS (bắt đầu kết tủa bằng AS cĩ nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ Ly tâm Dịch (lặp lại cho đến khi nồng độ AS là 80% Kết tủa
Pha lỗng với nước cất
Dịch Hải Miên phân đoạn
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khừ.
- Phân tích hàm lượng protein: phương
Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0= 100C. τ = V = 6000 vịng/phút. τ = 15 phút.
Cách tiến hành:
- Dịch chiết hải miên được chiết từ hải miên Spongia sp được bảo quản trong tủ đơng phịng cơng nghệ chế biến 3 tai trường Đại học Nha Trang ở nhiệt độ ≤ -200C. Hải miên sau khi rã đơng được ép ra bằng lực cơ học.
- Sau đĩ tiến hành kết tủa bằng ammonium sulfate (AS). Lúc bắt đầu, kết tủa phân đoan ở nồng độ AS bão hịa 20% (nồng độ AS cho vào dựa theo bảng 2.1. lượng AS cho vào tính ở 100C). Lấy AS cho vào 1 lít dịch chiết hải miên, khuấy điều, chờ 30 phút để kết tủa được tạo hết, trong thời gian chờ phải đảm bảo nhiệt độ kết tủa là 100C.
Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hịa ở 40C và 100C 4oC 10oC Nồng độ AS bão hịa (%) gam/lít gam/lít 20 109,9 111,2 30 56,6 57,3 40 58,3 59,1 50 60,2 61,1 60 62,2 63,1 70 64,3 65,3 80 66,6 67,7 90 69,0 70,2 100 71,7 73,0
*Lưu ý nhiệt độ cĩ ảnh hưởng đến nồng độ bão hịa và hoạt tính protein. - Sau khi chờ 30 phút ta tiến hành ly tâm lạnh theo thơng số sau: + Vận tốc : 6000 vịng/phút.
+ Nhiệt độ: 100C. + Thời gian 15 phút.
- Sau khi ly tâm song ta tiến hành tách ra làm 2 phần:
+ Phần kết tủa pha lỗng với nước cất (tùy vào lượng kết tủa mà ta pha lỗng thích hợp). Sau đĩ đem đi bảo quản ở nhiệ độ ≤ -800C.
+ Phần dịch tiếp tục đi phân đoạn bằng AS, mỗi lần lặp lại thì nồng độ AS bão hịa đi kết tủa phân đoạn protein tăng thêm 10% cho tới khi nào nồng độ AS bão
hịa là 80% thì dừng lại.
- Sau quy trình ta thu được các phân đoạn là 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. - Cuối cùng ta tiến hành phân tích các chỉ tiêu chống oxy hĩa và hàm lượng protein để chọn ra phân đoạn tốt nhất.
2.2.1.2. Quy trình tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1.
Các phân đoạn protein cĩ hoạt tính cao ở phân đoạn lần 1
Kết tủa bằng AS nồng độ bão hịa (bắt đầu kết tủa bằng AS cĩ nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ AS thêm 10%)
Ly tâm
Dịch (tới khi nào hết kết tủa thì
dừng lại).
Kết tủa
Pha lỗng với nước cất
Các phân đoạn
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khử.
- Phân tích hàm lượng protein: phương pháp Lowry. Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0= 100C. τ = 30 phút V=6000vịng/phút. τ = 15 phút. T0= 100C
Cách tiến hành:
- Sau khi phân đoạn lần 1 ta thu được các phân đoạn protein, chọn các phân đoạn cĩ hoạt tính sinh học tốt nhất sau đĩ ta tiến hành đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn lần 1 này.
- Sau đĩ tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein. - Phân tích số liệu chọn các phân đoạn tốt nhất.