1.3.1. Phương pháp phân tích hoạt tính chống oxy hĩa
- Hoạt tính khử gốc tự do DPPH
Vào năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền cĩ màu tím đậm, hầu như khơng phân hủy, khơng nhị trùng hĩa, khơng phản ứng với oxyđĩ chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine). DPPH• là một gốc tự do cĩ màu tím giống như màu của dung dịch KMnO4, khơng tan trong nước, tan trong dung mơi hữu cơ. Dung dịch DPPH cĩ cực đại hấp thu tại bước sĩng 517nm và sản phẩm khử của nĩ là DPPH-H thì cĩ màu vàng cam. Ngày nay DPPH được sử dụng để khảo sát khả năng khử gốc tự do. Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chĩng và dễ ổn định.
Nguyên tắc các chất cĩ khả năng kháng oxy hĩa sẽ trung hịa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sĩng cực đại và màu của
dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hịa gốc DPPH của các chất kháng oxy hĩa được minh họa bằng phản ứng được mơ tả bên dưới:
Z•+ AH = ZH + A•
Trong đĩ: Z• : là gốc tự do DPPH, AH là chất chống oxy hĩa.
- Hoạt động khử ion sắt III (Fe3+)
Cơ chế của hoạt động khử ion Fe3+ là sự ghép đơi electron và đình chỉ phản ứng oxy hĩa dây chuyền bằng sự khử dạng oxy hĩa thành dạng tự do. Nguồn gốc chính của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Haber-Weiss, trong đĩ gốc tự do superoxit khử Fe3+ thành Fe2+, sau đĩ nĩ xúc tác cho phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2. Như vậy, khi cĩ mặt của chất chống oxy hĩa nĩ sẽ khử gốc tự do superoxit nên hạn chế sự khử Fe3+ thành Fe2+ và làm cho dung dịch giữ màu sắc, do đĩ độ hấp thụ của dung dịch sẽ tăng lên.
O2•- + Fe3+= O2 + Fe2+
Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- +•OH
- Hoạt động khử gốc H2O2
Hydroperoxit cĩ thể làm tăng sự hình thành gốc tự do hydroxyl trong tế bào và gây độc. Nguồn gốc của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa
Fe2+ và H2O2
Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + •OH
- Hoạt động chuyển ion sắt II (Fe2+)
Nguồn gốc của các gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2. Như vậy, khi cĩ mặt của chất chống oxy hĩa sẽ hạn chế sự chuyển Fe2+ thành Fe3+ nên màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt hơn, do đĩ độ hấp thụ sẽ giảm đi.
Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + •OH
- Phương pháp phân tích tổng năng lực khử
Nguyên lý:
Khi cho chất chống oxy hĩa phản ứng với kali ferricyanide, acid trichloroacetic và clorua sắt III ở 50oC trong thời gian 20 phút sẽ tạo thành phức
màu xanh làm tăng độ hấp thụ của hỗn hợp ở bước sĩng 700nm. Hoạt tính chống oxy hĩa tăng tỷ lệ thuận với độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng ở bước sĩng 700nm. 1.3.2. Các phương pháp tinh sạch protein
Các phương pháp tinh sạch protein đều dựa trên những tính chất hĩa lý của protein như độ tích điện, kích thước phân tử, độ hịa tan... của protein cần chiết tách. Nhiều protein cịn liên kết với các phân tử sinh học khác nên việc chiết tách các protein này cịn phụ thuộc vào bản chất của các liên kết. Muốn thu nhận được các protein nguyên thể (protein cĩ tất cả tính chất tự nhiên đặc trưng của nĩ) cần sử dụng các phương pháp khác nhau.
Phương pháp kết tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để tách phân đoạn các phân tử protein cĩ hoạt tính sinh học. Cĩ nhiều phương pháp kết tủa khác nhau như: kết tủa bằng muối, kết tủa bằng các dung mơi hữu cơ hoặc kết tủa ở pH đẳng điện (pI) của protein.
1.3.2.1. Phương pháp kết tủa protein bằng muối
Kết tủa protein bằng muối là phương pháp được áp dụng phổ biến để tách phân đoạn các protein cĩ hoạt tính sinh học. Khả năng hịa tan của protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính lý hĩa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối… Ở nồng độ muối thấp, tính tan của protein tăng nhẹ (salting in). Tuy nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan của protein giảm mạnh (salting out).
Tính tan của protein tăng nhẹ ở nồng độ muối thấp (salting in) được giải thích đầu tiên bởi Debye và Huckel (1923). Trong dung dịch, protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu. Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung mơi, làm giảm các phân tử protein khơng mang điện tích, nhờ đĩ làm tăng tính tan của protein trong dung mơi. Debye và Huckel cho rằng tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai của cường độ ion trong dung dịch.
Ở nồng độ muối cao tính tan của protein giảm mạnh (salting out), hiện tượng này được Kirkwood giải thích rằng sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hĩa, giảm tính hịa tan của protein dẫn đến sự kết tủa.
Độ hịa tan protein ở nồng độ muối cao tuân theo cơng thức sau của Cohn: log S = B - KI
Trong đĩ:
S: độ hịa tan của protein (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ) K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào pH, hỗn hợp và lượng muối cĩ trong dung dịch)
I: cường độ ion của muối.
Đồ thị hàm log biểu diễn độ hịa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối như ở hình sau.
Hình 1.7. Độ hịa tan của protein biến thiên theo nồng độ muối.
Khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, cĩ thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp để tách được protein mục tiêu. Độ dốc của đường salting out mơ tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của protein và nồng độ muối, khơng phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH. Ngồi ra, nếu trọng lượng phân tử của protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp kết tủa giảm xuống.
Hiệu quả kết tủa protein của các anion muối khác nhau thì khác nhau, cĩ thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau: citrate > phosphate > sulphate > acetate/chloride > nitrate > thiocyanate.
1.3.2.2. Phương pháp kết tủa protein bằng dung mơi hữu cơ
Khi thêm dung mơi hữu cơ vào mơi trường, hằng số điện mơi của mơi trường giảm xuống. Cơng thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hịa tan và hằng số điện mơi:
ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D) Trong đĩ
S: độ hịa tan của protein trong dung mơi hữu cơ Sw: độ hịa tan của protein trong nước
D: hằng số điện mơi của mơi trường sau khi đã bổ sung dung mơi hữu cơ vào Dw: hằng số điện mơi của nước
R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối A: hằng số khí
Cơng thức trên cho thấy khi thêm dung mơi hữu cơ vào mơi trường, hằng số điện mơi tăng lên, khả năng hịa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa. Tuy nhiên, các dung mơi hữu cơ lại cĩ ái lực với các bề mặt kỵ nước của phân tử protein. Kết quả là chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa. Do đĩ, khi tủa, chỉ nên sử dụng các dung mơi hữu cơ ở nồng độ thấp, ngoại trừ một số dung mơicĩ thể được sử dụng ở nồng độ cao như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO) và Ethanol.
1.3.2.3. Phương pháp kết tủa protein ở điểm đẳng điện
Khi thay đổi pH của mơi trường, mức độ kết tủa của protein cũng thay đổi. Ở pH thấp, protein tích điện dương vì nhĩm amin bị proton hĩa (thu nhận proton). Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhĩm carboxyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất H+). Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein khơng tích điện. Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein khơng cịn khả năng tương tác với mơi trường, khi đĩ, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi mơi trường.
1.3.2.4. Phương pháp kết tủa protein bằng các non–ionic polymer
Phương pháp này được thực hiện bằng cách cho thêm non–ionic vào trong dung dịch protein. Khi thêm vào, số lượng các phân tử nước cĩ thể tương tác được với protein giảm xuống. Các chất thường được sử dụng là dextrans và polyethylen glycols.
Trong đĩ
µi0: điện thế hĩa học chuẩn của phần tử i µi: điện thế hĩa học của phần tử i
R: hằng số khí T: nhiệt độ tuyệt đối
mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và j fii: hệ số tương tác của phần tử i
fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j
Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay pH mơi trường vượt ra ngồi điểm đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein.
Loại non–ionic polymer sử dụng tùy thuộc vào khối lượng phân tử của protein mục tiêu. Tương tự như kết tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện, tại 1 giá trị pH nào đĩ (sau khi thêm non–ionic polymer) thì khả năng hịa tan của protein cũng giảm xuống.
Ưu điểm của phương pháp kết tủa bằng cách sử dụng non–ionic polymers là protein ổn định và cĩ thể sử dụng ở nhiệt độ phịng.
1.3.2.5. Phương pháp kết tủa protein bằng ion kim loại
Phương pháp này dựa vào sự gắn kết của ion kim loại với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là cĩ thể tủa được protein trong một dung dịch rất lỗng. Các ion kim loại cĩ thể chia làm ba nhĩm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất cĩ chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhĩm chức acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhĩm cĩ chứa lưu huỳnh.
Trong số các phương pháp kết tủa protein, phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sutfate cĩ nhiều ưu điểm cho phép tách phân đoạn các protein từ dịch chiết rất hiệu quả (Burgess và Deutscher, 2009). Vì vậy, nghiên cứu này đã áp dung phương pháp kết tủa bằng ammonium sutfate để tách phân đoạn các protein cĩ trong dịch chiết hải miên nhằm sàng lọc hoạt chất sinh học chống oxy hĩa cao từ hải miên.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hĩa chất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.1.1. Nguyên liệu
Hải miên (Spongia sp.) sử dụng trong nghiên cứu này được lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc vào tháng 12 năm 2014.
Hình 2.1. Lồi hải miên Spongia sp. lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc
Ngay sau khi lấy mẫu, hải miên được ướp lạnh và vận chuyển về phịng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Tại phịng thí nghiệm, hải miên được bảo quản đơng ở nhiệt độ - 20oC để sử dụng cho nghiên cứu này.
2.1.2. Hĩa chất
- 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), Bovine serum albumin (BSA), Folin–Ciocalteu reagent được mua từ cơng ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ.
- Các hĩa chất cịn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hĩa học, được mua từ cơng ty Loba Chemie, Ấn Độ và cơng ty Wako, Nhật Bản
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Bố trí thí nghiệm 2.2.1. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Dịch chiết hải miên thơ
Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa
Tinh chế Phân tích kết quả chọn các phân
đoạn cĩ hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein cao
Tách phân đoạn protein lần 2 bằng AS
Phân tích kết quả chọn phân đoạn cĩ hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein cao
Tách phân đoạn protein lần 1 bằng AS Phân tích hàm lượng protein Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa Phân tích hàm lượng protein Phân tích hoạt tính
Xử lý thống kê, so sánh giữa các phương pháp, chọn ra phương pháp thích Phân tích hàm lượng
2.2.1.1 Quy trình tách chiết phân đoạn protein lần 1 dịch chiết từ hải miên.
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên
Dịch chiết hải miên thơ
Cho kết tủa bằng AS (bắt đầu kết tủa bằng AS cĩ nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ Ly tâm Dịch (lặp lại cho đến khi nồng độ AS là 80% Kết tủa
Pha lỗng với nước cất
Dịch Hải Miên phân đoạn
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khừ.
- Phân tích hàm lượng protein: phương
Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0= 100C. τ = V = 6000 vịng/phút. τ = 15 phút.
Cách tiến hành:
- Dịch chiết hải miên được chiết từ hải miên Spongia sp được bảo quản trong tủ đơng phịng cơng nghệ chế biến 3 tai trường Đại học Nha Trang ở nhiệt độ ≤ -200C. Hải miên sau khi rã đơng được ép ra bằng lực cơ học.
- Sau đĩ tiến hành kết tủa bằng ammonium sulfate (AS). Lúc bắt đầu, kết tủa phân đoan ở nồng độ AS bão hịa 20% (nồng độ AS cho vào dựa theo bảng 2.1. lượng AS cho vào tính ở 100C). Lấy AS cho vào 1 lít dịch chiết hải miên, khuấy điều, chờ 30 phút để kết tủa được tạo hết, trong thời gian chờ phải đảm bảo nhiệt độ kết tủa là 100C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hịa ở 40C và 100C 4oC 10oC Nồng độ AS bão hịa (%) gam/lít gam/lít 20 109,9 111,2 30 56,6 57,3 40 58,3 59,1 50 60,2 61,1 60 62,2 63,1 70 64,3 65,3 80 66,6 67,7 90 69,0 70,2 100 71,7 73,0
*Lưu ý nhiệt độ cĩ ảnh hưởng đến nồng độ bão hịa và hoạt tính protein. - Sau khi chờ 30 phút ta tiến hành ly tâm lạnh theo thơng số sau: + Vận tốc : 6000 vịng/phút.
+ Nhiệt độ: 100C. + Thời gian 15 phút.
- Sau khi ly tâm song ta tiến hành tách ra làm 2 phần:
+ Phần kết tủa pha lỗng với nước cất (tùy vào lượng kết tủa mà ta pha lỗng thích hợp). Sau đĩ đem đi bảo quản ở nhiệ độ ≤ -800C.
+ Phần dịch tiếp tục đi phân đoạn bằng AS, mỗi lần lặp lại thì nồng độ AS bão hịa đi kết tủa phân đoạn protein tăng thêm 10% cho tới khi nào nồng độ AS bão
hịa là 80% thì dừng lại.
- Sau quy trình ta thu được các phân đoạn là 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. - Cuối cùng ta tiến hành phân tích các chỉ tiêu chống oxy hĩa và hàm lượng protein để chọn ra phân đoạn tốt nhất.
2.2.1.2. Quy trình tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1.
Các phân đoạn protein cĩ hoạt tính cao ở phân đoạn lần 1
Kết tủa bằng AS nồng độ bão hịa (bắt đầu kết tủa bằng AS cĩ nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ AS thêm 10%)
Ly tâm
Dịch (tới khi nào hết kết tủa thì
dừng lại).
Kết tủa
Pha lỗng với nước cất
Các phân đoạn
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khử.
- Phân tích hàm lượng protein: phương pháp Lowry. Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0= 100C. τ = 30 phút V=6000vịng/phút. τ = 15 phút. T0= 100C
Cách tiến hành:
- Sau khi phân đoạn lần 1 ta thu được các phân đoạn protein, chọn các phân đoạn cĩ hoạt tính sinh học tốt nhất sau đĩ ta tiến hành đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn lần 1 này.
- Sau đĩ tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein. - Phân tích số liệu chọn các phân đoạn tốt nhất.
Ly tâm
Kết tủa phân đoạn protein bằng AS tổng nồng độ bão hịa 80% (theo quy trình Các phân đoạn tốt nhất của phân đoạn lần 1. Dịch chiết thơ
Chiết protein bằng phenol
Ly tâm V=6000 vịng/phút Τ=15phút. T0= 100C Tỷ lệ phenol:mẫu 1:1 pH: 7 ÷ 9. Votex: 5 phút Vận tốc: 6000 vịng/phút τ = 15 phút Tách dịch phenol cĩ chứa protein Kết tủa bằng AA trong metanol Ly tâm Nồng độ AA/metanol: 0,1M Tỷ lệ AA : mẫu 5:1 T0C: -200C. τ = để qua đêm τ = 10 phút. Các thơng số cịn lại