Phương pháp này dựa vào sự gắn kết của ion kim loại với một phần của phân tử protein. Thuận lợi của phương pháp này là cĩ thể tủa được protein trong một dung dịch rất lỗng. Các ion kim loại cĩ thể chia làm ba nhĩm. Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid carboxylic và các hợp chất cĩ chứa nitrogen. Các ion như Ca2+, Ba2+, Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhĩm chức acid carboxylic. Các ion như Ag2+, Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các nhĩm cĩ chứa lưu huỳnh.
Trong số các phương pháp kết tủa protein, phương pháp kết tủa bằng muối ammonium sutfate cĩ nhiều ưu điểm cho phép tách phân đoạn các protein từ dịch chiết rất hiệu quả (Burgess và Deutscher, 2009). Vì vậy, nghiên cứu này đã áp dung phương pháp kết tủa bằng ammonium sutfate để tách phân đoạn các protein cĩ trong dịch chiết hải miên nhằm sàng lọc hoạt chất sinh học chống oxy hĩa cao từ hải miên.
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hĩa chất
2.1.1. Nguyên liệu
Hải miên (Spongia sp.) sử dụng trong nghiên cứu này được lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc vào tháng 12 năm 2014.
Hình 2.1. Lồi hải miên Spongia sp. lấy mẫu ở vùng biển Phú Quốc
Ngay sau khi lấy mẫu, hải miên được ướp lạnh và vận chuyển về phịng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Tại phịng thí nghiệm, hải miên được bảo quản đơng ở nhiệt độ - 20oC để sử dụng cho nghiên cứu này.
2.1.2. Hĩa chất
- 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), Bovine serum albumin (BSA), Folin–Ciocalteu reagent được mua từ cơng ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ.
- Các hĩa chất cịn lại là loại đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích hĩa học, được mua từ cơng ty Loba Chemie, Ấn Độ và cơng ty Wako, Nhật Bản
2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Bố trí thí nghiệm 2.2.1. Bố trí thí nghiệm
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Dịch chiết hải miên thơ
Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa
Tinh chế Phân tích kết quả chọn các phân
đoạn cĩ hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein cao
Tách phân đoạn protein lần 2 bằng AS
Phân tích kết quả chọn phân đoạn cĩ hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein cao
Tách phân đoạn protein lần 1 bằng AS Phân tích hàm lượng protein Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa Phân tích hàm lượng protein Phân tích hoạt tính
Xử lý thống kê, so sánh giữa các phương pháp, chọn ra phương pháp thích Phân tích hàm lượng
2.2.1.1 Quy trình tách chiết phân đoạn protein lần 1 dịch chiết từ hải miên.
Hình 2.3. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn protein lần 1 từ dịch chiết hải miên
Dịch chiết hải miên thơ
Cho kết tủa bằng AS (bắt đầu kết tủa bằng AS cĩ nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ Ly tâm Dịch (lặp lại cho đến khi nồng độ AS là 80% Kết tủa
Pha lỗng với nước cất
Dịch Hải Miên phân đoạn
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khừ.
- Phân tích hàm lượng protein: phương
Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0= 100C. τ = V = 6000 vịng/phút. τ = 15 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Cách tiến hành:
- Dịch chiết hải miên được chiết từ hải miên Spongia sp được bảo quản trong tủ đơng phịng cơng nghệ chế biến 3 tai trường Đại học Nha Trang ở nhiệt độ ≤ -200C. Hải miên sau khi rã đơng được ép ra bằng lực cơ học.
- Sau đĩ tiến hành kết tủa bằng ammonium sulfate (AS). Lúc bắt đầu, kết tủa phân đoan ở nồng độ AS bão hịa 20% (nồng độ AS cho vào dựa theo bảng 2.1. lượng AS cho vào tính ở 100C). Lấy AS cho vào 1 lít dịch chiết hải miên, khuấy điều, chờ 30 phút để kết tủa được tạo hết, trong thời gian chờ phải đảm bảo nhiệt độ kết tủa là 100C.
Bảng 2.1. Nồng độ AS bão hịa ở 40C và 100C 4oC 10oC Nồng độ AS bão hịa (%) gam/lít gam/lít 20 109,9 111,2 30 56,6 57,3 40 58,3 59,1 50 60,2 61,1 60 62,2 63,1 70 64,3 65,3 80 66,6 67,7 90 69,0 70,2 100 71,7 73,0
*Lưu ý nhiệt độ cĩ ảnh hưởng đến nồng độ bão hịa và hoạt tính protein. - Sau khi chờ 30 phút ta tiến hành ly tâm lạnh theo thơng số sau: + Vận tốc : 6000 vịng/phút.
+ Nhiệt độ: 100C. + Thời gian 15 phút.
- Sau khi ly tâm song ta tiến hành tách ra làm 2 phần:
+ Phần kết tủa pha lỗng với nước cất (tùy vào lượng kết tủa mà ta pha lỗng thích hợp). Sau đĩ đem đi bảo quản ở nhiệ độ ≤ -800C.
+ Phần dịch tiếp tục đi phân đoạn bằng AS, mỗi lần lặp lại thì nồng độ AS bão hịa đi kết tủa phân đoạn protein tăng thêm 10% cho tới khi nào nồng độ AS bão
hịa là 80% thì dừng lại.
- Sau quy trình ta thu được các phân đoạn là 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%. - Cuối cùng ta tiến hành phân tích các chỉ tiêu chống oxy hĩa và hàm lượng protein để chọn ra phân đoạn tốt nhất.
2.2.1.2. Quy trình tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1
Hình 2.4. Bố trí thí nghiệm tách chiết phân đoạn lần 2 từ phân đoạn lần 1.
Các phân đoạn protein cĩ hoạt tính cao ở phân đoạn lần 1
Kết tủa bằng AS nồng độ bão hịa (bắt đầu kết tủa bằng AS cĩ nồng độ 20%, mỗi lần lặp lại tăng nồng độ AS thêm 10%)
Ly tâm
Dịch (tới khi nào hết kết tủa thì
dừng lại).
Kết tủa
Pha lỗng với nước cất
Các phân đoạn
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khử.
- Phân tích hàm lượng protein: phương pháp Lowry. Phân tích số liệu chọn phân các đoạn tốt nhất Nồng độ AS dựa theo bảng 2.1 T0= 100C. τ = 30 phút V=6000vịng/phút. τ = 15 phút. T0= 100C
Cách tiến hành:
- Sau khi phân đoạn lần 1 ta thu được các phân đoạn protein, chọn các phân đoạn cĩ hoạt tính sinh học tốt nhất sau đĩ ta tiến hành đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn lần 1 này.
- Sau đĩ tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hĩa và hàm lượng protein. - Phân tích số liệu chọn các phân đoạn tốt nhất.
Ly tâm
Kết tủa phân đoạn protein bằng AS tổng nồng độ bão hịa 80% (theo quy trình Các phân đoạn tốt nhất của phân đoạn lần 1. Dịch chiết thơ
Chiết protein bằng phenol (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ly tâm V=6000 vịng/phút Τ=15phút. T0= 100C Tỷ lệ phenol:mẫu 1:1 pH: 7 ÷ 9. Votex: 5 phút Vận tốc: 6000 vịng/phút τ = 15 phút Tách dịch phenol cĩ chứa protein Kết tủa bằng AA trong metanol Ly tâm Nồng độ AA/metanol: 0,1M Tỷ lệ AA : mẫu 5:1 T0C: -200C. τ = để qua đêm τ = 10 phút. Các thơng số cịn lại như trên Các phân đoạn tốt nhất khi đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn tốt nhất của phân đoạn lần 1
Cho trực
tiếp AS
tổng nồng độ 80%
Hình 2.5. Quy trình tinh chế protein từ các phân đoạn.
Cách tiến hành:
Sau khi xử lý số liệu chọn các phân đoạn tốt nhất của phân đoạn lần 1 và các phân đoạn tốt nhất khi đi phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn tốt nhất lần 1 ta tiến hành
τ = 5 phút Hịa tan Tách kết tủa Rửa kết tủa Làm khơ Ly tâm Tách protein Rử lại Ly tâm (lập lại 3 lần) Thu dịch protein
- Phân tích hoạt tính chống oxy hĩa: + Khử gốc tự do DPPH.
+ Tổng năng lực khừ.
- Xác định hàm lượng protein: phương pháp Lowry.
AA/metanol tỉ lệ 1:1 Siêu âm 1 phút trong
Acetonl 80% Tỉ lệ 1:1
đi tinh sạch để loại bỏ bớt cặn, tạp. Đồng thời đi phân đoạn protein bằng AS tổng nồng độ bão hịa 80% dịch chiết từ dịch chiết hải miên thơ đã qua ly tâm, tiến hành như sau : hút 30 ml dịch chiết sau ly tâm sau đĩ cho 14,52g AS (cách tính: dựa vào bảng 2.1. Ta tính tổng của các nồng độ AS bão hịa từ 20%÷80% sau đĩ nhân 3 chia 1000) vào kết tủa và làm như hình 2.1 sau đĩ cũng đem đi tinh sạch.
Quy trình tinh sạch thực hiện như sau:
- Mẫu trước khi cho phenol phải đi đo pH và đảm bảo độ pH 7÷9 thì đem đi cho phenol tỉ lệ phenol: mẫu 1:1 vào và tiến hành votex trong vịng 5 phút, sau đĩ đem đi ly tâm ở vận tốc 6000 vịng/phút trong vịng 15 phút ở nhiệt độ 100C, tiếp theo ta tách dịch phenol cĩ chứa protein đem đi kết tủa bằng AA trong metanol nồng độ 0,1M cĩ tỉ lệ với mẫu ban đầu là 5:1, sau đĩ để lắng qua đêm ở nhiệt độ -200C, sáng hơm sau ta tiến hành ly tâm trong 10 phút với cùng các thơng số ở trên, sau khi ly tâm ta tách kết tủa rồi rửa bằng AA trong metanol nồng độ 0,1M cĩ tỉ lệ với mẫu ban đầu là 1:1, đem đi siêu âm 1 phút trong nước đá, tiếp tục ly tâm, tách kết tủa, rửa kết tủa cứ như vậy trong 3 lần. Khi đĩ đã tách được protein ta tiến hành rửa lại bằng acetol 80% tỉ lệ 1:1, làm khơ bằng cách bỏ vào ngăn đơng cho tới khi nào bay hết acetol. Tiếp theo ta hịa tan với 10ml nước cất, ly tâm trong 5 phút thu dich protein.
- Cuối cùng đem dịch protein đi kiểm tra hoạt tính chống oxy hĩa, hàm lượng protein.
- Xử lý thống kê, so sánh giữa các phương pháp.
2.2.2. Các phương pháp phân tích.
2.2.2.1. Phương pháp phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH
Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.1.
2.2.2.2. Phương pháp phân tích tổng năng lượng khử
Tổng năng lực khử của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp của Oyaizu và cộng sự (1986). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.2.
2.2.2.3. Phương pháp Lowry
Hàm lượng protein của dịch chiết từ hải miên được phân tích theo phương pháp Lowry và cộng sự (1951). Cách tiến hành được trình bày chi tiết tại phụ lục 1.3.
2.2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm
Số liệu trình bày trong báo cáo này là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm. Tính giá trị trung bình, vẽ đồ thị và so sánh sự khác biệt cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P < 0.05). Số liệu thực nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê và vẽ đồ thị với
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Hoạt tính chống oxy hĩa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống oxy hĩa của các phân đoạn lần 1 từ dịch chiết hải miên. oxy hĩa của các phân đoạn lần 1 từ dịch chiết hải miên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Như chúng ta đã biết hải miên là lồi sinh vật cĩ hoạt tính sinh học cao. Các hợp chất chiết từ hải miên cĩ hoạt tính sinh học cao cĩ khả năng chống oxy hĩa, đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV. Theo các nguyên cứu gần đây cho thấy trong dịch chiết hải miên cĩ nhiều hợp chất protein và họ cho rằng cĩ mối liên quan giữa protein và các hoạt tính sinh học cĩ trong Hải miên. Từ đĩ tơi sử dụng muối Ammonium sufate để tách phân đoạn protein cĩ hoạt tính sinh học.
Sau khi phân đoạn lần 1 tơi tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hĩa và xác định hàm lượng protein, kết quả nghiên cứu được thể hiện qua các hình sau
Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn lần 1 từ nồng độ AS bão hịa 20% đến 80% và dịch chiết hải miên thơ ban đầu. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể
Dựa vào đồ thị Hình 3.1 và bảng xử lý số liệu R (phục lục2a), ta nhận thấy: - Việc phân đoạn protein cĩ ảnh hưởng tới hoạt tính chống gốc tự do DPPH hơn là ảnh hưởng của nồng độ các phân đoạn, tuy nhiên cả 2 ảnh hưởng điều cĩ ý nghĩa thống kê do cả 2 điều cĩ trị sơ P rất thấp < 0.05.
- Nếu đem so sánh dịch chiết chưa phân đoạn với các phân đoạn khác thì ta thấy rằng:
+ Phân đoạn 20% khử nhiều hơn 0.2058 mM/ml DPPH so với dịch chưa phân đoạn với sai số chuẩn là 0.1047, tuy nhiên sư khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa thống kê do trị số P > 0.05.
+ Phân đoạn 30% khử nhiều hơn 0.7717 mM/ml DPPH, phân đoạn 40% khử nhiều hơn 1.6483 mM/ml DPPH, phân đoạn 50% khử nhiều hơn 2.4376 mM/ml DPPH, phân đoạn 60% khử nhiều hơn 2.0137 mM/ml DPPH, phân đoạn 70% khử ít hơn 1.9805 mM/ml DPPH, phân đoạn 80% khử ít hơn 1.6687 mM/ml DPPH. Với sai số chuẩn là 0.1047 và cĩ trị số P < 0.05 nên các giá trị trên điều cĩ ý nghĩa về mặt thống kê.
- Phân đoạn 50% cĩ khả năng khử gốc tự do là tốt nhất, sau đĩ theo thứ tự là phân đoạn 60%, phân đoạn 40%, phân đoạn 30%, phân đoạn 20% và dịch chiết chưa phân đoạn vì cĩ trị số p = 0.5116, nên khả năng khử gốc tự do DPPH là như nhau, phân đoạn 70% và 80% cĩ giá trị P = 0.0703 nên chúng khơng cĩ sự khác nhau trong việc khử gốc tự do DPPH.
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn protein dịch chiết hải miên lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm
± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0.05).
Qua đồ thị Hình 3.2 và bảng xử lý số liệu bằng phần mềm R (phụ lục 3a) ta cĩ thể thấy rằng nếu lấy giá trị BHT của dịch chiết chưa phân đoạn làm giá trị để so sánh với giá trị BHT của các phân đoạn khác với độ sai số chuẩn là 3.163 thì ta cĩ các kết quả như sau: Phân đoạn 20% cĩ giá trị BHT thấp hơn khoảng 33.162 mg/ml, với trị số P < 0.05; phân đoạn 30% cĩ giá trị BHT thấp hơn khoảng 32.1 mg/ml, với trị số P < 0.05; phân đoạn 40% cĩ giá trị BHT thấp hơn khoảng 1.961, với trị số P > 0.05 vì vậy nĩ khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê; phân đoạn 50% và phân đoạn 60% cĩ giá trị BHT cao hơn lần lượt là 24.229 mg/ml và 26.239 mg/ml, với trị sơ P < 0.05; phân đoạn 70% và 80% cĩ giá trị BHT thấp hơn lần lượt là 42.195 mg/ml và 35.522 mg/ml, với trị số P < 0.05. Vì vậy ta cĩ thể kết luận được rằng phân đoạn 60% cĩ giá trị BHT cao nhất, tuy nhiên khi so sánh giữa phân đoạn 60% và 50% ta nhận thấy rằng trị số P= 0.9995, vì vậy giá trị BHT của phân đoạn 50% và 60% là khơng khơng khác biệt về ý nghĩa thống kê, giá trị BHT cao tiếp theo là phân đoạn 40% và dịch chưa phân đoạn, khi so sánh giá trị BHT của cả hai thì cho trị số P=0.9996, vì vậy chúng cĩ giá trị BHT khơng khác nhau về mặt thống kê, khi đi so sánh giá trị của phân đoạn 20%,
30%, 70%, 80%, thi chúng cho các trị số P > 0.05, do đĩ chúng khơng khác nhau về mặt ý nghĩa thống kê.
Qua 2 phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hĩa từ phân đoạn protein lần 1 từ Hải miên ta cĩ thể thấy rằng hoạt tính sinh học tăng dần từ dịch chưa phân đoạn đến cao nhất là phân đoạn 50% và 60% sau đĩ giảm dần đến phân đoạn cuối