oxy hĩa của các phân đoạn lần 1 từ dịch chiết hải miên.
Như chúng ta đã biết hải miên là lồi sinh vật cĩ hoạt tính sinh học cao. Các hợp chất chiết từ hải miên cĩ hoạt tính sinh học cao cĩ khả năng chống oxy hĩa, đặc tính kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus và kháng HIV. Theo các nguyên cứu gần đây cho thấy trong dịch chiết hải miên cĩ nhiều hợp chất protein và họ cho rằng cĩ mối liên quan giữa protein và các hoạt tính sinh học cĩ trong Hải miên. Từ đĩ tơi sử dụng muối Ammonium sufate để tách phân đoạn protein cĩ hoạt tính sinh học.
Sau khi phân đoạn lần 1 tơi tiến hành đi phân tích các hoạt tính chống oxy hĩa và xác định hàm lượng protein, kết quả nghiên cứu được thể hiện qua các hình sau
Hình 3.1. Hoạt tính khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn lần 1 từ nồng độ AS bão hịa 20% đến 80% và dịch chiết hải miên thơ ban đầu. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể
Dựa vào đồ thị Hình 3.1 và bảng xử lý số liệu R (phục lục2a), ta nhận thấy: - Việc phân đoạn protein cĩ ảnh hưởng tới hoạt tính chống gốc tự do DPPH hơn là ảnh hưởng của nồng độ các phân đoạn, tuy nhiên cả 2 ảnh hưởng điều cĩ ý nghĩa thống kê do cả 2 điều cĩ trị sơ P rất thấp < 0.05.
- Nếu đem so sánh dịch chiết chưa phân đoạn với các phân đoạn khác thì ta thấy rằng:
+ Phân đoạn 20% khử nhiều hơn 0.2058 mM/ml DPPH so với dịch chưa phân đoạn với sai số chuẩn là 0.1047, tuy nhiên sư khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa thống kê do trị số P > 0.05.
+ Phân đoạn 30% khử nhiều hơn 0.7717 mM/ml DPPH, phân đoạn 40% khử nhiều hơn 1.6483 mM/ml DPPH, phân đoạn 50% khử nhiều hơn 2.4376 mM/ml DPPH, phân đoạn 60% khử nhiều hơn 2.0137 mM/ml DPPH, phân đoạn 70% khử ít hơn 1.9805 mM/ml DPPH, phân đoạn 80% khử ít hơn 1.6687 mM/ml DPPH. Với sai số chuẩn là 0.1047 và cĩ trị số P < 0.05 nên các giá trị trên điều cĩ ý nghĩa về mặt thống kê.
- Phân đoạn 50% cĩ khả năng khử gốc tự do là tốt nhất, sau đĩ theo thứ tự là phân đoạn 60%, phân đoạn 40%, phân đoạn 30%, phân đoạn 20% và dịch chiết chưa phân đoạn vì cĩ trị số p = 0.5116, nên khả năng khử gốc tự do DPPH là như nhau, phân đoạn 70% và 80% cĩ giá trị P = 0.0703 nên chúng khơng cĩ sự khác nhau trong việc khử gốc tự do DPPH.
Hình 3.2. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn protein dịch chiết hải miên lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm
± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0.05).
Qua đồ thị Hình 3.2 và bảng xử lý số liệu bằng phần mềm R (phụ lục 3a) ta cĩ thể thấy rằng nếu lấy giá trị BHT của dịch chiết chưa phân đoạn làm giá trị để so sánh với giá trị BHT của các phân đoạn khác với độ sai số chuẩn là 3.163 thì ta cĩ các kết quả như sau: Phân đoạn 20% cĩ giá trị BHT thấp hơn khoảng 33.162 mg/ml, với trị số P < 0.05; phân đoạn 30% cĩ giá trị BHT thấp hơn khoảng 32.1 mg/ml, với trị số P < 0.05; phân đoạn 40% cĩ giá trị BHT thấp hơn khoảng 1.961, với trị số P > 0.05 vì vậy nĩ khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê; phân đoạn 50% và phân đoạn 60% cĩ giá trị BHT cao hơn lần lượt là 24.229 mg/ml và 26.239 mg/ml, với trị sơ P < 0.05; phân đoạn 70% và 80% cĩ giá trị BHT thấp hơn lần lượt là 42.195 mg/ml và 35.522 mg/ml, với trị số P < 0.05. Vì vậy ta cĩ thể kết luận được rằng phân đoạn 60% cĩ giá trị BHT cao nhất, tuy nhiên khi so sánh giữa phân đoạn 60% và 50% ta nhận thấy rằng trị số P= 0.9995, vì vậy giá trị BHT của phân đoạn 50% và 60% là khơng khơng khác biệt về ý nghĩa thống kê, giá trị BHT cao tiếp theo là phân đoạn 40% và dịch chưa phân đoạn, khi so sánh giá trị BHT của cả hai thì cho trị số P=0.9996, vì vậy chúng cĩ giá trị BHT khơng khác nhau về mặt thống kê, khi đi so sánh giá trị của phân đoạn 20%,
30%, 70%, 80%, thi chúng cho các trị số P > 0.05, do đĩ chúng khơng khác nhau về mặt ý nghĩa thống kê.
Qua 2 phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hĩa từ phân đoạn protein lần 1 từ Hải miên ta cĩ thể thấy rằng hoạt tính sinh học tăng dần từ dịch chưa phân đoạn đến cao nhất là phân đoạn 50% và 60% sau đĩ giảm dần đến phân đoạn cuối cùng là 80%. Ta cĩ thể giải thích là do trong dịch chiết chưa phân đoạn cĩ lượng protein nhiều nhưng hàm lượng lại khơng cao do cĩ quá nhiều tạp chất khác nhau dẫn tới hoạt tính khơng cao, khi ta đi phân đoạn bằng muối AS sẽ loại bỏ một phần được các tạp chất cĩ trong dich chiết làm tăng hàm lượng protein dẫn đến hoạt tính cao lên. Trong phân đoạn 50% cĩ hàm lượng protein cao nhất nên hoạt tính là cao nhất, tiếp theo là các phân đoan 60% và 40%. Để chứng minh cho lập luận trên ta cĩ thể dựa vào đồ thị Hình 3.3.
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện hàm lượng protein của các phân đoạn. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD. Các ký tự khác nhau thể hiện
sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0,05).
Dựa vào đồ thị và bảng xử lý số liệu từ phần mềm R (phụ lục 3a) thì ta cĩ thể nhận thấy rằng hàm lượng protein tăng dần từ dịch chiết chưa phân đoạn đến phân đoạn 20%, 30%, 40% và đạt cực đại ở phân đoạn 50% và sau đĩ giảm dần ở phân đoạn 60%, 70%, 80%. Ngồi ra ta cũng cĩ thể nhận thấy rằng hàm lượng protein tăng
đột biến từ phân đoạn 30% lên phân đoạn 40% (49.50 mg/ml so với 68.98 mg/ml) và hàm lượng protein giảm đột ngột từ phân đoạn 60% lên phân đoạn 70% (77.28 mg/ml so với 35.65 mg/ml), đồng thời hàm lượng protein của dịch chiết chưa phân đoạn khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê so với hàm lượng protein trong dich chiết phân đoạn 70% vì cĩ trị số P =1
Nguyên nhân dẫn đến các phân đoạn 40%, 50%, 60% cĩ hàm lượng protein cao là do khi do muối AS cĩ nồng độ thấp 20%, 30% khơng đủ nồng độ để làm kết tủa protein trong dịch chiết hải miên vì trong hải miên chứa đa số là các protein cĩ tính tan trung binh, khi cho nồng độ muối thấp chỉ kết tủa được các protein, khĩ tan dẫn đến khơng thu được nhiều protien, các nồng độ muối cao 70%, 80% cũng khơng thu được nhiều do các protein co tính tan trung bình nên các nồng độ muối trung bình đã thu được phần lớn protein chỉ cịn một số protein cĩ tính tan cao.
Hình 3.4. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa protein và khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn protein từ phân đoạn lần 1.
Dựa vào kết quả phân tích số liệu bằng phần mềm R (phụ lục 3a) ta thấy rằng với giá trị kiểm định t = 6.5204 và trị số P = 3.288e-07, ta cĩ thể kết luận rằng protein trong các phân đoạn và khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn lần 1 cĩ liên quan tới nhau.
Hình 3.5. Đồ thị thể hiện mối tương quan giữa tổng năng lực khử của các phân đoạn lần 1 với protein cĩ trong các phân đoạn đĩ.
Dựa vào kết quả phân tích bằng phần mềm R (mục lục 2a) ta thấy giá trị kiểm định t = 8.6234 và trị số P = 1.278e-09, ta cĩ thể kết luận được rằng protein trong các phân đoạn lần 1 cĩ ảnh hưởng đến tổng năng lực khử của các phân đoạn protein lần 1.
Dựa vào các kết quả nguyên cứu và phân tích trên cĩ thể thấy rằng:
- Protein cĩ ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hĩa của dịch chiết hải miên.
- Phân đoạn nào cĩ hàm lượng protein càng cao thì khả năng chống oxy hĩa càng cao.
- Phân đoạn protein 50% cĩ hàm lượng protein cao nhất, do đĩ khả năng chống oxy hĩa là cao nhất, các phân đoạn 40%, 60% cũng cĩ hàm lượng protein cao nên hoạt tính cao. Vì vậy nguyên cứu này chọn các phân đoạn protein 40%, 50% và 60% để tiếp tục các bước tiếp theo.
3.2. Hoạt tính chống oxy hĩa, mối tương quan giữa protein và hoạt tính chống oxy hĩa của các phân đoạn lần 2 từ dịch chiết hải miên. oxy hĩa của các phân đoạn lần 2 từ dịch chiết hải miên.
Sau khi phân tích kết quả từ phân đoạn lần 1 chọn các phân đoạn protein 40%, 50% và 60% cĩ hoạt tính chống oxy hĩa cao để tiếp tục phân đoạn lần 2. Sau khi phân
đoạn lần 2 thu được các phân đoạn protein sau:
+ Phân đoạn AS nồng độ bão hịa 20%, 30%, 40% của phân đoạn 40% lúc đầu, được ký hiệu lần lượt là 20% (40%), 30% (40%), 40% (40%), số trong ngoặc là phân đoạn lần 1. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phân đoạn AS nồng độ bão hịa 20%, 30%, 40%, 50% của phân đoạn 50% lúc đầu, được ký hiệu lần lượt là 20% (50%), 30% (50%), 40% (50%), 50% (50%), số trong ngoặc là phân đoạn lần 1.
+ Phân đoạn AS nồng độ bão hịa 20%, 30%, 40%, 50% của phân đoạn 60% lúc đầu, được ký hiệu lần lượt là 20% (60%), 30% (60%), 40% (60%), 50% (60%), số trong ngoặc là phân đoạn lần 1
Kết quả phân tích khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn được thể hiện qua hình 3.6.
Hình 3.6. Đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn protein lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD.
Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0.05).
Đồ thị hình 3.6a thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn 20% (40%), 20% (50%), 20% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả xử lý số liệu (phụ lục2b) cĩ thể thấy rằng khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn này khá cao, chứng tỏ hàm lượng protein trong các phân đoạn này cao. Nếu ta lấy phân đoạn 20% (40%) làm chuẩn để so sánh khả năng khử gốc tự do DPPH với các phân đoạn khác thì ta cĩ: phân đoạn 20% (50%) cĩ thể khử nhiều gốc tự do hơn phân đoạn 20% (40%) khoảng 1.8833 mM DPPH, với trị số P < 0.05; cịn phân đoạn 20% (60%) khử được nhiều
hơn 1.7867 mM DPPH so với phân đoạn 20% (40%), với trị số P < 0.05. Khi ta đi so sánh giữa 2 phân đoạn 20% (50%) và 20% (60%) thì ta thấy rằng phân đoạn 20% (50%) khử được gốc tự do nhiều hơn phân đoạn 20% (60%) là 0.0967 mM DPPH. Tuy nhiên trị số p = 0.528 do đĩ sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê. Vì vậy ta kết luận rằng trong phân đoạn 20% của phân đoạn 40%, 50%, 60% thì phân đoạn 20% (50%) và 20% (60%) cĩ khả năng khử gốc tự do DPPH là tốt nhất.
Đồ thị hình 3.6b là đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của các phân đoạn 30% (40%), 30% (50%), 30% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích số liệu ( phụ lục 3b) cĩ thể nĩi rằng khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 30% (50%) và 30% (60%) là cao nhất, cụ thể nếu lấy phân đoạn 30% (40%) làm chuẩn để so sánh khả năng khử gốc tự do DPPH thì: phân đoạn 30% (50%) khử được nhiều gốc tự do hơn phân đoạn 30% (40%) là 0.7696 mM DPPH với trị số P < 0.05; phân đoạn 30% (60%) khử được nhiều hơn 0.7632 mM DPPH so với phân đoạn 30% (40%). Cịn nếu đi so sánh khả năng khử gốc tự do của phân đoạn 30% (50%) và 30% (60%) thì khả năng khử gốc tự do của phân đoạn 30% (50%) cao hơn phân đoạn 30% (60%) là 0.0063 mM với trị số P = 0.9904 khơng cĩ khác biệt về ý nghĩa thống kê. Như vậy cĩ thể kết luận được rằng phân đoạn 30% lần 2 từ các phân đoạn 40%, 50%, 60% thì phân đoạn 30% (50%) và phân đoạn 30%(60%) cĩ khả năng khử gốc tự do DPPH là tốt nhất.
Đồ thị hình 3.6c là đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn 40% (40%), 40% (50%), 40% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3b) ta cĩ thể nhận xét rằng khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 40% (40%), 40% (50%) thấp đi đáng kể, cịn khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 40% (60%) vẫn cịn khá cao, cụ thể nếu ta lấy phân đoạn 40% (40%) làm chuẩn để so sánh thì ta nhận thấy rằng phân đoạn 40% (50%) khử được ít hơn 0.1075 mM DPPH với trị số p < 0.05, cịn phân đoạn 40% (60%) khử được nhiều hơn 2.3225 mM DPPH với trị số P < 0.05. Đồng thời ta cĩ thể thấy rõ rằng phân đoạn 40% (60%) cĩ khả năng khử gốc tự do là cao nhất tiếp theo là 40% (40%) cuối cùng là 40% (50%). Đồ thị hình 3.6d là đồ thị thể hiện khả năng khử gốc tự do của phân đoạn 50%
(60%) và 50% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả xử lí số liệu (mục luc 2b) ta cĩ thể thấy rằng khả năng khử gốc tự do của 2 phân đoạn này là khá thấp, phân đoạn 40% (60%) khử được nhiều hơn phân đoạn 50% (50%) là 0,304 mM DPPH với trị số p <0.05.
Hình 3.7. Đồ thị thể hiện tổng năng lực khử của các phân đoạn lần 2 từ các phân đoạn lần 1. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ± SD.
Các ký tự khác nhau thể hiện sự khác biệt cĩ ý nghĩa thống kê (P < 0.05).
Đồ thị 3.7a là đồ thị thể hiên tổng năng lực khử của các phân đoạn 20% (40%), 20% (50%), 20% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả xử lý số liệu ( phụ lục 3b) thấy rằng tổng năng lực khử của các phân đoạn này khá cao, cao nhất là phân đoạn 20% (60%) tiếp theo là phân đoạn 20% (50%), 20% (40%), nếu lấy phân đoạn 20% (40%) lầm chuẩn để so sánh năng lực khử của các phân đoạn thì phân đoạn 20% (50%) cĩ hàm lượng BHT nhiều hơn phân đoạn 20% (40%) là 10.088 mg/ ml BHT, cịn phân đoạn 20% (60%) thì nhiều hơn 24,76 mg/ml BHT, cả hai điều cĩ ý nghĩa về mặt thống kê vì trị số P < 0.05.
Đồ thị hình 3.7b là đồ thị biểu diễn tổng năng lực khử của các phân đoạn 30% (40%), 30% (50%), 30% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3b) thấy: phân đoạn 30% (60%) cĩ chỉ số BHT là cao nhất, tiếp đến là phân đoạn
30% (50%), 30% (40%), cụ thể phân đoạn 30% (60%) cĩ chỉ số BHT cao hơn phân đoạn 20% (40%) là 8.4275 mg/ml BHT, cịn phân đoạn 30% (50%) cĩ chỉ số BHT cao hơn phân đoạn 20% (40%) là 4.0258 mg/ml BHT. Với trị số P < 0.05.
Đồ thị hình 3.7c là đồ thị biểu diễn tổng năng lực khử của các phân đoạn 40% (40%), 40% (50%), 40% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3b) thấy: chỉ số BHT của phân đoạn 40% (50%) vẫn cịn cao trong khi đĩ phân đoạn 40% (40%), 40% (50%) lại giảm đi 1 cách đáng kể. Chỉ số BHT của phân đoạn 40% (60%) cao hơn phân đoạn 40% (40%) và phân đoạn 40% (50%) lần lược là 13.1904 mg/ml và 13.0004 mg/ ml BHT với trị số P < 0.05, trong khi đĩ phân đoạn 40% ( 40%) và 40% (50%) lại khơng cĩ khác biệt về mặt thống kê do trị số P > 0.05. Đồ thị hình 3.7d là đồ thị biểu diễn tổng năng lực khử của các phân đoạn 50% (50%), 50% (60%). Dựa vào đồ thị và kết quả phân tích thống kê (phụ lục 3b) thấy: chỉ số BHT của 2 phân đoạn này khơng cao, phân đoạn cĩ chỉ số BHT cao hơn là phân đoạn 50% (60%), cao hơn 3.1692 mg/ml BHT so với phân đoạn 50% (50%), với trị số P < 0.05.
Dựa vào các kết quả phân tích trên nhận thấy phân đoạn 20% (40%), 30% (40%), 20% (50%), 30% (50%), 20% (60%), 30% (60%), 40% (60%) cĩ hoạt tính cao nên đi so sánh hoạt tính của các phân đoạn này qua hình sau.
Hình 3.8. Đồ thị so sánh khả hoạt tính chống oxy hĩa của các phân đoạn tốt nhất trong phân đoạn lần 2. Số liệu trên đồ thị là giá trị trung bình của 3 lần thí nghiệm ±
Dựa vào 2 đồ thị hình 3.8a và 3.8b cĩ thể nhìn thấy rõ là các phân đoạn chia làm 2 nhĩm khác nhau, nhĩm cĩ hoạt tính cao là nhĩm cĩ các phân đoạn 20% (40%), 20% ( 50%), 20% (60%) nhĩm cịn lại là các phân đoạn 30% (40%), 30% (50%), 30% (60%), 40% (60%), cụ thể hơn dựa vào kết quả phân tích số liệu (phụ lục 3b). Đồ thị hình 3.8a, dựa vào kết quả phân tích số liệu (phục lục 2b), lấy khả năng khử gốc tự do DPPH của phân đoạn 20% (40%) làm chuẩn để so sánh khả năng khử gốc tự do DPPH của các phân đoạn cịn lại thì được kết quả như sau: phân đoạn 20% (50%), 20% (60%) khử được nhiều gốc tự do hơn phân đoạn 20% (40%) lần lượt là 1.8833 và 1.7867 mM DPPH với trị số P <0.05; các phân đoạn cịn lại là 30% (40%), 30%