Nghiên cứu thu nhận polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa và ức chế enzyme α glucosidase của một số loài rong biển tại khánh hòa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM --- o0o --- NGUYỄN THỊ MINH NGHIÊN CỨU THU NHẬN POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME  -GLUC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

- o0o -

NGUYỄN THỊ MINH

NGHIÊN CỨU THU NHẬN POLYPHENOL,

HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ

ENZYME  -GLUCOSIDASE CỦA MỘT SỐ

LOÀI RONG BIỂN TẠI KHÁNH HÒA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

GVHD: TS NGUYỄN THẾ HÂN

KHÁNH HÒA -06/ 2015

LỜI CẢM ƠN

Đồ án tốt nghiệp này là thành quả trong 4 năm học tập, trau dồi kiến thức tại Trường Đại học Nha Trang và là dấu ấn quan trọng đánh dấu bước chuyển tiếp từ một sinh viên trở thành kỹ sư

Để hoàn thành tốt Đồ án này, em đã nhận rất nhiều sự hỗ trợ, giúp đỡ và chỉ bảo tận tình từ thầy cô, bạn bè và gia đình

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn đến thầy giáo, T.S Nguyễn Thế Hân,

người đã tận tình hướng dẫn, quan tâm và chỉ bảo trong suốt quá trình thực hiện Đồ án tốt nghiệp

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã giảng dạy và trang bị cho em nhiều kiến thức cơ sở và chuyên môn trong suốt

Tuy có nhiều nỗ lực, cố gắng nhưng không tránh khỏi sai sót trong khi thực hiện

Đồ án này Em rất mong nhận được sự đóng góp từ các thầy cô, bạn bè để đề tài của em

có thể hoàn thiện với chất lượng tốt hơn

Nha Trang, tháng 06, năm 2015

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Minh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN I DANH MỤC HÌNH V DANH MỤC BẢNG VI DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VII

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4

1.1 Tổng quan về nguồn nguyên liệu rong biển 4

1.1.1 Phân loại rong biển 4

1.1.2 Sự phân bố và nguồn lợi rong biển 4

1.1.3 Thành phần hóa học của rong biển 7

1.2 Các hợp chất có hoạt tính sinh học của rong biển 8

1.2.1 Polyphenols 9

1.2.2 Flavonoids 9

1.2.3 Polysaccharide 10

1.2.4 Alkaloids 11

1.3 Bệnh đái tháo đường 11

1.3.1 Khái niệm về bệnh đái tháo đường 11

1.3.2 Phân loại bệnh đái tháo đường 11

1.3.3 Biến chứng của bệnh đái tháo đường 12

1.3.4 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam 13

1.4 Tổng quan về enzyme -glucosidase và chất ức chế enzyme -glucosidase 14

1.4.1 Tổng quan về enzyme -glucosidase 14

1.4.2 Tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase 15

1.4.2.1 Các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase tổng hợp 16

1.4.2.2 Các hợp chất ức chế enzym α-glucosidase cô lập tự nhiên 18

1.5 Tổng quan vể tình hình nghiên thuộc lĩnh vực của đề tài trong và ngoài nước 19

1.5.1 Ở Việt Nam 19

1.5.2 Trên thế giới 20

1.6 Các phương pháp chiết 21

1.6.1 Cơ sở của quá trình tách chiết 21

1.6.2 Các phương pháp tách chiết bằng dung môi 22

1.6.3 Một số phương pháp tách chiết khác 23

1.6.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 24

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 28

2.2.1 Thiết bị 28

2.2.2 Dụng cụ 28

2.2.3 Hóa chất 28

2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 28

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 28

2.3.2 Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong biển 31

2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong biển 31

2.3.4 Thí nghiệm xác định tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH và khả năng ức chế enzyme α-glucosidase 35

2.4 Phương pháp phân tích 36

2.4.1 Phương pháp xác định độ ẩm 36

2.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số 36

2.4.3 Phương pháp xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 36

2.4.4 Phương pháp xác định tổng năng lực khử 37

2.4.5 Phương pháp xác định khả năng ức chế enzyme α – glucosidase 37

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong biển 39

3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong biển 39

3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong biển 41

3.1.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong biển 44

3.2 Khả năng chống oxy hóa và khả năng ức chế enzyme α-glucosidase liên quan

đến bệnh đái tháo đường tuýt 2 của dịch chiết rong biển 48

3.2.1 Khả năng chống oxy hóa 48

3.2.2 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase 51

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể 15

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Acarbose 16

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Voglibose 17

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Miglitol 17

Hình 2.1 Nguyên liệu rong biển, rong mơ S.microcystum (A), S.oligocystum (B), rong nho Caulerpa lentillifera (C) và rong mứt Porphyta (D) 27

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát 29

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng chất khô của rong biển 31

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết methanol đến hàm lượng polyphenol tổng số 32

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số 33

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số 34

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH và khả năng ức chế enzyme α-glucosidase 35

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của rong mơ S.microcystum (A), rong mơ S.oligocystum (B), rong mứt Porphyta (C) và rong nho Caulerpa lentillifera (D) 42

Hình 3.2 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của rong mơ S.microcystum (A), rong mơ S.oligocystum (B), rong mứt Porphyta (C) và rong nho Caulerpa lentillifera (D) 47

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nguồn lợi rong biển trên thế giới, sản lượng thu hoạch và tiềm năng sản xuất

6 Bảng 1.2 Diện tích các vùng có thể quy hoạch nuôi trồng rong biển ở 1 số tỉnh duyên

hải Việt Nam 7 Bảng 1.3 Thành phần hóa học từ một số loại rong vùng ven biển Madapam dọc theo bờ

biển Đông Nam của Ấn Độ 8 Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết methanol đến hàm lượng polyphenol

tổng số của dịch chiết rong biển 39 Bảng 3.2 Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết trong nước rong mơ

S.microcystum và S.oligocystum 48 Bảng 3.3 Tổng năng lực khử của dịch chiết trong nước rong mơ S.microcystum và

S.oligocystum 49

Bảng 3.4 Khả năng ức chế enzyme α-glucosidase của dịch chiết trong nước rong mơ

S.microcystum và S.oligocystum 51

LỜI MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Đái tháo đường (ĐTĐ) là một dạng nội tiết do rối loạn chuyển hóa cacbohydrate khi hooc-mon insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao Hiện nay, bệnh đái tháo đường ngày càng gia tăng và

nó không còn là vấn đề của một quốc gia mà là vấn nạn đe dọa sức khỏe của toàn cầu Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới năm 1995 cả thế giới có 135 triệu người mắc bệnh chiếm 4% dân số thế giới Đến năm 2010 có 221 triệu người và dự báo đến năm 2025 là 330 triệu người mắc căn bệnh này (chiếm 5,4%) Cũng theo thống kê của WHO, cứ 30 giây lại có 1 người mắc bệnh ĐTĐ bị cắt cụt chi Mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do biến chứng của mắt, mỗi năm có 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên quan đến ĐTĐ Như vậy ĐTĐ đang là gánh nặng thực sự cho sự phát triển kinh tế,

xã hội và sức khỏe con người toàn thế giới trong thế kỷ XXI [2] Tại Việt Nam, theo công bố của Bệnh viện Nội tiết Trung ương, tỷ lệ người mắc bệnh đái tháo đường năm

2012 là 5,7% trong khi năm 2002 tỷ lệ này mới chỉ khoảng 2,7% dân số Đây là mức gia tăng đáng báo động vì trong vòng 10 năm, tỷ lệ người mắc bệnh đã tăng lên gấp đôi

Nếu không được điều trị tốt thì bệnh đái tháo đường sẽ gây ra nhiều biến chứng

có thể làm bệnh nhân bị tàn phế thậm chí tử vong như hạ đường huyết, tăng nguy cơ nhồi máu cơ tim, đột quỵ, tai biến mạch máu não và mạch máu ngoại biên đi đến đoạn chi Bệnh đái tháo đường còn gây các biến chứng về thận, biến chứng mắt và biến chứng thần kinh

Trong cơ thể, màng tế bào ruột non tiết ra enzyme -glucosidase thủy phân các oligosaccharide (đường đa) thành glucose và thẩm thấu vào máu qua ruột non để nuôi các tế bào của cơ thể Khi cơ thể rối loạn chuyển hóa carbohydrate thì lượng đường trong máu cao, đây là một trong những nguyên nhân gây ra bệnh đái tháo đường Do vậy, một trong những nguyên tắc sử dụng để ngăn ngừa và điều trị bệnh là sử dụng những chất có khả năng ức chế hoạt động của các enzyme chuyển hóa carbohydrate như

-glucosidase Nhiều loại thuốc trong nhóm này đã được bào chế và sử dụng cho bệnh đái tháo đường như Acarbose và Voglibose Tuy nhiên, các nhà khoa học đã chứng minh rằng việc sử dụng những loại thuốc này gây ra nhiều tác dụng phụ cho cơ thể như tiêu

chảy, đầy hơi, các bệnh về gan,… Do đó, nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu để tìm kiếm các chất có khả năng ức chế enzyme -glucosidase có nguồn gốc từ tự nhiên để thay thế hoặc hỗ trợ trong điều trị bệnh ĐTĐ của những loại thuốc đang đang sử dụng

Rong biển là một nhóm thực vật bậc thấp sống ở biển, là một nguồn tài nguyên biển quan trọng Theo thống kê, Việt Nam có khoảng 794 loài rong phân bố ở vùng biển miền Bắc 310 loài, miền Nam 484 loài và 156 loài tìm thấy ở cả 2 miền Trong đó 90 loài đã sử dụng, cho chế phẩm công nghiệp 24 loài, dược liệu 18 loài, thực phẩm 30 loài, thức ăn gia súc 10 loài và phân bón 8 loài Sản lượng tươi của Khánh Hòa đạt khoảng 300 tấn/ngày [3] Tuy nhiên, rong biển vẫn chưa được khai khác triệt để, chưa tương xứng với tiềm năng vốn có và với sự suy giảm của đất trồng nông nghiệp, rong biển được xem như là nguồn thực phẩm tương lai của loài người Các hoạt tính đã được xác định trong rong biển bao gồm khả năng chống oxy hóa, khả năng kháng tế bào ung thư, khả năng hạ huyết áp, khả năng kháng viêm và ngăn ngừa bệnh đái tháo đường

Nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học đã được tìm thấy trong rong biển như: alkaloids,

anthraquinones, carbohydrates, flavonoids, glycosides, saponins, steroids, phenols, terpenoids và tannins 49 Một số nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng dịch chiết của rong biển và một số hợp chất thu nhận từ rong biển có khả năng ức chế enzyme -glucosidase Lordan và cộng sự (2013) đã chiết xuất các chất giàu phenolic từ nguồn

rong biển ăn được, tảo nâu (Ascophyllum nodosum) ở vùng biển Iceland, có khả năng

ức chế enzyme -glucosidase và enzyme - amylase [35] Kumar và cộng sự (2012) đã nghiên cứu khả năng ức chế -glucosidase và enzyme - amylase từ 4 loài rong biển G edulis, S polycystum, U lactuca và G.corticata ở vịnh Mannar Tất cả 4 loại rong này

đều cho khả năng ức chế enzyme mạnh [33] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào đánh giá tiềm năng ức chế enzyme liên quan đến bệnh đái tháo đường của một

số loài rong khai thác, nuôi trồng ở vùng biển Khánh Hòa, cũng như các vùng biển khác

ở Việt Nam

Xuất phát từ những thực trạng trên, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu thu nhận

loài rong biển tại Khánh Hòa”

2 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

- Thành công của đề tài sẽ cung cấp dữ liệu khoa học về hàm lượng polyphenol,

khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme -glucosidase của một số loài rong biển tại vùng biển Khánh Hòa Dữ liệu khoa học này là tài liệu tham khảo cho nhà khoa học và nhà sản xuất, chế biến rong biển

- Thành công của đề tài sẽ là cơ sở để phát triển một số thực phẩm chức năng có

khả năng điều trị bệnh đái tháo đường và chống oxy hóa từ rong biển, qua đó góp phần thúc đẩy nghề nuôi trồng, khai thác và chế biến rong biển ở Khánh Hòa

3 Mục tiêu của đề tài

- Xác định được điều kiện chiết (loại dung môi, nhiệt độ và thời gian) thích hợp để thu nhận polyphenol từ một số loài rong tại vùng biển Khánh Hòa

- Xác định được khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme -glucosidase của

dịch chiết từ 02 loài rong cho hàm lượng polyphenol cao nhất

4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết (methanol/nước) đến hiệu

quả thu nhận polyphenol từ một số loài rong biển tại Khánh Hòa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hiệu quả thu nhận polyphenol từ

một số loài rong biển tại Khánh Hòa

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết chiết đến hiệu quả thu nhận

polyphenol từ một số loài rong biển tại Khánh Hòa

- Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme -glucosidase của dịch

chiết từ 02 loài rong có hàm lượng polyphenol cao nhất

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1.1 Phân loại rong biển [10]

Rong biển hay tảo biển có tên khoa học là marine-algae, marine plant hay seaweed Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước Chúng có thể

là đơn bào, đa bào sống thành quần thể Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt

Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau:

1, Ngành rong lục (Chlorophyta)

2, Ngành rong trần (Englenophyta)

3, Ngành rong giáp (Pyrophyta)

4, Ngành rong khuê (Bacillareonphyta)

5, Ngành rong kim (Chrysophyta)

6, Ngành rong vàng (Xantophyta)

7, Ngành rong nâu (Phaecophyta)

8, Ngành rong đỏ (Rhodophyta)

9, Ngành rong lam (Cyanophyta)

Trên thế giới có khoảng 600 loài rong biển đã được xác định Trong 9 ngành rong

nói trên, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong lục (Chlorophyta), rong nâu (Phaecophyta) và rong đỏ (Rhodophyta)

Ngành rong lục: có khoảng 360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn sống trong nước

ngọt Ngành rong nâu: có trên 190 chi, hơn 900 loài phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm Ngành rong đỏ: có 2.500 loài gồm 400 chi, phần lớn sống ở biển

1.1.2 Sự phân bố và nguồn lợi rong biển

1.1.2.1 Sự phân bố [7]

Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triều sâu và vùng biển cạn, Rong đỏ và rong nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản

lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống Các yếu

tố như độ ẩm của không khí, lượng mưa không quan trọng đối với rong biển nhưng các yếu tố sinh thái biển lại có ảnh hưởng đến đời sống rong biển như: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sáng, độ muối, độ pH, muối dinh dưỡng, khí hòa tan, mức triều, sóng, gió, hải lưu

Nguồn lợi rong biển trên thế giới là rất lớn, song sản lượng rong được khai thác

và sử dụng hàng năm không đều Indonesia đã trở thành nhà sản xuất nguyên liệu rong

biển lớn nhất thế giới đối với loại Eucheuma sp Sản lượng rong biển của Indonesia năm

2007 đạt 94.000 tấn gồm loại Eucheuma denticulatum và Gracilaria Trong đó, loại Eucheuma denticulatum được sử dụng làm mỹ phẩm và nguyên liệu dược phẩm, Gracilaria làm chất gelatin Hàn quốc là nước cung cấp nguyên liệu sản xuất agar với

khối lượng lớn nhất thế giới chiếm 52%.[7]

Châu Á là khu vực cung cấp rong đỏ Nguồn lợi rong nâu chủ yếu tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ Canada tập trung hơn 75% khối lượng rong nguyên liệu sản xuất alginate Trong khi đó, khối lượng rong nâu Châu Á chỉ chiếm khoảng 5% [6] Theo tổ chức nông lương (FAO) của Liên Hiệp Quốc ước tính mỗi năm trên thế giới rong nâu được khai thác 1,3 triệu tấn Sản lượng này có thể tăng lên 12 lần nếu tiếp tục khai thác dọc bờ Đại Tây Dương kể cả ven biển và Địa Trung Hải

Nguồn lợi rong biển trên thế giới, sản lượng thu hoạch và tiềm năng sản xuất giới được phân bố được thể hiện ở Bảng 1.1

Bảng 1.1 Nguồn lợi rong biển trên thế giới, sản lượng thu hoạch và tiềm năng

sản xuất [10]

Tên khu vực

Sản lượng thu hoạch (nghìn tấn)

Nguồn lợi (nghìn tấn)

Sản lượng thu hoạch (nghìn tấn)

Nguồn lợi (nghìn tấn)

Trung tâm Tây Đại Tây

Trung tâm Đông Đại Tây

Trung tâm Tây Thái Bình

Trung tâm Đông Thái Bình

Đông Nam Thái Bình

-: Chưa xác định

Ở nước ta có khoảng 794 loài rong biển, phân bố ở vùng biển miền Bắc 310 loài, miền Nam 484 loài, 156 loài tìm thấy ở cả 2 miền Trong đó, các đối tượng quan trọng

là: rong câu (Gracilaria), rong mơ (Sargassum), rong đông (Hypnea), rong mứt (Porphyza) và rong bún (Enteromorpha) [10]

Nguồn rong trồng chủ yếu là các loại rong đỏ như: rong câu chỉ vàng

(G.verrucosa), rong câu cước (G.acerosa), rong câu (G.asiatica và G.heteroclada), rong sụn (Alvarezii) Trong đó, G.verrucosa và G.asiatica được trồng ở vùng nước lợ từ năm

1970 ở phía Bắc, phía Nam từ năm 1980 với tổng diện tích 1000 ha, đạt sản lượng khoảng 1500-2000 tấn khô/năm Rong câu cước cũng được trồng ở vùng thuỷ triều, vịnh, ao với diện tích khoảng 100 ha, sản lượng khoảng 150-200 tấn khô/năm

Rong biển ở Khánh Hòa có ở nhiều vùng như Hòn Chồng, Bãi Tiên, bán đảo Cam Ranh, Hòn Tre và một số đảo khác Trong đó, vùng Hòn Chồng và Bãi Tiên là 2 vùng tiếp giáp nhau có các điều kiện thuận lợi cho rong mọc với mật độ khá dày đặc, mật độ khoảng 5,5 kg/m2 Hòn Chồng và Bãi Tiên là vùng rong lớn, dễ khai thác nhất,

nó nằm ngay trên đường quốc lộ và rong mọc tập trung gần bờ [3]

Bảng 1.2 dưới đây thể hiện diện tích có thể quy hoạch nuôi trồng rong biển ở một

số tỉnh duyên hải Việt Nam Theo quy hoạch thì Khánh Hòa là vùng có diện tích nuôi rong lớn nhất so với các vùng còn lại

Bảng 1.2 diện tích các vùng có thể quy hoạch nuôi trồng rong biển ở 1 số tỉnh

duyên hải Việt Nam

Vùng quy hoạch Diện tích các vùng có thể quy hoạch nuôi trồng (ha)

1.1.3 Thành phần hóa học của rong biển

Thành phần hóa học của rong biển đã được nhiều nhà khoa học trên thế giới phân tích Các nghiên cứu chỉ ra rằng thành phần hóa học của rong biển không phụ thuộc vào loài mà còn chịu ảnh hưởng bởi địa lý và mua vụ thu hoạch

Manivannan và cộng sự (2008) [36] đã nghiên cứu thành phần hóa học của 12 loài rong, trong đó có 4 loài rong lục, 5 loài rong nâu và 3 loài rong đỏ ở vùng ven biển Mandapam (Ấn Độ) Kết quả cho thấy hàm lượng protein cao nhất được tìm thấy trong

rong Padina gymnospora (17,08%), thấp nhất là rong Ulva lactuca (3,25%) Hàm lượng

carbohydrate cao nhất ở rong Enteromorpha intestinalis (23,84%) Trong khi đó, rong Enteromorpha clathrata có hàm lượng lipid cao nhất (4,6%) (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Thành phần hóa học từ một số loại rong vùng ven biển Madapam dọc

theo bờ biển Đông Nam của Ấn Độ [36]

có hàm lượng lipid rất thấp (ít hơn 2%) nhưng axit licozopentae khá cao tới 20-25% tổng số lượng các axit béo Trong rong biển còn tìm thấy nhiều fucosterol và nhiều nguyên tố vi lượng khác Rong biển có chứa nhiều iod, iod hữu cơ có giá trị trong y học

Do vậy, rong nâu còn được dùng làm thuốc phòng chống bướu cổ Thí dụ, 1 kg rong

laminaria chứa 1 lượng iod bằng lượng iod có trong 100.000 lít nước biển Trong 10 g rong khô loài Alginatearia esculenta chứa 1 lượng vitamin E bằng 100 g củ cải đường, trong 10 g rong khô Gracilaria sản phẩm chứa 1 lượng canxi có trong 1 cốc sữa [10]

Rong biển chứa rất nhiều hợp chất sinh học như polyphenols, alkaloids, flavonoids, polysaccharide, anthraquinones, terpenoids và tannins Tất cả các hợp chất

này đều là những chất có hoạt tính sinh học, có nhiều tác dụng trong việc chống oxy hóa, ngăn ngừa các bệnh ung thư, đái tháo đường, kháng vi khuẩn, virus,

1.2.1 Polyphenols

Polyphenols là một hợp chất có trong thực vật tự nhiên mà nó có thể cho ta màu

và mùi vị Polyphenols cấu thành từ các vòng benzen với vị trí các gốc OH khác nhau

sẽ chia thành nhiều nhóm polyphenol khác nhau Polyphenols chia thành 2 nhóm là nhóm non-flavonoid và nhóm flavonoid

Hoạt tính sinh học của polyphenols được công bố nhiều nhất là hoạt tính chống oxy hóa Hoạt tính này được nghiên cứu thông qua khảo sát quét các gốc DPPH, gốc hydroxy (-OH), các anion như superoxide anion (O2), khử sắt (III), tạo phức chelat với ion hóa trị (II) và oxy hóa lipid của chúng

Gần đây, đã có một số công trình công bố về hoạt tính chống viêm nhiễm, kháng

vi sinh vật, chống dị ứng, kháng virus HIV và điều hòa đường huyết Theo nghiên cứu

của Nagayama và cộng sự (2002) dịch chiết giàu polyphenol từ rong Euklonia kurume

ở Nhật Bản có khả năng kháng một số loài vi sinh vật Kang và cộng sự (2004) đã chứng

minh được rằng dịch chiết chứa polyphenol từ rong Euklonia cava ở vùng biển Hàn

Quốc có khả năng chống viêm nhiễm Lordan và cộng sự (2013) đã chiết xuất các chất

giàu phenolic từ nguồn rong biển ăn được, tảo nâu (Ascophyllum nodosum) ở vùng biển

Iceland có khả năng hạn chế enzyme -glucosidase và enzyme -amylase [35] Hàm

lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của hai loài rong nâu T conoides

và T ornata ở vùng biển Ấn Độ được Chakraborty và cộng sự nghiên cứu vào năm

2013 Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm khả năng bắt gốc tự do DPPH, 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiozoline-6-sulfonic axit diammonium salt (ABTS) và H2O2/HO, khóa ion

Fe (2+) và tổng năng lực khử Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của rong T conoides cao hơn đáng kể so với rong T ornata Từ kết quả đạt được tác giả kết luận

rằng dịch chiết của rong hai loài rong nâu này có thể sử dụng như thành phần của thực phẩm chức năng, giúp tăng cường sức khỏe cho con người [18]

1.2.2 Flavonoids

Flavonoids là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch

3 carbon

Một số tài liệu gần đây có nói đến khả năng chống oxy hóa, chống ung thư và khả năng kháng khuẩn của một số hợp chất flavonoids từ rong biển Farasat và cộng sự

(2014) đã nghiên cứu hàm lượng flavonoids từ 4 loài rong lục (Ulva clathrata (Roth), Ulva linza linnaeus, Ulva flexuosa Wulfen và Ulva intestinalis linnaeus) tại vùng biển

phía Bắc ở Vịnh Ba Tư-Iran Hàm lượng flavonoids tổng số của những loài rong này dao động từ 33,10 đến 8,05 mg RE/g rong khô Các hợp chất flavonoids là thành phần chính đóng góp vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết những loài rong này [22] Lalopua và cộng sự (2011) nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của hợp chất flavonoid

từ loài rong đỏ Kappaphycus alvarezii ở vùng biển Iceland Kết quả cho thấy hàm lượng

flavonoid thu được từ loài rong này khi chiết bằng dung môi hexan là cao nhất (15,93%)

và khả năng khử gốc tự do cao nhất có thể đạt được trong 5µg/ml dịch chiết hexan [34]

Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của 2 loài rong biển Ulva lactuca và Sargassum wightii ở vùng biển Rameshwaram Ấn Độ chỉ ra rằng hàm lượng flavanoids có khả năng

chống oxy hóa tương ứng đối với 2 loài rong này là 2,02 ± 0,07 mg GAE/g và 1,16 ± 0,11 mg GAE/g rong khô theo Meenakshi và cộng sự (2009) [38]

1.2.3 Polysaccharide

Polysaccharide là một phức hợp carbohydrate, là polymer được tạo từ các monosaccharide nhờ liên kết glycoside, có kích thước lớn và thường phân nhánh Chúng được chia làm 2 nhóm là polysaccharide đồng hình (chỉ chứa một loại monomer duy nhất) và polysaccharide dị hình (là những polymer phức tạp được tạo ra từ nhiều loại monomer khác nhau Dẫn xuất của các monomer và các chất khác, có nhiều trong tự nhiên) Polysaccharide có mặt ở hầu hết các loại thực vật trong đó có rong biển

Stefan Kraan (2012) đã nghiên cứu hợp chất polysaccharide tổng số từ một số loài rong biển ở vùng biển phía Tây Bắc Châu Âu Kết quả chỉ ra rằng tất cả các loài rong mà ông nghiên cứu đều chứa các hợp chất polysaccharide Trong đó hàm lượng

polyssacchaide tổng số của rong Laminaria là 38%, rong Rubus là 62%, Ascophyllum

là 42-64 %, Undaria là 35-45%, Sargassum là 4%, Ulva là 15-65%, Porphyta là 40%

và Gracilaria là 36% [46] Nhiều hoạt tính sinh học của polysaccharide được biết đến

như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa Các hợp chất polysaccharide được tìm thấy trong rong biển bao gồm: ulvans, alginate, fucoidan, Laminarin, carageenan và oligosaccharide các hợp chất này được biết đến với khả năng kháng nấm

và kháng khuẩn (Vera J và cộng sự, 2011) [47] Các hợp chất polysaccharide cũng được

biết đến với khả năng chống oxy hóa Chao-Yan Zhang và cộng sự (2012) đã nghiên

cứu hoạt tính chống oxy hóa của polysaccharide từ loài rong nâu Sargassum graminifolium (Turn.) Kết quả cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH ở IC50 là 0,6 mg/ml[19]

1.2.4 Alkaloids

Alkaloids là hoạt chất có nguồn gốc từ sinh vật, thường là thực vật Phân tử alkaloids luôn luôn có chứa C, H, N và rất hay gặp oxy Có một số thì chứa lưu huỳnh Trong alkaloids thường gặp là amin bậc 1, bậc 2 hay bậc 3 Thông thường nitơ tham gia vào nhân dị vòng nhưng đôi khi cũng có thể ở ngoài vòng Alkaloids có nhiều ở thực vật và có nhiều hoạt tính sinh học Các hợp chất alkaloids cũng có nhiều trong rong biển

và được chia làm 3 nhóm là alkaloids phenylethylamine; idole, ancaloit và một số alkaloids khác (Guven K.C và cộng sự (2010) [25] Tyramine là một loài alkaloids được

Kneifel H và cộng sự (1977) tìm thấy trong loài rong nâu là Laminaria saccharina và

2 loài rong đỏ là Chondrus crispus và Polysiphonia urceolata [31] Theo Miki Y và

cộng sự (2006) thì các hợp chất alkaloid đều có khả năng kháng vi sinh vật chống lại vi

khuẩn Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus và Mycobacterium smegmatis Ngoài ra

chúng cũng đều có khả năng chống oxy hóa [39]

1.3.1 Khái niệm về bệnh đái tháo đường

Bệnh đái tháo đường, còn gọi là bệnh tiểu đường là một bệnh do rối loạn chuyển hóa cacbohydrate khi hooc-mon insulin của tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao Trong giai đoạn mới phát thường làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước [2]

1.3.2 Phân loại bệnh đái tháo đường [1], [2]

Bệnh đái tháo đường được chia thành 3 loại: Bệnh đái tháo đường tuýt 1, tuýt 2

và bệnh đái tháo đường thai kỳ

- Bệnh đái tháo đường tuýt 1

Tuýt đái tháo đường này thường ảnh hưởng đến trẻ em nhưng cũng có thể xảy ra

ở người lớn Đái tháo đường tuýt 1 thì cơ thể không sản xuất insulin Do hệ thống miễn dịch của cơ thể bị nhầm lẫn đã tấn công các tế bào trong tuyết tụy làm cho tế bào của tuyết tụy không sản xuất được insulin Khi không có insulin tế bào sẽ không sử dụng được glucose, do đó glucose trong máu sẽ rất cao Bệnh nhân phải tiêm insulin để sống

- Bệnh đái tháo đường tuýt 2

Đây là dạng đái tháo đường thường gặp nhất Thông thường đối với bệnh đái tháo đường tuýt 2 thì cơ thể vẫn còn sản xuất insulin nhưng các tế bào không thể sử dụng nó Điều này được gọi là đề kháng insulin Theo thời gian đường huyết sẽ tăng cao trong máu Béo phì và ít vận động làm tăng nguy cơ phát triển bệnh đái tháo đường tuýt 2

- Bệnh đái tháo đường thai kỳ

Đây là dạng đái tháo đường xảy ra ở một số phụ nữ mang thai và chấm dứt sau khi sinh Phụ nữ bị đái tháo đường thai kỳ có thể phát triển thành đái tháo đường tuýt 2 sau này

1.3.3 Biến chứng của bệnh đái tháo đường [1]

Nếu không được điều trị tốt, đái tháo đường gây ra nhiều biến chứng có thể làm bệnh nhân tàn phế, thậm chí tử vong

 Biến chứng cấp tính: Khi lượng đường trong máu tăng cao thì người bệnh có thể

bị hôn mê nhiễm cetone hay hôn mê do tăng áp lực thẩm thấu Nếu không điều trị kịp thời có thể dẫn đến tử vong

- Hạ đường huyết: Là biến chứng cấp tính, thường do quá liều insulin gây nên hoặc

do người bệnh nhịn đói, kiêng khẻm quá mức hay do uống nhiều rượu Nếu không điều trị kịp thời có thể bị hôn mê và dẫn đến tử vong

- Biến chứng thần kinh: Biến chứng thần kinh ngoại biên do đái tháo đường gây mất cảm giác ở chân, tay hay dị cảm, tê, gây đau nhức, là nguyên nhân của nhiễm trùng chân đưa đến đoạn chi

1.3.4 Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và Việt Nam

Con số ở Bảng 1.4 Thể hiện tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường tuýt 1 và tuýt 2 của một số quốc gia trên thế giới Theo thống kê thì tỷ lệ mắc bệnh đái tháo đường tuýt 2 ở các nước này là rất lớn Trong đó, Ấn Độ và Trung Quốc là 2 quốc gia có dân số đông nhất và số người mắc bệnh đái tháo đường là nhiều nhất

Bảng 1.4 Tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ năm 1999 của 1 số quốc gia[2]

(triệu)

Số ca ĐTĐ (triệu) Tỷ lệ (%)

Tuýt 1 (triệu)

Tuýt 2 (triệu)

 Ở Việt Nam

Việt Nam không phải là nước có tỷ lệ bệnh nhân ĐTĐ cao nhất thế giới nhưng lại là quốc gia có tốc độ phát triển nhanh nhất thế giới Bên cạnh đó, biến chứng tim mạch do bệnh ĐTĐ luôn là biến chứng phổ biến và là nguyên nhân gây đột quỵ và tử vong hàng đầu ở người bệnh ĐTĐ Là một quốc gia đang phát triển nhanh chóng về kinh tế xã hội, cùng với sự thay đổi lối sống đã góp phần làm gia tăng tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tuýt 2 chung của cả thế giới Năm 1990 điều tra tại Hà Nội, Huế, Thành phố Hồ Chí Minh tỷ lệ mắc ĐTĐ tuýt 2 tương ứng là 1,2; 0,96 và 2,52% Năm 2001 điều tra tại

4 thành phố lớn: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng và Thành phố Hồ Chí Minh thì tỷ lệ mắc bệnh là 4,0%, tỷ lệ rối loạn dung nạp glucose máu là 10% Theo điều tra quốc gia về tỷ

lệ ĐTĐ năm 2008, tỷ lệ bệnh ĐTĐ ở các đối tượng 30-64 tuổi tại các thành phố lớn là 7-10 % Như vậy chỉ sau 10 năm tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tuýt 2 đã gia tăng trên 300% [1] Phần lớn người bệnh phát hiện và điều trị bệnh muộn Vì vậy, mỗi năm có trên 70 % bệnh nhân không được phát hiện và điều trị kịp thời

Để ngăn ngừa và điều trị bệnh kịp thời thì việc đầu tiên là phải ức chế hoạt động của enzyme -glucosidase để giảm lượng đường có trong máu Vì vậy nhiều loại chất

có tác dụng ức chế enzyme này đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và tìm ra Trong

đó có các chất từ tổng hợp và từ tự nhiên

Enzym α-glucosidase với những tên khác như maltase, glucoinvertase,

glucosidoinvertase, glucosidosucrase, maltase-glucoamylase, nitrophenyl α-D- glucosidase, transglucosidase, α-glucopyranosidase, glucosidoinvertase, α-D- glucosidase, α-glucosidase hydrolase, α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase (nhóm enzyme xúc tác các phản ứng thủy phân)

Thức ăn được hấp thụ vào cơ thể thì các carbohydrate trong thức ăn được thủy phân thành những phân tử đường nhỏ hơn bởi những enzym trong ruột non Tiến trình phân hóa này đòi hỏi tụy tạng phải tiết ra enzym α-amylase dùng để phá vỡ các phân tử carbohydrate lớn thành oligosaccharide Enzym α-glucosidase ở màng ruột non lại tiếp tục phân hoá các oligosaccharide thành các phân tử đường nhỏ hơn nữa rồi mới thẩm thấu vào máu làm cho lượng đường trong máu tăng Bằng cách kiềm chế hoạt động của

enzym α-glucosidase có thể làm giảm sự thủy giải của carbohydrate và làm chậm sự thẩm thấu glucose vào mạch máu

Sự chuyển hóa đường trong cơ thể được thể hiện ở Hình 1.1 [13]

1.4.2 Tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase

Việc tìm kiếm các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase có ý nghĩa rất lớn trong các lĩnh vực như dược phẩm, thực phẩm… Đã có rất nhiều hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên hoặc tổng hợp có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase Tuy

nhiên, những tác nhân ức chế enzyme α-glucosidase tổng hợp hiện nay thường gây nhiều

phản ứng phụ Vì vậy, việc tìm kiếm các hoạt chất có khả năng ức chế enzyme glucosidase vẫn đang được sự quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới Thông thường, việc nghiên cứu các hoạt chất ức chế enzyme α-glucosidase luôn bắt đầu từ các hợp chất có trong tự nhiên vì nguồn dược thảo rất phong phú, đa dạng và ít phản ứng phụ Do đó, các nhà khoa học trên thế giới thường sử dụng những phương pháp sàng lọc

α-Tinh bột

Maltose (glucose + glucose)

α - amylase

glucose glucose

Chất ức chế

Saccharose (glucose + fructose)

Glucose trong máu tăng

Hình 1.1 Sơ đồ chuyển hóa đường trong cơ thể

Hình 1

hoạt tính ức chế enzyme này để định hướng trong nghiên cứu Nhiều nước đã công bố

trên các tạp chí quốc tế về các cây thuốc có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase với

mục đích sử dụng trong lĩnh vực dược phẩm, cũng như đã cô lập được nhiều hợp chất

có hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase từ nguồn dược thảo

1.4.2.1 Các hợp chất ức chế enzyme α-glucosidase tổng hợp [5]

Hiện nay có 3 loại thuốc thuộc nhóm chất ức chế enzym α-glucosidase tổng hợp

bao gồm Acarbose, Voglibose và Miglitol Tác dụng của thuốc là ức chế enzyme α-glucosidase, một enzyme nằm ở tế bào biểu mô niêm mạc ruột non đảm nhận việc

phân giải các đường disaccharide và carbohydrate, vì vậy sẽ làm giảm sự hấp thu đường

tại ruột Các chất này có tác dụng làm sự tiêu hóa các carbohydrate bị chậm lại, do đó

không làm tăng nồng độ đường huyết sau khi ăn

Acarbose là một tetrasacharide, ức chế men α-glucosidase ruột theo thứ tự sau:

glucoamylase > sucrase > maltase > isomaltase

Acarbose làm chậm tiêu hóa và hấp thu carbohydrate Làm glucose máu tăng

chậm hơn sau khi ăn, giảm nguy cơ tăng glucose máu và nồng độ glucose máu ban

ngày ít dao động hơn Acarbose không ức chế men lactase và không gây mất dung nạp

lactose Đồng thời, Acarbose cũng không làm tăng tiết insulin, không gây giảm glucose

máu lúc đói Bên cạnh đó, Acarbose không làm tăng cân Tuy nhiên, nếu dùng thuốc

này không đúng thì nó sẽ gây ra nhiều phản ứng phụ như viêm đường ruột, đầy hơi, hạ

đường huyết,

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Acarbose

- Voglibose

Voglibose là chất ức chế enzym α-glucosidase được cô lập từ Streptocomyces

hygroscopicus thuộc phân loài Limoneus Khi điều trị, voglibose không xâm nhập vào

máu mà chỉ ức chế enzym α-glucosidase Do đó, nó sẽ làm giảm glucose trong máu sau

khi ăn

Tuy nhiên, nếu dùng Voglibose không đúng cách thì nó sẽ gây ra nhiều phản ứng phụ như rối loạn tiêu hóa, rối loạn chức năng gan, thận trầm trọng

- Miglitol: Là dẫn xuất của 1- deoxynojirimycin

Miglitol có tác dụng ức chế có hồi phục men α-glucosidase Cấu trúc của miglitol

tương tự như glucose và được hấp thu gần như hoàn toàn ở phần trên ruột non Tác dụng

ức chế theo thứ tự sau: sucrase > glucoamylase > isomaltase > lactase > trehalace Miglitol không làm mất năng lượng đáng kể, tác dụng tương tự như acarbose Khoảng 60% miglitol được hấp thu sau khi uống nhờ các chất vận chuyển ở ruột, các chất này cũng vận chuyển glucose vì thế sự cạnh tranh vận chuyển đã làm giảm hấp thu glucose làm giảm glucose trong máu Tác dụng phụ chủ yếu ở hệ tiêu hóa tương tự như acarbose

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Voglibose

Hình 1.3 Cấu trúc hóa học của Miglitol

Các chất ức chế enzyme α-glcuosidase từ tổng hợp đều có tác dụng làm giảm lượng đường trong máu sau khi ăn, có tác dụng trong việc điều trị bệnh đái tháo đường Tuy nhiên, nếu sử dụng không đúng cách thì nó sẽ gây ra nhiều tác dụng phụ gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người sử dụng Vì vậy, các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên cần thiết được sử dụng để thay thế cho các chất tổng hợp này

Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ở trong và ngoài nước nghiên cứu về việc sàng lọc các hợp chất từ tự nhiên có khả năng ức chế enzyme -glucosidase Mỗi loài thực vật có thể chứa một hoặc nhiều hoạt chất khác nhau có tác dụng hạn chế tăng glucose trong máu Kumar và công sự (2011) đã chỉ ra rằng nhiều hợp chất được phân lập từ tự nhiên có khả năng ức chế enzyme -glucosidase, bao gồm: flavonoid, alkaloids, phenolic, curcuminoids và terpinoids [32]

 Flavonoids

Khả năng ức chế enzyme -glucosidase từ nấm men và ruột non của chuột 6 nhóm flavonoid đã được nghiên cứu bởi Tadera và cộng sự (2006) Theo đó, 3 hợp chất bao gồm: anthocyanidin, isoflavone, and flavonol ức chế enzyme -glucosidase nấm men với giá trị IC50 nhỏ hơn 15 μM [48] Anurakkun và cộng sự (2007) cũng đã nghiên cứu hợp chất quercetin 3-O-β-d-xylopyranosyl 1,2-β-d-galactopyranoside là một flavonoid từ hoa sữa có khả năng ức chế ezyme maltase với giá trị IC50 là 1,96 mM[14]

Piper umbellatum có thể ức chế enzyme α-glucosidase với giá trị IC50 lần lượt là 98,07, 43,80 và 29,64 mM

Gao và cộng sự (2007) đã nghiên cứu khả năng ức chế enzyme α-glucosidase có

ở động vật có vú từ các loại trái cây sấy khô Terminalia chebula được chiết bằng 70%

methanol ở nhiệt độ phòng Ba hợp chất chebulanin, axit chebulagic và axit chebulinic

với giá trị IC50 tương đương là 690,97, và 36 mM Dịch chiết từ Bergenia cilata ở phân

đoạn 50% methanol đã phân lập được hai hợp chất là galloylepicatechin và galloylcatechin Các hợp chất này đều có khả năng ức chế enzyme α-glucosidase trên thành ruột non của chuột Khả năng ức chế sucrose và maltase của 3-O-galloylepicatechin với giá trị IC50 lần lượt là là 560 và 334 mM và của 3-O-

3-O-galloylcatechin tương ứng là 297 và 150 mM (Bhandari và cộng sự (2008))

 Curcuminoids [32]

Kết quả nghiên cứu của Du và cộng sự (2006) đã chứng minh được

Curcuminoids được phân lập từ Curcuma longa bao gồm curcumin,

demethoxycurcumin và bisdemethoxycurcumin có khả năng ức chế α-glucosidase với giá trị IC50 là 23,0 mM

 Terpinoids [32]

Axit 3b-axetoxy-16b-hydroxybetulinic là một terpinoids được phân lập từ

cây Fagara tessmannii, chất này được chứng minh là một chất ức chế α-glucosidase

mạnh với giá trị IC50 là 7,6 mM Triterpenoid và axit Segetalic saponin cũng được phân

lập từ rễ của cây Gypsophila oldhamiana và chúng đều có khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase với giá trị IC50 khoảng 23,1 ± 1,8 mM

Các nghiên cứu trong nước của Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2011) đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase và thành phần hóa học của cây huyết

rồng hoa nhỏ Satholobus parviflorus (Roxb) Tác giả đã phân lập được 3 hợp chất có

khả năng ức chế mạnh enzyme α-glucosidase là: axit ferulic, axit protocatechuic và epicatechin [11]

1.5 Tổng quan vể tình hình nghiên thuộc lĩnh vực của đề tài trong và ngoài nước 1.5.1 Ở Việt Nam

Hiện nay việc nghiên cứu thu nhận polyphenol và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa, khả năng ức chế enzyme -glucosidase liên quan đến bệnh đái tháo đường tuýt 2

từ các loài thực vật ở Việt Nam đã có Tuy nhiên, hầu hết mới chỉ dừng lại ở các loài thực vật trên cạn và các hợp chất phân lập được cũng không mới so với các loài thực vật

đã nghiên cứu trên thế giới

Nguyễn Thị Thanh Mai và cộng sự (2011) đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme 

-glucosidase và thành phần hóa học của cây huyết rồng hoa nhỏ Satholobus parviflorus

(Roxb) Tác giả đã phân lập được 3 hợp chất có khả năng ức chế mạnh enzyme này là:

axit ferulic, axit protocatechuic và epicatechin Đây là những hợp chất trước đó đã được phân lập ở nhiều loài thực vật khác nhau trên thế giới [11] Tác giả Hà Thị Bích Ngọc (2012) đã điều tra, nghiên cứu một số thực vật ở Việt Nam có tác dụng hỗ trợ điều hòa lượng đường trong máu để ứng dụng cho bệnh nhân đái tháo đường tuýt 2 Tác giả đã xác định được 8/24 mẫu thực vật có tác dụng hạ đường huyết trên chuột nhắt đái tháo đường tuýt 2 gồm: lá vối, nụ vối, dây thìa canh, chó đẻ răng cưa, chè đắng, vỏ thân ổi,

lá tầm gửi trên cây mít và củ chuối hột Đề tài cũng nghiên cứu và bào chế được chế phẩm thivodal có khả năng hạ đường huyết trên chuột ĐTĐ tuýt 2 một cách ổn định [12] Các hợp chất ức chế enzyme -glucosidase được cô lập từ lá cây Sầu Đâu trồng tại tỉnh Ninh Thuận đã được tác giả Nguyễn Thị Như Ý và cộng sự (2011) thực hiện Nhóm tác giả này đã cô lập được 3 hợp chất, trong đó có 2 hợp chất limonoid mới là azadirachtolid D và azadirachtolid E cùng với 1 hợp chất đã biết là azdirachtolid [40] Huỳnh Ngọc Nghiêm Thụy (2011) đã nghiên cứu hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase của một cây thuốc ở An Giang và thành phần các hoạt chất của thân cây Núc Nác

Oroxylum indicum (L.) Kurz Tác giả đã chỉ ra rằng hầu hết tất cả các loại cây khảo sát

và nghiên cứu đều có khả năng ức chế enzyme -glucosidase [13] Đặng Xuân Cường

và cộng sự (2013) đã nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của một số loài rong

nâu Sargassum ở Khánh Hòa: S angustifolium, S aemulum, S assimile, S feldmanii và

S ilicifolium Hoạt tính chống oxy hóa dựa trên hoạt tính chống oxy hóa tổng, khử Fe

và DPPH Kết quả cho thấy hàm lượng polyphenol và khử Fe của rong S angustifolium

là cao nhất và ở 5 loài nghiên cứu thì hoạt tính khử Fe thể hiện mạnh hơn các hoạt tính khác [4]

1.5.2 Trên thế giới

Nhiều công trình đã nghiên cứu sử dụng dịch chiết hoặc phân lập các hợp chất

có khả năng chống oxy hóa và ức chế enzyme -glucosidase từ nguồn nguyên liệu tự nhiên Các nhóm chất đã được phân lập bao gồm: flavonoids, alkaloids, phenolic, curcuminoids, terpinoids và anthocyanins (Kumar và cộng sự, 2011) [32] Tuy nhiên, đến nay việc triển khai ứng dụng vào thực tế các nguồn nguyên liệu này còn rất hạn chế

do những nghiên cứu từ quy mô phòng thí nghiệm, trên động vật và lâm sàng trên người chưa thực hiện một cách hệ thống Tiềm năng ứng dụng sản phẩm từ tự nhiên còn rất lớn Gần đây, Hyun và cộng sự (2015) [27] đã đánh giá khả năng ức chế enzyme -

nghiên cứu cho thấy dịch chiết trong methanol và phân đoạn ethyl acetate từ loại cỏ này

có khả năng ức chế enzyme -glucosidase rất mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 9,6 và 5,0

g/ml Tác giả kết luận rằng cỏ dâu quạ có thể sử dụng để hỗ trợ điều trị nhiều bệnh tật cho con người Tadera và cộng sự (2006) [48] đã so sánh hoạt tính ức chế enzyme -glucosidase có nguồn gốc từ nấm men và thành ruột non của chuột của 6 flavonoid Kết quả cho thấy enzyme -glucosidase bị ức chế mạnh bởi 3 nhóm chất là: anthocyanidin, isoflavone và flavonol Tác giả kết luận rằng, cấu trúc phân tử của nhóm chất này có ảnh hưởng lớn đến khả năng ức chế hoạt động của enzyme

Rong biển là nguồn thực phẩm tương lai của loài người Gần đây, nhiều nhà khoa học đã quan tâm đến các chất có hoạt tính sinh học từ rong biển, các hoạt tính đã được xác định trong rong biển bao gồm khả năng chống oxy hóa, khả năng kháng tế bào ung thư, khả năng hạ huyết áp, khả năng kháng viêm và ngăn ngừa bệnh đái tháo đường Han Nguyen và cộng sự (2012) đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa, kháng enzyme

cholinesterase và tyrosinase từ dịch chiết của loài rong đỏ Grateloupia Lancifolia bằng

các dung môi nước, diethyl ether và methanol Kết quả cho thấy dịch chiết từ dung môi diethyl ether cho hàm lượng polyphenol cao nhất Hoạt tính sinh học của các dịch chiết

từ các dung môi đều cao hơn α-tocopherol [26] Farideh Namvar và cộng sự (2013) đã

nghiên cứu chiết tách polyphenol từ rong Sargassum muticum bằng dung môi methanol,

kết quả hàm lượng polyphenol rất cao với 78.95 ± 4.33 mg GAE/g nguyên liệu khô Hoạt tính chống oxy hóa được xác định theo phương pháp FRAP cho kết quả khả năng chống oxy hóa cũng rất mạnh [23] Lordanvà cộng sự (2013) đã chiết xuất các chất giàu

phenolic từ nguồn rong biển ăn được, tảo nâu (Ascophyllum nodosum) ở vùng biển

Iceland, có khả năng hạn chế enzyme -glucosidase và enzyme - amylase [35] Tuy nhiên, cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào đánh giá tiềm năng ức enzyme liên quan đến bệnh đái tháo đường của một số loài rong khai thác, nuôi trồng ở vùng biển Khánh Hòa, cũng như các vùng biển khác ở Việt Nam

1.6 Các phương pháp chiết

1.6.1 Cơ sở của quá trình tách chiết

Quá trình tách chiết còn gọi là trích ly là những dung môi hữu cơ hòa tan các chất khác Sau khi hòa tan ta được hỗn hợp dung môi và chất cần tách, đem hỗn hợp này tách dung môi ta sẽ thu được chất cần tách

Quá trình chiết gồm hai giai đoạn như sau, giai đoạn 1: dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu sau đó thấm vào bên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hợp chất Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào Giai đoạn 2: giai đoạn tiếp tục hòa tan các hoạt chất trong ống mao dẫn của nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong [8]

1.6.2 Các phương pháp tách chiết bằng dung môi

Tách chiết bằng dung môi là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất tan trong một pha lỏng vào trong một pha lỏng khác không hòa tan với

nó nhằm chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu

và được gọi là chiết làm giàu Bên cạnh đó việc chiết thành cao dịch thô là vô cùng quan trọng vì khi đó giữ lại được hoạt chất tốt hơn và dễ dàng cho những công đoạn sau 8

1.6.2.1 Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation)

Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian 8 Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới Tuy vậy,

ta không thực hiện liên tục mà mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 12 giờ, cho dung môi bão hòa chảy ra rồi thay thế bằng dung môi mới và tiếp tục quá trình trích ly

1.6.2.2 Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration)

Phương pháp ngâm dầm không hiệu quả gì hơn so với phương pháp ngấm kiệt Ngâm nguyên liệu vào trong bình chứa thủy tinh có nắp đậy Rót dung môi phủ lớp mẫu, để ở điều kiện nhiệt độ theo yêu cầu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên Sau một thời gian dung môi trong bình được đổ ra và rót dung môi mới vào 8

1.6.2.3 Chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu

Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp chiết truyền thống Sự đun hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ, cơ sở của phương pháp này là sự tách các chất có nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng 8

Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng một lượng ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất Sự chiết suất tự động liên tục nên nhanh chóng Tuy nhiên

nhược điểm của phương pháp này là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu nên chỉ thích hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

1.6.2.4 Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước

Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi

có trong nguyên liệu Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước Sau đó, hơi nước sẽ được dẫn sục vào bình chứa có mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ

bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu Dùng ete dầu hỏa hoặc ether ethylic

để trích ly tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có sự phân tách giữa hai pha tinh dầu và nước 8]

1.6.3 Một số phương pháp tách chiết khác

1.6.3.1 Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction)

Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) được xem như là một phương pháp chiết hữu hiệu để thay thế các phương pháp thông thường sử dụng dung môi hữu cơ Phương pháp SFE xảy ra nhanh chóng, tự động, có chọn lọc, không gây cháy nổ và tránh việc

sử dụng một số lượng lớn các dung môi độc hại [8]

1.6.3.2 Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm

Đây là kỹ thuật chiết thay thế rẻ tiền, đơn giản và hiệu quả Sóng siêu âm thường được sử dụng để cải thiện việc chiết lipid, protein và các hợp chất phenolic từ thực vật, quá

trình chiết các hợp chất phenol từ Folium eucommiae có sử dụng sóng siêu âm thu được

hiệu quả cao hơn so với khi chiết bằng cách gia nhiệt hoặc bổ sung enzyme hỗ trợ chiết Sóng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho sự xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn Ngoài ra siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi làm tăng diện tích tiếp xúc của dung môi và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết [8]

Đây là một mảng lớn chưa được khai thác, mặc dù bằng cách sử dụng lò vi sóng

để làm trung gian trong quá trình chiết có thể duy trì các điều kiện nhẹ và đạt được hiệu quả vượt trội khi chiết Dưới tác dụng của lò vi sóng, nước trong thực vật bị nóng lên nhanh chóng, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa dịch chiết vỡ ra, dịch chiết thoát ra ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ ngưng tụ Hiệu suất có thể bằng hoặc cao hơn những phương pháp khác nhưng thời gian chiết rất ngắn Dịch chiết thu được

có mùi tự nhiên Sản phẩm phân hủy trong dịch chiết tự nhiên giảm đi, tiết kiệm thời gian, năng lượng, chi phí Tuy nhiên chỉ áp dụng được cho các nguyên liệu có tuyến dịch chiết nằm ngay sát bề mặt lá Năng lượng chiếu xạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong dịch chiết phân hủy [8]

1.6.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết

1.6.4.1 Dung môi chiết [7]

Qua nhiều nghiên cứu cho thấy rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng tách chiết không giống nhau Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết đó là độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt

- Độ phân cực của dung môi: dung môi không phân cực thì hòa tan những chất không phân cực Dung môi phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực

- Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán các chất cần thiết làm tăng hiệu quả chiết

 Khi lựa chọn dung môi cần đáp ứng các yêu cầu sau đây

- Phải có tính hòa tan chọn lọc, tức là hòa tan tốt các chất cần tách mà không được hòa tan hoặc hòa tan rất ít các chất khác Đây là tính chất cơ bản không thể thiếu được khi lựa chọn dung môi

- Không có tính chất hóa học với các cấu tử của dung dịch

- Không phá hủy thiết bị, dụng cụ

- Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản

- Không độc khi thao tác, không tạo hỗn hợp nổ với không khí và khó cháy

- Đối với hợp chất kém bền ở nhiệt độ cao: Nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một

số chất như vitamin, glycosid, alkaloid

- Đối với tạp: Khi nhiệt độ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng mà độ tan của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp Nhất là đối với một số tạp chất như gôm, chất nhầy, khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất và tinh chế

- Đối với dung môi dễ bay hơi có nhiệt độ sôi thấp: Khi tăng nhiệt độ thì dung môi

sẽ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi

- Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: Khi nhiệt độ tăng thì

độ tan của chúng lại giảm Do đó, để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ

Từ những phân tích trên thì chúng ta phải xem xét và tùy vào từng trường hợp cụ thể

để lựa chọn nhiệt độ chiết cho phù hợp

1.6.4.3 Thời gian chiết

Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp như nhựa, keo ) Do đó, nếu thời gian chiết ngắn sẽ không thể chiết hết các hoạt chất trong nguyên liệu được Nếu thời gian chiết quá dài thì dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản Vì vậy, cần phải lựa chọn thời gian chiết phù hợp [3]

1.6.4.4 Độ mịn của nguyên liệu

Khi kích thước của nguyên liệu chiết thô quá, dung môi sẽ khó thấm ướt được nguyên liệu, hoạt chất khó hòa tan vào dung môi Khi độ mịn của nguyên liệu tăng lên, bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu chiết và dung môi tăng lên Theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán vào dung môi tăng lên Do đó, thời gian chiết sẽ nhanh hơn Tuy nhiên, trong thực tế nếu nguyên liệu chiết quá mịn sẽ gặp một số bất lợi sau:

- Bột nguyên liệu sẽ dính bết vào nhau tạo thành bột nhão vón cục khi đó sẽ làm chậm quá trình chiết Mặt khác, khi lọc dịch chiết thì dịch sẽ chảy chậm hoặc không chảy được vì bột nguyên liệu kết dính vào nhau và do các hạt kích thước nhỏ bít kín lỗ chảy của màng lọc

- Nhiều tế bào thực vật bị phá hủy, dịch chiết bị lẫn nhiều tạp gây khó khăn cho quá trình tinh chế và bảo quản [8]

1.6.4.5 Độ ẩm của nguyên liệu

Độ ẩm của nguyên liệu giảm thì tốc độ trích ly tăng, vì độ ẩm tác dụng với protein

và các chất háo nước khác, ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu sẽ làm chậm quá trình khuếch tán [8]

1.6.4.6 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

Tỷ lệ NL/DM góp phần quan trọng trong việc chiết xuất, tạo điều kiện khuếch tán các chất từ trong tế bào ra ngoài dung môi Nếu tỷ lệ NL/DM quá thấp dẫn đến tốc

độ khuếch tán cơ chất chậm, có thể dẫn đến hiệu suất chiết thấp Ngược lại, thì hiệu suất chiết cao với thời gian ngắn tuy nhiên điều này sẽ gây tốn kém trong thu hồi dung môi

và tốn dung môi [8]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu rong biển được sử dụng trong nghiên cứu là rong mơ Sargassum oligocystum (S oligocystum), sargassum microcystum (S microcystum), rong nho (Caulerpa lentillifera) và rong mứt (Porphyta)

Nguyên liệu rong biển tươi được thu mua tại các hộ dân ở Thành phố Nha Trang tỉnh Khánh Hòa Sau khi thu mua, nguyên liệu tươi được rửa sạch bằng nước ngọt để loại bỏ muối, tạp chất và phơi khô đến độ ẩm từ 10-21% Tiếp theo, chúng được đưa đi xay nhỏ, hút chân không và bảo quản bằng túi PE ở 8-10oC dùng làm nguyên liệu thực nghiệm

2.2.1 Thiết bị

Bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany), Tủ sấy, máy lọc hút chân không, máy đo quang phổ UV-VIS (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia), máy vortex, micro pipet, cân phân tích có độ chính xác 10-4g, bình hút ẩm, máy đồng hóa, máy ly tâm lạnh

2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát

 Giải thích quy trình

(1) Xử lý nguyên liệu

Nguyên liệu rong biển còn tươi (gồm 4 loài là rog mơ S microcystum, S oligocystum, rong mứt Porphyta và rong nho Caulerpa lentillifera) được thu mua tại các

hộ dân ở Thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Nguyên liệu được vận chuyển về

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát

Nguyên liệu rong biển

Rửa sạch, làm khô (độ ẩm 10-21%)

Nghiền nhỏ

Chiết

Thu dịch chiết

Nghiên cứu ảnh hưởng

của nồng độ dung môi

chiết đến hàm lượng TPC

của dịch chiết rong biển

Đánh giá khả năng chống oxy hóa

rong biển

Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng TPC của dịch chiết rong biển

Lựa chọn 02 loài rong có hàm lượng TPC cao nhất

phòng thí nghiệm hóa học Tại phòng thí nghiệm, nguyên liệu rong tươi được rửa sạch bằng nước ngọt để loại bỏ muối và tạp chất Sau đó, tiến hành phơi khô rong biển dưới ánh nắng mặt trời đến độ ẩm 10-21% nhằm giảm hàm lượng ẩm trong rong, góp phần quan trọng trong việc ức chế sự phát triển của vi sinh vật sống trên rong và ức chế quá trình tổng hợp và chuyển hóa trong rong Đồng thời, khi hàm lượng ẩm trong nguyên liệu giảm, tốc độ trích ly tăng lên vì nước tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán Sau khi làm khô, rong biển được nghiền nhỏ bằng máy xay sinh

tố nhằm mục đích tăng diện tích tiếp xúc của rong nguyên liệu và dung môi, đồng thời làm phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi Tuy nhiên, không nên xay hoặc nghiền rong quá nhỏ vì kích thước bột rong quá nhỏ sẽ bít lỗ của giấy lọc làm cản trở quá trình lọc Sau khi nghiền nhỏ, rong được bảo quản trong các túi PE hút chân không ở nhiệt độ khoảng 8-10oC trước khi sử dụng cho thí nghiệm nhằm hạn chế quá trình tổng hợp và chuyển hóa các chất trong rong Rong được bảo quản tốt hơn, đảm bảo cho quá trình thực hiện không gặp gián đoạn về vấn đề nguyên liệu

30, 60, 90 và 120 phút Sau khi chiết xong, ta thu dịch chiết và tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu:

2.3.2 Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong biển

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng chất khô của rong biển

Cách tiến hành: Để xác định độ ẩm của rong nguyên liệu tiến hành cân 1 g nguyên liệu rong biển khô cho vào cốc sấy Để xác định hàm lượng chất khô, hút 3 ml dịch chiết vào cốc đã được sấy khô đến khối lượng không đổi Tất cả được cho vào tủ sấy và tiến hành sấy mẫu ở nhiệt độ 105-120oC trong khoảng thời gian từ 4-6 giờ Sau đó, lấy mẫu

ra làm nguội bằng cách để vào bình hút ẩm và đem mẫu đi cân ở cân phân tích có độ chính xác 10-4g, tính kết quả

2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong biển

Trong quá trình tiến hành thí nghiệm cần chú ý: Rong tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời do polyphenol dễ bị phân hủy, thường xuyên kiểm tra nhiệt độ trong quá trình chiết và khi thời gian thực hiện quá dài thì cần thường xuyên kiểm tra các điều kiện còn lại để đảm bảo độ chính xác

2.3.3.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết

Trong quá trình chiết, việc lựa chọn ra loại dung môi chiết thích hợp nhất để hòa tan tốt chất tan cần xác định là một yếu tố rất quan trọng Qua bản chất của một số loại dung môi và của chất tan, ta thấy dung môi có thể hòa tan tốt polyphenol là các dung

Sấy đến khối lượng không đổi

Làm nguội

Cân

Tính kết quả Rong biển