Nghiên cứu tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme và đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn oligochitin thu được

----o0o---- HUỲNH THẢO HÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP OLIGOCHITIN TỪ CHITIN CHIẾU XẠ, CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLI

o0o

HUỲNH THẢO HÂN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP (OLIGOCHITIN) TỪ CHITIN CHIẾU XẠ, CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITIN THU ĐƯỢC

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Nha Trang, tháng 06 năm 2015

o0o

HUỲNH THẢO HÂN

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP (OLIGOCHITIN) TỪ CHITIN CHIẾU XẠ, CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITIN THU ĐƯỢC

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án này

Trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo sự kính trọng cho em được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin dành cho thầy: Trần Văn Vương – Bộ môn – Trường Đại học Nha Trang đã tài trợ kinh phí, tận tình hướng dẫn động viên em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp này

Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm và tập thể cán bộ trong các phòng thí nghiệm- Trung tâm Thực hành Thí nghiệm- Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt quá trình thực hiện đồ án này

Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ em vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua

Nha Trang, ngày 29 tháng 06 năm 2015

Sinh viên Huỳnh Thảo Hân

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG.iii

DANH MỤC HÌNH iv

LỜI MỞ ĐẦU vi

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN 3

1.1 Tổng quan về chitin 3

1.1.1 Lịch sử hình thành và cấu tạo của chitin 3

1.1.2 Độ kết tinh của chitin 7

1.1.3 Tính chất của chitin 7

1.2 Tổng quan về oligochitin 8

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, oligochitin 9

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 9

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 12

1.4 Khả năng ứng dụng của chitin và oligochitin 14

1.4.1 Ứng dụng của chitin 14

1.4.2 Ứng dụng của oligochitin 15

1.5 Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt tính 16

1.5.1 Tổng quan về phương pháp hóa học 16

1.5.2 Tổng quan về phương pháp chiếu xạ 18

1.5.3 Tổng quan về phương pháp sinh học 22

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 28

2.1.1 Vật liệu chính 28

2.1.2 Vật liệu phụ 28

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 28

2.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 28

2.3 Phương pháp nghiên cứu 29

2.3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30

2.3.3 Phương pháp xử lí số liệu 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN

3.1 Kết quả nghiên cứu xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử

lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ 37

3.2 Kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme 38

3.3 So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) sản xuất giữa 2 phương pháp và lựa chọn phương pháp sản xuất 40

3.4 Lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) 41

3.5 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 42

3.5.1 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ 42

3.5.2 Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 44

3.5.3 So sánh khả năng chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) giữa hai phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 46

3.6 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oiligochitin 49

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 52

4.1 Kết luận 52

4.2 Đề xuất ý kiến 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC I 55

PHỤ LỤC II 59

PHỤ LỤC III 64

DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT

PGS – TS: Phó giáo sư – tiến sĩ

HPLC : High Performance Liquid Chromatography

DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

LB : Luria Bertami

E.coli : Escherichia coli

B.cereus : Bacillus cereus

S.aureus : Staphylococcus aureus

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn A 59 Bảng 3.2 Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn B 59 Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn C 59 Bảng 3.4 Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn A 60 Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn B 60 Bảng 3.6 Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn C 60 Bảng 3.7 So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin theo hai phương pháp 60 Bảng 3.9 Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn B 61 Bảng 3.10 Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn C 61 Bảng 3.11 Kết quả đo bước sóng 517 nm của vitamin C 62 Bảng 3.12 Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu

xạ 62 Bảng 3.13 Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp

enzyme phân đoạn A 62 Bảng 3.14 Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp

enzyme phân đoạn B 63 Bảng 3.15 Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp

enzyme phân đoạn C 63

Bảng 3.16 Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu

xạ kết hợp enzyme 63 Bảng 3.17 Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc chitin 4

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử chitin trong không gian 4

Hình 1.3 Cấu tạo chitin và cellulose 5

Hình 1.4 Cấu trúc các dạng mạch chitin 6

Hình 1.6 Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin 16

Hình 1.7 Sơ đồ sản xuất oligochitin 17

Hình 1.9 Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin 24

Hình 2.1 Enzyme Hemicellulase 28

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ở các liều chiếu xạ khác nhau 37

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lương thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với enzyme 39

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng hai phương pháp 40

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ 42

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ 43

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân đoạn oligochitin theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 44

Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 45

Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn A giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 46

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn B giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 47

Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn C giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 48

Chitin là một polymer có trọng lượng phân tử lớn, không tan trong nước nên

có nhiều hạn chế cho việc ứng dụng Vì vậy hiện nay người ta đang có xu hướng nghiên cứu sản xuất các chế phẩm từ chitin nhằm khắc phục các hạn chế của nó

Oligochitin là một sản phẩm được hình thành sau quá trình cắt mạch chitin

Nó có những đặc tính như: khả năng hòa tan trong nước tốt, có hoạt tính sinh học (khả năng chống oxy hóa, khả năng kháng khuẩn), an toàn và còn được ứng dụng trong y học nhằm cải thiện tình trạng thiếu máu, điều hòa huyết áp trong máu, điều hòa lượng cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, chống ung thư máu Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm, kháng bệnh cho cây trồng vật nuôi

Oligochitin là một polymer có hoạt tính sinh học và được sản xuất bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, sinh học, chiếu xạ và enzyme Hiện nay, vấn đề liên quan đến khả năng chống oxi hóa và phương pháp sản xuất

oligochitin được nhiều người quan tâm, vì vậy tôi làm đề tài: “Nghiên cứu tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme và đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn oligochitin thu được”

Nội dung đề tài:

1 Xây dựng quy trình tách chiết các phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme

2 Xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme

3 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn oligochitin thu được

4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oligochitin thu được Mục tiêu của đề tài:

Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3 phân đoạn oligochitin sản xuất bằng phương pháp chiếu xạ và enzyme để tìm ra phân đoạn có khả năng chống oxi hóa cao nhất

Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của một số phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ và enzyme

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: hiện nay chúng ta đang cần tìm ra phân đoạn oligochitin có khả năng chống oxi hóa được sản xuất theo phương pháp nào có hiệu quả cao để ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN

đó, Odier cho rằng đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác và côn trùng, một chất

từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hi Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó

Chitin là chất hữu cơ chủ yếu trong vỏ mai (bộ xương ngoài động vật không xương sống) Theo Richard, chitin được tìm thấy trong lớp vỏ cutin của loài chân đốt Ngoài ra, chitin còn được tìm thấy trong tế bào ống của loài mực, ở lớp vỏ bao ngoài của loài Bọ cánh cứng, trong lớp vỏ mai của loài giáp xác, trong loài nhện và bướm Người ta đưa ra các giả thiết khác nhau về sự hiện diện của chitin hoặc cenlulose làm cơ sở cho mối quan hệ phát sinh giữa các nhóm của giống nấm đặc biệt là phycomecetus Qua phân tích bằng tia X, Frey đã xác nhận rằng chitin và cenlulose không hiện diện đồng thời Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ ngoài của loài nấm mà nó được liên kết với những thành phần khác Lượng chitin được tinh chế từ một số loài nấm thông thường từ 3 - 5%

 Cấu tạo của chitin

Chitin là một polymer phổ biến trong tự nhiên, sau cellulose, chúng được tạo

ra rất trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo của vách tế bào nấm, cấu tạo nên bộ khung xương của vỏ tôm, cua, côn trùng, các động vật giáp xác,…Chitin rất ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết với protein ở dạng phức hợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết Chitin là một polisacharid được cấu tạo bởi các

monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối 1,4-glucozit Công thức phân tử là (C8 H13 O5)n trong đó cacbon chiếm 47,29%, hydro chiếm 6,45% và oxi chiếm 39,37%

Hình 1.1 Cấu trúc chitin

Chitin có cấu trúc hóa hoc giống cellulose ngoại trừ nhóm hydroxyl thứ hai trên nguyên tử carbon alpha trên phân tử cellulose được thay thế bằng nhóm acetomaide [5] Cũng nhờ vào cấu trúc này mà việc ứng dụng của chitin vào xử lý nước thải nhả in nhuộm là một việc rất có triển vọng

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử chitin trong không gian

Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật Trong thế giới động vật chitin là thành phần có cấu trúc quan trọng của một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn Trong thế giới thực vật

chitin có ở tế bào nấm Zygemycethers và một số tảo Chlorophiceae

Động vật thủy sản đặc biệt là cua, ghẹ, tôm là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin, từ đó sản xuất các sản phẩm khác từ chúng

Công thức cấu tạo của chitin và cellulose:

Hình 1.3 Cấu tạo chitin và cellulose

Công thức phân tử của chitin: (C8 H13 O5)n

Trong đó n thay đổi là do từng loại nguyên liệu

Ở tôm thẻ chân trắng n= 400 - 500

Ở tôm hùm n= 700 - 800

Ở cua n= 500 - 600

Phân tử lượng chitin Mchitin = (203.09)n [6]

Chitin là một polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phần tử liên kết nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi tổ chức Chitin rất hiếm tồn tại ở trạng thái

tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, cua, ghẹ [6]

Chitin cũng có màu trắng giống cellulose, chitin có tính kị nước cao (đặc biệt đối với α-chitin), không tan trong nước trong kiềm, trong các acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu Tính không tan của chitin là do cấu trúc chặt chẽ,

có liên kết trong và liên phân tử mạnh mẽ thông qua các nhóm hydroxyl và acetamin Tuy nhiên, cần lưu ý là β-chitin, không giống như α-chitin, có tính trương

nở với nước cao

Cấu trúc các dạng trên xuất phát từ nguồn chiết rút chitin, chitin từ tôm, cua

có dạng α-chitin, chitin từ mực có dạng β-chitin Ba dạng chitin nêu trên có sự khác

nhau về tính hydrat hóa, kích thước của mỗi đơn vị cấu trúc và số mạch chitin trong mỗi đơn vị cấu trúc, α-chitin có độ kết tinh cao nhất và ở dạng rắn chắc

và các mạch chitin xếp song song nhưng ngược chiều nhau, β-chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng chiều, có độ kết tinh thấp, tính hydrat hóa cao, γ-chitin sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì lại có một mạch ngược chiều Trong tự nhiên, α-chitin có mặt nhiều nhất và thường rất cứng trong khi 2 loại kia thì tạo nên tính dẻo, dai cấu trúc hóa học của chitin với các liên kết hidro nối phân

tử giữa các phân tử đường trong chitin rất chặt chẽ vì vậy làm cho phân tử chitin có

độ rắn chắc cao và khó hòa tan

Hình 1.4 Cấu trúc các dạng mạch chitin

γ, β-chitin do mắt xích ghép lại với nhau theo kiểu song song (β-chitin) và hai song song một ngược chiều (γ-chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn Dạng β tồn tại ít nó được tìm ra trong protein của mực ống, còn dạng γ thì rất hiếm Vì thế mà người ta thường thủy phân dạng α-chitin do nó tồn tại nhiều và phổ biến

1.1.2 Độ kết tinh của chitin

Chitin có cấu trúc tinh thể rắn chắc so với polymer sinh học khác, chitin có

độ kết tinh cao và biến đổi theo từng loại chitin được chiết rút từ nguồn nguyên liệu khác nhau Phổ nhiễu xạ tia X của α-chitin từ vỏ tôm và β-chitin từ xương mực cho thấy mẫu α-chitin có vòng nhiễu xạ mạnh, ở vòng trong thì không có tính hydrat hóa mạnh, trong khi mẫu β-chitin có vòng tương tự nhưng yếu hơn và có tính hydrat hóa mạnh

1.1.3 Tính chất của chitin

Chitin là một polysaccharide có tính kiềm, bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid Dựa vào tính chất này người ta đã sản xuất glucosamine bằng phương pháp hóa học từ chitin bằng cách đun nóng chitin trong acid HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao, chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn, tạo thành 88,5% D-Glucosamin và 12,5% acid acetic [6]

Khi đun nóng chitin trong dung dịch kiềm đặc, chitin bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan Dựa vào đặc tính này người ta đã sản xuất chitosan từ chitin

Chitin NaOH 40 - 50% chitosan

Phản ứng ester hóa:

Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat

Chitin tác dụng với ahydrit trong pyridin Dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat

Chitin ở dạng tinh thể, màu trắng ngà không định hình, không tan trong nước, trong acid loãng, kiềm, chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei Sapranora Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành phức chất cần thiết Chitin hòa tan trong dung dịch đặc nóng của các muối: thioxianat Liti (LiSCN), thioxianat Canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo Chitin

có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1 [6]

Chitin ổn định với các chất chống oxy hóa khử như: Thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Clorua vôi Ca(ClO)2… từ đó lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hóa để khử màu cho chitin [6]

Chitin là một vật liệu chứa cả 2 nhóm chức –OH và –NH2 cho liên kết với enzyme, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể Chitin là một polymer kỵ nước,

độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học Dựa vào đặc tính này, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hóa trị qua cầu nối glutaradehyt Tuy nhiên,

do tính chất kị nước nên bề mặt tiếp xúc của enzyme cố định và cơ chất rất hạn chế

Vì vậy hoạt tính của ezyme cố định trên chitin thường rất thấp [1]

Chitin hòa tan được trong dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4, dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride

Chitin tương đối ổn định với các chất chống oxi hóa khử, thuốc tím, oxy già, nước gia ven (NaOCl), hay Ca(ClO)2 lợi dụng tính chất này người ta sử dụng màu cho chitin

Chitin khó tan trong thuốc thử Schwweizel sapranora Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOOCH3) ngăn cản sự tạo thành phức chất cần thiết

1.2 Tổng quan về oligochitin

Oligochitin là đoạn mạch polymer của N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucozit Oligochitin được tạo thành qua quá trình thủy phân/cắt mạch bằng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp chiếu xạ bằng bức xạ năng lượng cao như γ hoặc chùm điện tử gia tốc

Oligochitin là một saccharide, được kết hợp bởi các monosaccharide từ 2 –

10 trong cấu trúc của chitin Oligochitin có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng hòa tan tốt trong nước và là một chất có tính sinh học cao

Oligochitin được xem như một thực phẩm chức năng, có khả năng chống nấm mốc, vi khuẩn, chống oxy hóa lipid, chống ung thư, chống bướu, chống bệnh tim mạch [6]

Công thức cấu tạo của oligochitin:

Oligochitin có dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vị đặc biệt chúng có khả năng tan tốt trong nước, độ nhớt thấp, phân tử lượng nhỏ và dễ kết tinh, có hoạt tính sinh học cao như: Cải thiện thiếu máu, bệnh gan, điều hòa huyết áp trong máu, điều hòa lượng Cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, chống ung thư máu,…Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm, kháng bệnh cho cây trồng vật nuôi

1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, oligochitin

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Nước ta là nước có ngành chế biến thủy sản khá phát triển nên các phế phẩm

từ thủy sản đang là vấn đề được quan tâm rất lớn đối với các công ty chế biến Các phế phẩm từ đầu tôm, mai mực, mai ghẹ nếu thải ra môi trường sẽ làm ô nhiễm nặng, mà trong các phế phẩm đó có một lượng lớn chitin nếu được xử lí thu hồi chitin thì không những vấn đề môi trường được giải quyết mà còn kiếm được một nguồn lợi nhuận cao từ phế phẩm thủy sản.Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chitin, oligochitin và ứng dụng của chúng rất phổ biến và được quan tâm Tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất oligochitin còn là một vấn đề khá mới mẻ, mới bắt đầu được quan tâm và đi vào nghiên cứu Ở nước ta, trường Đại học Nha Trang bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin từ năm 1978 với quy trình của cô Đỗ Minh Phụng nhưng chưa có ứng dụng trong sản xuất cụ thể Gần đây với yêu cầu bức bách trong

xử lí phế phẩm từ thủy sản, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin, chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào

Hình 1.5 Công thức cấu tạo của oligochitin

nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, đồng thời nghiên cứu quá trình thủy phân chitin tạo các sản phẩm mới có ứng dụng cao trong sản xuất và thực phẩm, cũng như đời sống

Hiện nay, có nhiều cơ sở đang nghiên cứu sản xuất chitin trong đó Trung tâm Chế biến Trường Đại học Nha Trang là nơi sản xuất chitin có chất lượng cao

Ở miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitin và ứng dụng của nó

Ở miền Nam, trung tâm Công nghệ Sinh học và Sinh học Thủy sản phối hợp với một số cơ quan khác như: Đại học Y dược Hồ Chí Minh, Phân viện Khoa học Việt Nam, viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin trong các lĩnh vực nông nghiệp, y dược

Năm 2003 một dự án sản xuất thử nghiệm chitin đã hoàn thành tại trường Đại học Nha Trang Trường Đại học Nha Trang đã chuyển giao công nghệ sản xuất chitin cho một số cơ sở sản xuất Sản phẩm chitin của Trung tâm Chế biến Thủy sản của Trường Đại học Nha Trang đang có uy tín cao, sản phẩm bắt đầu ứng dụng mạnh mẽ vào một số

cơ sở sản xuất và được đưa đi chào hàng ở Thái Lan Sản phẩm chitin của trường Đại học Nha Trang đã góp phần giảm nhập khẩu chitin từ nước ngoài

Năm 2005 Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất olygosaccharide từ chitin – chitosan bằng phương pháp hóa học Hiện nay công nghệ đã được hoàn thiện, sản phẩm đang tiếp tục được sản xuất tuy nhiên năng suất còn nhỏ

Năm 2006 Trần Thị Luyến triển khai sản xuất olygosaccharide bằng enzyme Đây là một hướng nghiên cứu mới, cần được tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối tượng enzyme khác nhau

Một số quy trình sản xuất chitin và oligosaccharide ở trong nước

Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà Nội

Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lí tách khoáng lần 1 trong dung dịch HCl 4% trong thời gian τ = 24 giờ ở nhiệt độ phòng với tỉ lệ w/v = ½ Sau đó vớt ra rửa trung tính và dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ t0 = 90 - 950C trong thời gian τ = 3 giờ Sau đó

rửa trung tính và khử khoáng lần 2 cũng bằng HCl 4% với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 24 giờ và đem rửa trung tính Để tách protein lần 2 ta ngâm trong dung dịch NaOH 2% với tỷ lệ ½ ở nhiệt độ t0 = 90 - 950C sau 3 giờ vớt

ra và rửa trung tính rồi tiến hành khử khoáng lần 3 giống 2 lần trên Sản phẩm đem phơi hoặc sấy khô ta thu được chitin [6]

Ưu điểm: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu Nhược điểm: Tốn hóa chất Thời gian sản xuất kéo dài, nồng độ hóa chất sử dụng cao, thời gian xử lí dài làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến

độ nhớt giảm Hóa chất độc hại ảnh hưởng tới môi trường

+ Quy trình của Đỗ Minh Phụng – Đại học Nha Trang (1980)

Nguyên liệu là vỏ tôm khô, được xử lý sạch không lẫn tạp chất được đem đi khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/m = 1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ vớt ra

và rửa trung tính Tiếp theo ngâm trong NaOH 8% ở nhiệt độ to = 100oC trong thời gian τ = 2 giờ với tỷ lệ w/m = 1/2,5 để khử protein, sau đó vớt ra và rửa trung tính Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10% trong 60 phút ,sau đó đem rửa sạch và tiếp tục tẩy màu bằng Na2SO3 1,5% trong thời gian 15 phút rồi vớt ra rửa sạch ta thu được chitin [6]

Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp

Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm, thời gian xử lý dài [4]

+ Quy trình sử dụng enzyme papain sản xuất chitosan của PGS - TS Trần Thị Luyến

Vỏ tôm khô được xử lý trong điều kiện: Dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/m = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ Nguyên liệu vỏ tôm tươi được xử lý tương

tự nhưng với tỷ lệ w/m = 1/5 Sau đó tiến hành rửa sạch và khử protein bằng enzyme papain theo phương pháp bổ sung dung dịch 13% papain vào khối vỏ tôm đạt tỷ lệ w/m

= 1/5, dùng HCl điều chỉnh pH về 5 – 5,5 và nâng nhiệt độ lên 70 - 80oC trong thời gian

4 giờ Sau đó rửa sạch, làm khô ta thu được sản phẩm chitin [3]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Năm 1859 nhờ vào phát minh đầu tiên của Rouget khi đun sôi chitin trong dung dịch HCl đậm đặc Và về sau đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitin và các sản phẩm thủy phân từ chitin [12]

Shigermase cùng cộng tác viên (1944) đã cho rằng liozyme có khả năng thủy phân chitin- chitosan rất tốt trong điều kiện t = 38oC pH = 5,4

Aiba va Muraka (1996) cho rằng (GlcNAc)n, n = 1 – 7, có thể sản xuất được bằng cách dùng enzyme, enzyme cellulose và hemicellulase thủy phân chitosan

Muzzarelli (1996) cho rằng enzymer cellulose và hemicellulase, papain lipase thủy phân chitosan ở những độ khác nhau hemicellulase thủy phân chitosan, sản (GlcNAc)n , n = 6, thu được 18%, Muzzare (1997) cũng cho rằng Strepmyces grigeus HUT 6037 tiết ra enzyme ngoại bào chitinase và chitosanase ứng dụng thủy

phân một số loài giáp xác

Hằng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới [14] Theo đánh giá của FAO, nhu cầu dùng chitin trên thế giới còn tăng cao trong thế kỷ tới

Do những hạn chế về khả năng hòa tan của chitin nên người ta tiến hành nghiên cứu các chế phẩm từ chitin

Năm 1994 Shigermase và các cộng sự cho rằng Lysozyme có khả năng thủy phân chitin rất tốt trong điều kiện to = 37oC, pH = 5,4 với phương pháp:

Phương pháp A (sử dụng một lượng nhỏ Lysozyme): Sự thủy phân chất keo chitin bởi Lysozyme Cho một ít chất keo chitin (0.5% w/v, 10 ml) trong 0,2

M dung dịch đệm acetate (pH = 5,4) với 0,05% NaN3, được ủ với lysozyme (2 mg/ml, 1 ml), tại 370C trong 3 ngày và sau đó cho thêm dung dịch enzyme lysozyme vào (1ml) Sau 3 ngày, lấy đi ly tâm và những sản phẩm trên bề mặt dung dịch mang đi phân tích bởi HPLC

Phương pháp B (sử dụng một lượng lớn enzyme lysozyme): Chitosan đã được deacetyl 30 – 72% Cho thêm vào 20mg enzyme lysozyme, tạo nên một hỗn hợp, đem đi ủ ở 37oC Trong thời gian ủ, tách ra 0,5 ml đưa ra ngoài và phân tích bằng HPLC

Năm 1997 Muzzarelli cho rằng Strepmyces griseus HUT 6037 tiết ra enzyme

ngoại bào chitinase ứng dụng thủy phân chitin của loài giáp xác

Quy trình sản xuất chitin của Hackman

Vỏ tôm được làm sạch bằng cách cạo và rửa dưới vòi nước chảy rồi sấy khô trong lò sấy ở nhiệt độ 100oC Lượng dùng là 220 gam được ngâm trong 2 lít HCl 2N trong thời gian 5 giờ ở nhiệt độ phòng Sau đó vớt ra rửa kỹ với nước và sấy ở

100oC Sau đó nghiền thành bột, bột nhuyễn này được trích trong bình cầu và lắc mạnh trong 48 giờ với 0.5 lít HCl 2N, ly tâm bỏ phần lỏng, phần rắn được rửa kỹ,

và tiếp tục được chiết bằng cách lắc mạnh trong 12 giờ với 0,5 lít NaOH 1N ở

100oC Quy trình trích ly trong dung dịch kiềm được thực hiên 3 lần, sau đó phần rắn được thu hồi và rửa nhiều lần với nước cho đến khi trung tính Cuối cùng rửa với ethanol và ether, rồi sấy khô, chitin thu được có màu vàng

Quy trình sản xuất chitin của Wistler và Beniller

Lọc vỏ tôm được rửa sạch, sấy khô trong lò sấy chân không ở 50oC Dùng

500 gam xây nguyễn rồi ngâm trong dung dịch NaOH 10% ở nhiệt độ phòng trong

3 ngày dung dịch kiềm được thay đổi hằng ngày Những hạt đã được loại protein được rửa với nước rồi nghiền với ethanol 95% cho đến khi phần nước lọc gần như không màu (thao tác này dùng khoảng 6 lít ethanol 95%) Phần rắn lại tiếp tục đem nghiền với khoảng 1 lít acetone, 2,5 lít ethanol và 0,5 lít ether, sau đó lọc những hạt thu được gần như không màu, sấy khô ở áp suất kém và được ngâm trong dung dịch HCl 37%, ở 20oC trong 4 ngày Những hạt trương phồng được ly tâm tách ra ở 0oC

và rửa với nước ở 0oC cho đến khi hết acid Hiệu suất là 20% (100g) hàm lượng nitơ là 7,1%

Quy trình sản xuất chitin của Roseman

Vỏ tôm được khử Ca giống như phương pháp Hackman ở trên Cân 100 gam được lắc rung cơ học trong 18 giờ với 100 ml dung dịch acid formic đặc (90%) ở nhiệt độ phòng Lọc lấy phần bã, rửa kỹ với nước và được xử lý trong 2 giờ với dung dịch NaOH 10% Đem lọc, phần bã thu được có màu trắng, rửa dưới vòi nước đến khi trung tính, sau đó rửa vài lần với ethanol và ether rồi sấy khô dưới áp suất

kém, hiệu suất khoảng 50 - 60%, hàm lượng nitơ là 8,5%, hàm lượng acetyl là 19,2%

1.4 Khả năng ứng dụng của chitin và oligochitin

1.4.1 Ứng dụng của chitin

- Trong thực phẩm

Chitin, chitosan là một polymer tự nhiên không độc và rất an toàn đối với thực phẩm, với tính năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, có khả năng hấp phụ một số kim loại nặng, nên chitosan được nghiên cứu ứng dụng trong ngành công nghệ sản xuất thực phẩm và bảo quản Ngoài ra, chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phấm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…)

- Trong công nghệ sinh học

Trong lĩnh vực công nghệ sinh học chitin-chitosan là một chất mang phù hợp cho sự cố định enzyme tế bào Enzyme cố định tế bào là một chất xúc tác sinh học hoạt động trong một không gian linh hoạt Enzyme cố định cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học, khoa học, khoa học phân tích, enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác như là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước quả Sử dụng enzyme cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao

- Trong công nghiệp giấy

Chỉ cần bỏ ra 1% chitin tính theo trọng lượng vào bột giấy cũng đã đủ làm tăng sức dẻo dai của giấy Nhờ đó, các nhà máy có thể dùng ít chất sợi hơn nhưng vẫn giữ được phần tốt cuả giấy Theo ước tính các nhà sản xuất có thể tiết kiệm được 90% năng lượng tiêu thụ vì bây giờ họ không cần đánh bột giấy để rút nước

ra Loại giấy được chế tạo từ chitin dễ in hơn giấy bình thường và khó rách hơn khi giấy bị ướt Với đặc tính này chitin được ứng dụng chế tạo tã lót cho trẻ em, khăn giấy và bao giấy gói hàng

- Trong công nghiệp khác

Chitin và các dẫn xuất của nó phổ biến là chitosan, đã được ứng dụng vào quá trình xử lí nước, là chất thêm vào trong dầu gội, làm da nhân tạo, chất chống nấm, các chất xơ [10]

1.4.2 Ứng dụng của oligochitin

Trong công nghệ thực phẩm: Oligochitin được dùng để bảo quản cá, tôm,…

- Trong nông nghiệp

Oligochitin được dùng để tạo lớp phủ ngoài bảo quản hạt giống, điều hòa đất, làm tăng trưởng lá, tiêu diệt mầm bệnh, kháng nấm,…

Oligochitin còn ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của cây Chế phẩm oligosaccharide ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của ngô Với nồng độ phun thích hợp là 40 ppm, số lần phun là 3 lần/vụ, liều lượng là

300 lít/ha, năng suất sau khi sử dụng tăng 20% so với đối chứng ( theo nghiên cứu cứu của Đại học Nông nghiệp I Hà Nội) [6]

Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm oligosaccharide lên lá đậu phộng, đậu tương đến số nốt sàn ở rễ Kết quả cho thấy nồng độ 40 ppm đã làm tăng 50% số lượng nốt sần so với mẫu đối chứng phun nước lã [2]

- Trong y học

Oligochitin và các chế phẩm của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh Đồng thời oligochitin còn được sử dụng làm thuốc để hạ cholesterol trong máu [4] Trường Đại học Pukyong National Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công ứng dụng của oligochitin trong việc tăng sức đề kháng điều hòa lượng cholesterol, cải thiện máu và bệnh gan, điều hòa áo suất trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, điều trị các bệnh: Viêm loét dạ dày, bệnh tiêu chảy,…

Oligochitin có tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nên được sử dụng để làm chất bảo quản nguyên liệu thủy sản

1.5 Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt tính

1.5.1 Tổng quan về phương pháp hóa học

Thủy phân chitin bằng phương pháp hóa học là sử dụng các chất acid để cắt mạch chitin ở nhệt độ cao Quá trình thủy phân tạo thành các phân tử glucosamine

có hoạt tính sinh học cao, quá trình này xảy ra ở các mối nối 1,4-glucozit, sau đó loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3) tạo thành thành 88,5% D-Glucosamin và 12,5% acid acetic [6]

Phương trình thủy phân:

(C32H54N4O21)x + 2(H2O)x = (C28H50N4O19)x + 2(CH3COOH)x

Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin bằng phương pháp hóa học:

Hình 1.6 Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin

đ o t

Nghiên cứu sản xuất chitin và oligochitin bằng phương pháp hóa học

Qui trình sản xuất oligosaccharides [12]

Hình 1.7 Sơ đồ sản xuất oligochitin

Phương pháp thủy phân chitin tạo N-acetyl-chito-oligosaccharides COSs): thủy phân chitin với HCl 12M ở nhiệt độ 40oC, thời gian 7h Kết thúc quá trình thủy phân, thêm nước vào với tỉ lệ dung dịch: nước là 1:4 Trung hòa bằng NaOH 25% Dùng thiết bị màng lọc UF (thiết bị siêu lọc) để tách ra 2 loại NA - COSs có trọng lượng phân tử 1 – 3 kDa và dưới 1 kDa [7]

(NA-Hiện nay, phương pháp này ít được sử dụng do còn tồn tại nhiều hạn chế, sản phẩm tạo thành chủ yếu là D-glucosamine nên hướng quan tâm mới hiện nay là thủy phân chitin bằng phương pháp sinh học sử dụng enzyme

Phế liệu tôm, cua

Khử khoáng bằng HCl

Khử màu

Chitin

Thủy phân một phần Khử protein bằng NaOH/ KOH

Oligochitin

Glucosamine và N- acetyl

glucosamine

Nhận xét:

Ưu điểm: phương pháp hóa học đơn giản, thời gian thủy phân ngắn

Nhược điểm: chi phí cao, năng suất thấp, hoạt tính sinh học các sản phẩm

thủy phân tạo thành không cao, khó tinh sạch, nguy cơ gây ô nhiễm môi trường do

sử dụng một lượng lớn hóa chất trong quá trình sản xuất

1.5.2 Tổng quan về phương pháp chiếu xạ

Phương pháp chiếu xạ là phương pháp sử dụng nguồn bức xạ ion hóa năng

lượng cao như bức xạ α, β, tia X, γ, notron, electron để tạo ra biến đổi ở mức

nguyên tử, phân tử Quá trình chiếu xạ sẽ làm biến đổi tính chất cơ lý, hóa lý của

polymer, độ kết tinh, độ tan trong dung môi, tính dẫn điện, tính thấm khí

Cơ chế tác động: dưới tác động của các nguồn bức xạ thì vật liệu polymer sẽ

xảy ra những biến đổi sau:

Biến đổi hóa và hóa - lí [5]

• Hiệu ứng khâu mạch (cross- linking)

Người ta đưa ra ra rất nhiều cơ chế khâu mạch polymer, nhưng phổ biến nhất

là tạo ra các gốc tự do Khâu mạch là kết quả của quá trình nối mạch giữa 2 gốc tự

do chẳng hạn như trường hợp của polystyrene:

Hình 1.8 Cơ chế khâu mạch của polystyren

Trong quá trình ngắt mạch các phân tử lượng polymer giảm, quá trình này khác với quá trình này khác với quá trình trùng hợp, trong đó các monomer đươc tạo ra và phân tử lượng của polymer hầu như không thay đổi

Trong quá trình ngắt mạch, các gốc tự do được tạo ra không liên kết với nhau

do những khó khăn về mặt không gian, ngoài ra do sự hiện diện của nguyên tử cacbon với 4 mối liên kết, cũng cản trở sự di chuyển hóa học dọc theo mạch polymer

• Hiệu ứng tách khí

Khi chiếu xạ polymer, quá trính giải phóng sản phẩm ở thể khí thường xảy ra rất mạnh Bản chất của các sản phẩm thể khí và hiệu suất hóa bức xạ của chúng thường phụ thuộc trước hết vào loại polymer và cấu trúc của nó

• Oxy hóa bức xạ và sau bức xạ của polymer

Trong nhiều trường hợp oxy hóa có ảnh hưởng đáng kể tới qúa trình phân tích bức xạ của polymer Quá trình oxy hóa này có thể do oxi hòa tan trong polymer, có thể do oxi khuếch tán vào polymer từ bên ngoài Giai đoạn đầu là quá trình oxy hóa hòa tan, giai đoạn sau là oxy khuếch tán từ bên ngoài Trong phản ứng oxy hóa, các gốc tự do lớn của peroxy có vai trò rất quan trọng Các gốc tự do peroxy này xuất hiện khi oxy tác dụng với các gốc tự do lớn được tạo ra trong quá trình chiếu xạ Cơ chế đơn giản nhất của quá trình oxy hóa polymer như sau:

Trong đó R là gốc alkyl, R• là gốc tự do lớn, RH- polymer, RO2 là gốc tự do peroxy

Tốc độ oxy hoá phụ thuộc vào các yếu tố sau đây:

+ Nồng độ của oxy trong polyme: Nồng độ này được xác định bằng độ hoà

tan của oxy, khả năng thẩm thấu của nó qua polyme cũng như tốc độ thâm nhập của oxy vào polyme Ngoài ra hiệu ứng còn phụ thuộc vào liều, suất liều, áp suất của oxy, bề dày của mẫu, tốc độ khi chiếu v.v

+ Hiệu ứng suất liều: Sự khuếch tán của oxy vào polyme có liên quan tới

suất liều Rõ ràng suất liều càng nhỏ (tốc độ tiêu hao oxy nhỏ) thì xác suất thâm nhập của oxy từ ngoài vào polyme càng lớn và như vậy quá trình oxy hoá diễn ra càng mạnh

+ Hiệu ứng nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình oxy hoá bức xạ theo

một số hướng: Khi nhiệt độ tăng, độ hoà tan của oxy trong polyme giảm, hiệu ứng oxy hoá giảm Khi nhiệt độ tăng, tốc độ ở mọi giai đoạn của quá trình oxy hoá tăng, hiệu ứng oxy hoá tăng Khi nhiệt độ tăng, xác suất phân rã của các gốc tự do tăng đồng thời độ bền vững của hyđro peroxy (H2O2) cũng giảm, hiệu ứng oxy hoá giảm

Do đó hiệu ứng nhiệt độ tổng phụ thuộc vào tỷ lệ đóng góp của các hiệu ứng thành phần

+ Hiệu ứng áp suất: Khi áp suất của oxy tăng, nồng độ của oxy trong polyme

tăng và độ thâm nhập của nó vào polyme cũng tăng do đó, tốc độ oxy hoá cũng tăng Tuy nhiên, thông thường hiệu suất hoá bức xạ phụ thuộc vào áp suất tương đối yếu Chẳng hạn khi chiếu màng polyetylen bằng gamma hiệu suất chỉ tăng từ 8,6 lên 10 phân tử/100 eV khi áp suất tăng 150 lần (suất liều 1,4 Gy/s)

Sự thay đổi tính chất vật lý [5]

Khi chiếu xạ polyme, cũng như khi chiếu xạ chất rắn khác, có thể xảy ra các biến đổi thuận nghịch và không thuận nghịch của nhiều tính chất vật lý như tính chất cơ điện, biến đổi về cấu trúc v.v Nói chung các biến đổi thuận nghịch thường xảy ra ở các liều thấp còn biến đổi không thuận nghịch thì xảy ra ở các liều hấp thụ tương đối cao như khi polyme chịu những biến đổi hoá học rõ ràng như ngắt mạch, khâu mạch, oxy hoá v.v

Tương tác bức xạ ion hóa lên các hệ polymer có thể xảy ra phản ứng cắt mạch làm giảm cấp chiều dài hoặc khâu mạch tạo vật liệu trương nở cao, tăng độ bền cơ lý tùy thuộc vào bản chất và cấu trúc của polymer Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng polymer có cấu tạo từ các vòng glucozit như chitin thường xảy ra phản ứng cắt mạch tạo oligomer khối lượng phân tử thấp khi được chiếu xạ,

trong khi đó các dẫn xuất của chúng thường xảy ra phản ứng khâu mạch tạo các sản phẩm có cấu trúc không gian ba chiều

 Một số nghiên cứu về phương pháp chiếu xạ

Nghiên cứu chiếu xạ chitosan tạo thành chitosan oligomer [2]

Phương pháp này sử dụng năng lượng cao của bức xạ gamma từ nguồn xạ Co-60 để phân huỷ bức xạ Chitosan thành các Chitosan oligomer Phương pháp này lần đầu tiên được Kume (1997) sử dụng và ở Việt Nam, được nghiên cứu sử dụng là Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà lạt (Nguyễn Quốc Hiến, 1999) Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi phải có nguồn chiếu xạ, vốn đầu tư lớn, đòi hỏi an toàn

về phóng xạ cao Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất là bức xạ gamma phân huỷ mạch Chitosan hoàn toàn ngẫu nhiên, hiệu suất tạo Chitosan oligomer có khối lượng phân

tử thấp phải sử dụng liều chiếu xạ rất cao 100 – 150 kGy gây biến màu sản phẩm và làm thay đổi ít nhiều về mặt hoá học của Chitosan oligomer

Chitosan có thể được phân cắt dựa vào ảnh hưởng của tia  Chiếu xạ tia  là một phương pháp đơn giản và nhanh chóng, tác động lên cấu trúc polymer và làm giảm kích thước phân tử của polymer Tùy vào từng liều xạ ta thu nhận được các oligomer có kích thước khác nhau Khi chiếu dung dịch chitosan 10% có phân tử lượng trung bình 48 kDa bằng liều 100 kGy thì phân tử lượng trung bình giảm xuống còn 16 kDa, còn khi tăng lên liều xạ 200 kGy thì phân tử lượng trung bình là 9,1 kDa Các đặc tính của chitosan sau chiếu xạ có thể được phân tích dựa vào phương pháp quang phổ hồng ngoại và phân tích nguyên tố Nhóm amino acid trên các đơn phân khá ổn định trong khi nhóm C-O-C giảm khi tăng liều xạ Khi nghiên

cứu ứng dụng của chitosan chiếu xạ trên nuôi cấy thực vật in vitro, chitosan có phân

tử lượng khoảng 16 kDa khi chiếu bằng liều xạ 100 kGy cho thấy khả năng kích thích tăng trưởng tốt nhất Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được ứng dụng quan trọng của phương pháp chiếu xạ trong tăng cường hoạt tính các enzyme phân cắt chitosan Các liều xạ ngoài tác dụng phân cắt sơ khởi phân tử chitosan thì

có lẽ đã bẻ gãy cấu trúc xoắn cuộn, làm lộ ra nhiều hơn các vị trí nhận biết cho phân

cắt của enzyme và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân cắt của các enzyme, giúp tiết kiệm liều lượng sử dụng của enzyme

Công nghê bức xạ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như [5]:

Trong công nghiệp chế tạo: chế tạo kính tấm nhạy bức xạ, chế tạo màng lọc

kĩ thuật bằng chiếu chùm ion gia tốc, công nghệ lưu hóa các chất đàn hồi (sản xuất các vật liệu cách nhiệt, bền nhiệt tự dính, ), công nghệ biến tính các vật liệu polymer (chế tạo vỏ cáp và dây điện bằng khâu mạch bức xạ, chế tạo ống và màng

co nhiệt, chế tạo polyetylen bằng xốp bức xạ, công nghệ làm đông cứng chất phủ

polymer, )

Trong công nghệ xử lí bề mặt kim loại bằng phương pháp cấy ion, công nghệ

lưu hóa các chất đàn hồi

Trong y học: chế tạo băng vêt thương dưới dạng gel nước

Sản xuất gỗ - chất dẻo và vật liệu bê tông – polimer

Nhận xét:

Ưu điểm: nhanh chóng, hiệu suất cắt mạch khá tốt

Nhược điểm: đòi hỏi phải có nguồn chiếu xạ, vốn đầu tư lớn, đòi hỏi an toàn

về phóng xạ cao Liều chiếu xạ cao ảnh hưởng tới tính chất của sản phẩm tạo thành

1.5.3 Tổng quan về phương pháp sinh học

Phương pháp sinh học là phương pháp sử dụng các chế phẩm sinh học để thủy phân chitin trong đó được sử dụng nhiều nhất là các enzyme do chúng có hiệu quả xúc tác cao gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường

Cơ chế xúc tác của enzyme [6]

Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung Phương trình phản ứng enzyme như sau:

ES + S ES P + E

Trong đó:

E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme có chất; P: sản phẩm

Enzyme có tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: enzyme cơ chất kết hợp với nhau tạo thành phức hợp enzyme -

cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp

Giai đoạn 2: là giai đoạn tạo thành phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy

ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi

Giai đoạn 3: là giai đoạn giải phóng enzyme, đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng Từ cơ chất sẽ thành sản phẩm và enzyme sẽ được giải phóng dưới dạng tự do ban đầu

Tác động của enzyme lên quá trình thủy phân chitin:

Quá trình cắt mạch chitin của enzyme xảy ra tại vị trí liên kết 1,4-glucozit tạo thành các đoạn mạch ngắn hơn

Một số nghiên cứu thủy phân chitin bằng phương pháp sinh học

Wang và Chio (1998) cùng với cộng sự (2006) đã nghiên cứu về việc sử dụng enzyme Alcalase, chymotrypsin, và papain để khử protein (COS) trong phế liệu vỏ giáp xác Năm 2008, Wang đã nghiên cứu và dùng enzyme bromelin và papain để thủy phân chitin tạo chitosan oligomer tốt hơn papain với nồng độ enzyme tối thích là 0,1% [13]

Qui trình nghiên cứu sử dung enzyme thủy phân chitin sản xuất oligosaccharides [13]

Hình 1.9 Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin

Oligochitosan

Oligochitin Rửa và làm khô

Khử protein bằng enzyme thương mại

Bất hoạt enzyme

Rửa và làm khô

Deacetyl bằng chitin

deacetylase hoặc vi

khuẩn axit lactic

Thủy phân chitin bằng enzyme chitinolitics Chitin

Phế liệu vỏ tôm cua

Khử khoáng Khử khoáng

Xử lí sơ bộ

Nhận xét:

Ưu điểm: thủy phân có tính chọn lọc cao, an toàn, sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt

Nhược điểm: chi phí cao, thời gian thủy phân dài

 Phương pháp đánh hoạt tính sinh học oligochitin

- Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa [9]

Ngày nay, có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong đó, phương pháp sàng lọạt tính bẫy gốc tự do DPPH thường được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do các chất kháng oxi hóa Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định

Năm 1992 Govldschmidt và Renn, đã phát hiện ra 1 gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không bị phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxi đó chính là gốc tự do DPPH ( 2,2-diphenol-1-picrylhyrdarzyl) DPPH• là một gốc tự do màu tím giống màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ Gốc tự do DPPH• do sự bất định xứ của đơn điện tử chưa liên kết (điện tử này nằm trong hệ thống liên hợp rộng khắp gốc tự do DPPH• Dung dịch DPPH trong ethanol có cực đại hấp phụ tai bước sóng 517nm và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhyrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam

Nguyên lý

Các gốc tự do sẽ có khả năng trung hòa các gốc tự do bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp phụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ giảm dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt

Phản ứng trung hòa của các gốc tự do DPPH được minh họa bằng hình bên dưới

Hình 1.10 Phản ứng trung hòa các gốc tự do DPPH•

Tiến hành

Cho chất kháng oxi hóa cần khảo sát tác dụng với gốc tự do DPPH• ở các nồng độ khác nhau Sau đó theo dõi sự thay đổi nồng độ hấp thu ở bước sóng 517nm hoặc tốc độ mất màu của hỗn hợp qua đó, đánh giá hoạt tính của chất chống oxi hóa đó Tốc độ mất màu của dung dịch tỉ lệ thuận với khả năng chống oxi hóa của chất đó

- Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của oligochitin [11]

Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch

Nguyên lí

Các chủng vi khuẩn được cấy trong môi trường thích hợp được đục lỗ đem ủ qua đêm ở các điều kiện tối ưu cho từng chủng vi khuẩn, sau đó đo vùng ức chế (vùng các lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh)

Tiến hành

Lựa chọn chủng vi khuẩn phổ biến liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm, chia ra hai nhóm gram dương và gram âm để xác định tình kháng khuẩn Việc chọn nhóm gram dương hay gram âm phụ thuộc vào mức độ chủng vi khuẩn thuộc nhóm gram gây ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe con người khi có mặt trong thực phẩm

Đĩa thạch chứa môi trường MRS được khoan một lỗ ở giữa, rồi được lấp đầy bằng 2 ml dịch oligochitin (1mg/1ml) Sau đó 1 giờ toàn bộ đĩa thạch được phủ đều với 3 ml thạch mềm (0,7%, w/v) của môi trường LB có chứa một trong các vi khuẩn

đích (E coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B cereus (Gr+),

S aureus (Gr+)) Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở điều kiện tối ưu cho từng loại vi

khuẩn đích, sau đó đo kích thước vùng ức chế xuất hiện Quan sát vùng ức chế càng lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu chính

Chitin chiếu xạ ở các liều xạ: 200 kGy, 350 kGy, 400 kGy tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt

2.1.2 Vật liệu phụ

- Axit HCl loại sử dụng cho thí nghiệm, xuất xứ Tây Ban Nha, Trung Quốc

- 1,1 diphenyl-2-picryllhydrazyl (DPPH) sử dụng cho thí nghiệm

- Enzyme hemicellulase: loại tinh khiết sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ

vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của hãng Sigm – Aldrich

Hình 2.1 Enzyme Hemicellulase

- Cồn loại sử dụng trong thí nghiệm

- Acetol loại sử dụng cho thí nghiệm, xuất xứ Trung Quốc

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành trường Đại học Nha Trang

2.2 Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu

- Thiết bị nghiên cứu gồm: tủ ấm, máy cô quay chân không, máy li tâm ống lớn, bể ổn nhiệt, tủ sấy, tủ nung, tủ lạnh, tủ đông, máy so màu UV – Vis, máy sấy chân không