2.3.2.1. Sơ đồ quy trình tổng quát (dự kiến)
Xử lý bằng phương pháp Chitin
Chiếu xạ + Enzyme Chiếu xạ
Tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) khác nhau
Đánh giá hiệu suất thu hồi
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
Đề xuất phương án sử dụng các phân đoạn oligochitin Sấy lạnh
Xử lý tạo huyền phù
Thu được ba phân đoạn oligochitin A, B, C
Đánh giá khả năng kháng khuẩn
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu:
Nguyên liệu chitin sử dụng cho các thí nghiệm là chitin khô dạng bột xay nhỏ đã được chiếu xạ ở các liều xạ 200, 350, 400 kGy.
Xử lí:
+ Phương pháp chiếu xạ: Bột chitin đã chiếu xạ (200, 350, 400 kGy) đem ngâm nước cất để làm mềm, sau đó xử lý bằng HCl 37% khuấy đều và ủ trong bể ổn nhiệt 30 phút. Lấy dịch đã xử lý hòa với nước cất ta được dạng huyền phù của chitin.
+ Phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme: Bột chitin đã chiếu xạ ở liều chiếu 200 kGy ngâm nước cất để làm mềm, sau đó xử lý bằng HCl 37% rồi ủ trong bể ổn nhiệt 30 phút, vừa ủ vừa khuấy đều. Khi đã đủ thời gian ủ, lấy dịch hòa với nước cất lạnh (2 – 4oC) đến khi đạt 500 ml khuấy đều, dịch đó đem li tâm khoảng 4 – 5 lần để thu được dịch có pH = 4 – 4,5. Cuối cùng hòa tan trong nước cất đến khi đạt 500 ml, đó là dịch huyền phù để tách phân đoạn.
Tách chiết các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp oligochitin:
Dung môi dùng tách chiết gồm ethanol và acetol. Tùy thuộc vào chiều dài mạch của từng phân đoạn để pha tỷ lệ dung môi chiết phù hợp. Sau quá trình tách chiết, hiệu suất ba phân đoạn thu được thấp hơn khối lượng nguyên liệu ban đầu do có phần hao hụt của tủa với chiều dài mạch lớn hơn phân đoạn A và phần hao hụt có chiều dài mạch nhỏ hơn phân đoạn C. Phương pháp tách chiết ba phân đoạn như sau [8]:
+ Thu phân đoạn A (trên 16 monomer): Dung dịch thủy phân/chiếu xạ được
trộn với ethanol theo tỷ lệ 1/1 (v/v). Tủa thu được bằng cách lọc và rửa bằng ethanol 50%. Cuối cùng làm khô tủa bằng máy hút chân không. Tủa nhận được gọi là phân đoạn A chứa gốc oligochitn có độ dài lớn hơn 16 monomer. Dịch lọc gọi là dịch A.
+ Thu phân đoạn B (9 - 16 monomer): Dịch A được cô đặc bằng máy hút
chân không cho đến thể tích cuối cùng bằng khoảng 10% thể tích ban đầu. Sau đó, bổ sung 9 lần thể tích ethanol vào dịch A và khuấy liên tục. Sau khi khuấy, thu được
tủa. Lọc và rửa tủa bằng ethanol 90%. Làm khô tủa bằng máy hút chân không và thu được phân đoạn B chứa oligochitin có độ dài 9 - 16 monomer. Dịch lọc gọi là dịch B.
+ Thu phân đoạn C (5 - 8 monomer): Dịch B được cô lại đến 10% thể tích
ban đầu, bổ sung 9 thể tích acetol vào dịch B, khuấy liên tục. Sau khi khuấy, thu được tủa. Lọc và làm khô tủa bằng máy hút chân không, thu được phân đoạn C.
Sấy lạnh:
Các phân đoạn thu được chia làm 2 phần: Một phần sấy nóng để xác định hiệu suất thu hồi, phần còn lại sấy lạnh bằng máy sấy chân không ở nhiệt độ 30oC.Phân đoạn sau sấy lạnh được nghiền mịn thành bột để:
+ Xác định hoạt tính chống oxi hóa của 3 phân đoạn oligochitin A, B, C theo phương pháp DPPH.
+ Xác định khả năng kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin thu được.
Đề xuất phương án sử dụng các phân đoạn oligochitin
+ Dựa trên kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin theo từng phương pháp chọn phương pháp có hiệu suất thu hồi oligochitin cao nhất. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Dựa vào hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn oligochitin cao nhất. + Dựa vào khả năng kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin cao nhất.
2.3.2.1. Sơ đồ qui trình xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin bằng phương pháp chiếu xạ Xử lý tạo huyền phù Chitin đã chiếu xạ ở các liều 200, 350, 400 kGy Tách phân đoạn
Thu được 3 phân đoạn A, B, C
Sấy lạnh và xác định hiệu suất thu hồi
Dịch
So sánh hiệu suất thu hồi giữa các phân đoạn
2.3.2.2. Sơ đồ qui trình xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme
Chitin đã chiếu xạ ở liều xạ 200 kGy Xử lí tạo huyền phù
Thủy phân bằng Enzyme Hemicellulase (thời gian 72h, to = 37oC, nồng độ enzyme = 0.02% pH =
4.5)
Tách phân đoạn
Sấy lạnh và xác định hiệu suất thu hồi
Dịch
Thu được 3 phân đoạn A, B, C
So sánh hiệu xuất thu hồi giữa các phân đoạn
2.3.2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin thu được
Sơ đồ đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
Sơ đồ đánh giá khả năng kháng khuẩn
Oligochitin
Phân đoạn B
Phân đoạn A Phân đoạn C
Xác định khả năng chống oxi hóa
So sánh khả năng chống oxi hóa giữa các phân
đoạn
Oligochitin
Phân đoạn B
Phân đoạn A Phân đoạn C
Xác định khả năng kháng khuẩn
So sánh khả năng kháng khuẩn giữa các phân
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});