oiligochitin
Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin được thể hiện ở bảng 3.17 và hình 1, 2, 3 (phụ lục II) dưới đây:
Bảng 3.17. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin Stt Tên mẫu Mã hóa mẫu CHỈ TIÊU E.coli (Gr-) Salmonella (Gr-) Klebsiella pneumoniae (Gr-) B. cereus (Gr+) S. aureus (Gr+) (D-d) mm (D-d) mm (D-d) mm (D-d) mm (D-d) mm 1 Oligochitin phân đoạn A 13St 2,1 2,2 2,0 2,0 2,0 2 Oligochitin phân đoạn B 12St 2,7 2,7 2,6 2,6 2,6 3 Oligochitin
phân đoạn C 12Sa
2,5 2,5 2,4 2,4 2,4
Kết quả nghiên cứu thể hiện trên bảng 3.17 cho thấy khả năng kháng khuẩn oligochitin phân đoạn B là cao nhất, phân đoạn A thấp nhất. Cụ thể, phân đoạn A có vùng ức chế E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+) lần lượt là 2,1; 2,2; 2,0; 2,0; 2,0 mm; phân đoạn B có vùng ức chế E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+),
S. aureus (Gr+) lần lượt là 2,7; 2,7; 2,6; 2,6; 2,6 mm.
Vi khuẩn là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới gồm loại gây độc và loại có lợi. Do chúng có mặt khắp nơi nên việc xâm nhập vào các dạng thực
phẩm để gây ngộ độc thực phẩm là tất nhiên, ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta ăn uống nước nhiễm bẩn, không được bảo quản đúng cách,…Trên thực tế các loại vi khuẩn thường gây độc là:
+ Escherichia coli: Hiện diện một cách tự nhiên trong ruột của người và
động vật, khi nhiễm độc sẽ gây rối loạn tiêu hóa, đau bụng, tiêu chảy, nôn, thân nhiệt có thể tăng.
+ Staphylococcus aureus: Thường thấy trên da, từ các nốt ghẻ lở có mủ,
trong mũi và họng của người. Khi nhiễm gây đau bụng tiêu chảy và nôn mửa dữ dội.
+ Samonella: Gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột.
+ Klebsiella pneumonia: Gây bệnh viêm phổi, viêm màng não… + Bacillus cereus: Gây tiêu chảy…
Bởi vì thực tế có các loại vi khuẩn trên gây bệnh nên việc nghiên cứu khả năng kháng khuẩn cũng cần dựa vào loại vi khuẩn đặc trưng đó thì kết quả mới có ý nghĩa hơn. Trong bài, chọn ra 5 vi khuẩn mang đặc tính khác nhau chia thành 2 nhóm gram dương và gram âm: vi khuẩn gram dương có thành tế bào dày và vách peptidoglycan ngược lại vi khuẩn gram âm có thành tế bào mỏng, có màng. Mục đích phân loại vi khuẩn gram dương và gram âm là để phân loại vi khuẩn, từ đó tìm ra các biện pháp chữa trị bệnh do chúng gây ra, vi khuẩn gram âm gây bệnh nguy hiểm hơn.
Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy oligochitin có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt, đặc biệt là kháng mạnh đối với nhóm vi khuẩn gram âm. Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích N- axetyl-D-glucozamin và nhóm –OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích D-glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N. Tại vị trí N xảy ra phản ứngN-axetyl hoá chitosan, chính điều này có tác dụng mạnh mẽ lên thành tế bào vi khuẩn. Khả năng ức chế nhóm vi khuẩn gram âm mạnh hơn nhóm gram dương vì lớp peptidoglucan nhóm gram âm mỏng hơn nên sự tác
động của N-axetyl mạnh mẽ hơn. Phân đoạn B có khả năng kháng khuẩn cao nhất vì được qua quá trình tách chiết hoạt tính của nó vẫn được giữ, còn phân đoạn A có lẫn phần hợp chất không tan của mạch chitin dài hơn phân đoạn A, phân đoạn C được cô quay trong thời gian lâu hơn nên sẽ bị cháy dẫn đến hoạt tính của nó giảm hơn so với đoạn B.
Kết luận: Các phân đoạn oligochitin có khả năng kháng khuẩn, trong đó phân đoạn B có khả năng kháng khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn E. coli (Gr-) có
vùng ức chế là 2,7 mm.
3.7. Lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) dựa vào kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin
Dựa trên kết quả đồ thị hình 3.3, 3.8, 3.9, 3.10 và bảng 3.17 rút ra kết luận: Quy trình lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được hiệu suất cao nhất là quy trình sản bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme. Ở quy trình này nên lựa chọn sản xuất phân đoạn oligochitin B để đánh giá khả năng chống oxi hóa và khả năng kháng khuẩn là cao hơn trong 3 phân đoạn A, B, C.
CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. Kết luận
- Lựa chọn được phương pháp sản xuất oligochitin có hiệu suất thu hồi cao nhất là phương phương pháp chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme.
- Quy trình tách chiết của từng phân đoạn sẽ khác nhau về nồng độ và dung môi tách chiết, cụ thể: Phân đoạn A (trên 16 monomer) tách bằng ethanol 50%, phân đoạn B (9 – 16 monomer) tách bằng ethanol 90%, phân đoạn C (5 – 8 monomer) tách bằng acetol 90%.
- Oligochitin thu được có khả năng chống oxi hóa, trong đó phân đoạn B > phân đoạn C > phân đoạn A. Phân đoạn B có khả năng chống oxi hóa cao nhất tại nồng độ 500µg/ml khả năng quét gốc tự do DPPH là 9,76% khá thấp so với vitamin C là 67,9%. Dù sản xuất oilgochitin theo phương pháp nào thì khả năng chống oxi hóa là như nhau.
- Khả năng kháng khuẩn oligochitin của phân đoạn B > phân đoạn C > phân đoạn A, cụ thể vùng ức chế vi khuẩn E. coli (Gr-) là 2,7 mm.
4.2. Đề xuất ý kiến
- Tiếp tục nghiên cứu phương pháp xác định cấu trúc phân tử của sản phẩm sau khi thủy phân.
- Sử dụng các dung môi tách chiết tinh khiết hơn đước sản xuất từ Mỹ để có được hiệu suất cao.
- Vì oligochitin có khả năng kháng khuẩn nên có thể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm bằng phương pháp tạo màng. Đặc biệt trong bảo quản cá ngừ, khi ca ươn histidin thủy phân tạo histamine gây độc. Ngoài ra, tiếp tục nghiên cứu khả năng kháng khuẩn đối với chủng Enterobacteriaceae, Vibro sp, Lactobacillus sp, Morganella morganii… để ức chế khả năng tạo histamine mà nó có mặt khi cá chết.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt:
1. Nguyễn Anh Dũng (2001).” Nghiên cứu chế tạo vật liệu cố định enzyme từ các polyme sinh học bằng kĩ thuật bức xạ kết hợp với kĩ thuật sinh hóa học”. Luận án
Tiến sĩ sinh học.
2. Nguyễn Anh Dũng, (2009). “Polysaccharide hoạt tính sinh học và ứng dụng”. NXB Giáo dục Việt Nam.
3. Trần Thị Luyến (số 1-2003). “Nghiên cứu sản xuất chitosan bằng enzyme
papain”. Tạp chí Khoa học công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Thủy sản.
4. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn. “Sản xuất các chế phẩm kỹ
thuật và y dược từ phế liệu thủy sản”. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
5. Trần Đại Nghiệp (2006), “Giáo trình xử lí bức xạ cơ sở của công nghệ bức xạ”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội
6. Lê Thị Tưởng (2007). “Nghiên cứu thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme
hemicellulase và ứng dụng sản phẩm thủy phân vào bảo quản sữa tươi nguyên liệu”. Luận văn thạc sỹ ngành “Thí nghiệm hóa sinh học” (tập 1). Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thanh phố Hồ Chí Minh.công nghệ sau thu hoạch.
Tài liệu tiếng nước ngoài:
7. Dai-Nghiep Ngo, Sang-Hoon Lee, Moon-Moo Kim, Se-Won Kim “ Production of chitin oligosaccharides with different molecular weight and antioxidan effect and raw 264.7 cell”.Joural of funtion food I (2009).
8. E. Muraki, F. Yaku & H. Kojima. Carbohydrate Reasearch, 1993, 239: 227-237.
9. John P. Hart (2012)“Chemical Composition and Antioxidant Activities of
Broussonetiapapyrifera Fruits”. PLoS ONE
10. Musashino-shi, (1997). ” Chemistry and application of chitin and chitosan”
Tokyo 180, Japan, Department of Industrial Chemistry, Faculty of Engineering, Seikei University
11. M.S Benhabiles, R Salah, H Lounici, N Drouiche, M.F.A Goosen, N.Mameri (2012) ”Antibacterial activity of chitin, chitosan and its oligomers prepareed from
shrim shell waste”. Food Hydrocolloids
12. Muzzarelli, R.A., (1997). “Depolymerisation of chitins and chitosan with
hemicellulase, lysosyme, papain and lipase”. In chitin Hankbook, ed Muzzarelli,
R.A. and Peters, M.G, European Chitin Society, p153.
13. Wolfram M. Brück, John W. Slater, and Brian F. Carney (2010) Chitin and Chitosan from Marine Organisms “Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and Their
Derivatives”.Copyright Clearance Center, Inc. (CCC).
Tài liệu điện tử:
14. http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/sinh-hoc-te-bao/1716-ten- gi-va-phan-loi-enzym.html
PHỤ LỤC I
(CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 1. Xác định hiệu suất thu hồi bằng phương pháp sấy
* Nguyên lý: Dùng sức nóng 105C ± 2oC sấy mẫu và cốc đến khối lượng không đổi. Phần còn lại đem cân và tính ra % hàm lượng mẫu có trong nguyên liêụ.
* Tiến hành xác định: Sấy cốc sứ đã rửa sạch ở tủ sấy tới 105C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng cốc trên cân phân tích với độ chính xác 10-4, cho vào chén m (g) mẫu. Cân tất cả trên cân phân tích với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào tủ sấy ở nhiệt độ 105C, sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, rồi đem cân trên cân phân tích. * Tính kết quả: X = (%) ) 1 ( 100 ) 2 ( G G G G Trong đó: G: Trọng lượng cốc (g).
G1: Trọng lượng cốc + mẫu trước khi sấy (g). G2: Trọng lượng cốc + mẫu sau sấy (g)
2. Phương pháp và các bước tiến hành cắt mạch chitin
• Phương pháp chiếu xạ [1]
Sử dụng các mẫu chitin đã được chiếu xạ ở các liều xạ khác nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều xạ tới hiệu suất thu hồi oligochitin.
Xử lý tạo chitin huyền phù:
+ Bước 1: Lấy 25 gam chitin khô cho vào cố thủy tinh 500 ml.
+ Bước 2: Thấm ướt chitin: Lấy 75 ml nước cất cho vào cốc đựng mẫu chitin đã cân, sau đó dùng đũa thủy tinh khuấy đều và cứ 5 phút lại khuấy 1 lần trong thời gian 5 giờ.
+ Bước 3: Lấy 100ml dung dịch HCl 37% cho vào cốc đựng chitin đã thấm ướt. Khuấy liên tục trong 30 phút ở nhiệt độ 40oC.
+ Bước 4: Thêm từ từ nước cất đến 500ml.
• Phương pháp xử lý chitin chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme
Hemicellulase
Chitin làm mềm với nước nhằm làm tăng độ trương nở tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý tạo huyền phù chitin.
Tạo huyền phù chitin: Để quá trình thủy phân dễ dàng, enzyme tiếp xúc với
cơ chất nhiều hơn.
+ Bước 1: Lấy 25 gam chitin khô cho vào cố thủy tinh 500 ml.
+ Bước 2: Thấm ướt chitin: Lấy 75 ml nước cất cho vào cốc đựng mẫu chitin đã cân, sau đó dùng đũa thủy tinh khuấy đều và cứ 5 phút lại khuấy 1 lần trong thời gian 5 giờ.
+ Bước 3: Lấy 100ml dung dịch HCl đậm đặc cho vào cốc đựng chitin đã thấm ướt. Khuấy liên tục trong 30 phút ở nhiệt độ 40oC.
+ Bước 4: Thêm từ từ nước lạnh (2 - 40C: Lấy đá cho vào cốc nước để làm lạnh tới nhiệt độ mong muốn) đến 500 ml. Dịch huyền phù được thu lại bằng cách ly tâm ở tốc độ 3500 vòng /phút trong thời gian 20 phút. Lặp lại bước này khoảng 4 - 5 lần (thu được huyền phù có pH = 4 - 4.5).
+Bước 5: Hòa tan trong nước cất ấm (40 - 450C) đến khi đạt 500 ml.
+ Bước 6: Thủy phân: Công đoạn thủy phân có tác dụng làm yếu và cắt các liên kết glucozit trong mạch chitin. Nó quyết định đến hiệu suất sản phẩm. Tiến hành thủy phân bằng enzyme với các chế độ thủy phân: nồng độ enzyme là 0.02%, nhiệt độ thủy phân 40oC, thời gian 72h. Trong quá trình thủy phân cần khuấy hoặc lắc 2 – 3 giờ/lần để tăng cường khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Đồng thời theo dõi nhiệt độ và pH để đảm bảo nhiệt độ và pH luôn ổn định trong quá trình thủy phân.
3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin
3.1. Xác định khả năng quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)
3.1.1. Nguyên lý.
DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thụ tại 517 nm. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. 3.1.2. Tiến hành. Hóa chất. - 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (chuẩn). - Nước cất/Ethanol. Thiết bị, dụng cụ.
- Máy so màu UV-Vis. - Cân phân tích.
- Ống nghiệm (10ml). - Máy ly tâm.
- Thiết bị cô quay. - Thiết bị ổn nhiệt.
- Một số dụng cụ thủy tinh thông thường dùng trong phòng thí nghiệm.
Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH.
- Bước 1: Hòa tan mẫu thử ở các nồng độ khác nhau (4): 100, 50, 25, 10 µM. - Bước 2: Lấy 3 ml mẫu thử ở các nồng độ khác nhau (4) cho vào ống nghiệm (10 ml). Đồng thời chuẩn bị thêm 1 ống nghiệm có chứa 3 ml nước cất (mẫu trắng).
- Bước 3: Bổ sung thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,1 mM vào các ống nghiệm (5). Lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút.
- Bước 5: Tính toán khả năng khử gốc tự do DPPH bằng công thức. I = 100 × (ACT - ASP)/ACT (%).
Từ đó tìm ra được thông số IC50 của mẫu thử..
Trong đó:
+ ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. + ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu thử.
* Chú ý:
+ Mỗi nồng độ (của mẫu thử) được thực hiện 3 lần, lấy giá trị trung bình. + Trong trường hợp mẫu thử có hoạt tính khử mạnh sẽ được thử tiếp ở nồng độ 10, 5, 2, 1 µM để tìm ra giá trị IC50 của mẫu thử.
+ IC50 (Inhibition Concentration): Là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có khả năng ức chế 50% gốc tự do. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp.
3.2. Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn [10]
Xác định hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Đĩa thạch chứa môi trường MRS được khoan một lỗ ở giữa, rồi được lấp đầy bằng 2 ml dịch oligochitin (1mg/1ml). Sau đó 1 giờ toàn bộ đĩa thạch được phủ đều với 3 ml thạch mềm (0,7%, w/v) của môi trường LB có chứa một trong các vi khuẩn đích (E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+) lần lượt là 2.1, 2.2, 2.0, 2.0, 2.0 mm; phân đoạn C có vùng ức chế E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+)). Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở điều kiện tối ưu cho từng loại vi
khuẩn đích, sau đó đo kích thước vùng ức chế xuất hiện. Vùng ức chế càng lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh. Các vi khuẩn đích được lấy từ bộ sưu tập các mẫu chuẩn hiện có ở phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Đại học Nông nghiệp Hà Nội.
PHỤ LỤC II
(CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU)
1. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng các phương pháp
Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn A
Mẫu (kGy) Lần thí nghiệm và kết quả (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 200 51,35 51,38 51,41 51,41±0,07 350 58,83 58,84 58,88 58,88±0,07 400 60,81 60,84 60,87 60,87±0,07
Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn B
Mẫu (kGy) Lần thí nghiệm và kết quả (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 200 4,64 4,77 4,92 4,78±0,35 350 6,28 6,31 6,34 6,31±0,07 400 7,29 7,33 7,31 7,31±0,05
Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn C
Mẫu (kGy) Lần thí nghiệm và kết quả (%) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 200 0,35 0,25 0,3 0,3±0,12 350 0,37 0,37 0,4 0,38±0,04 400 0,39 0,42 0,42 0,41±0,04
Bảng 3.4. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn A
Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%)
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình
Chiếu xạ 200 + Enzyme
(0,02%)
75,08 75,1 75,13 75,1±0,06
Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu