Phương pháp sinh học là phương pháp sử dụng các chế phẩm sinh học để thủy phân chitin trong đó được sử dụng nhiều nhất là các enzyme do chúng có hiệu quả xúc tác cao gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường.
Cơ chế xúc tác của enzyme [6]
Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung. Phương trình phản ứng enzyme như sau:
ES + S ES P + E Trong đó:
E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme có chất; P: sản phẩm. Enzyme có tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: enzyme cơ chất kết hợp với nhau tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp.
Giai đoạn 2: là giai đoạn tạo thành phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.
Giai đoạn 3: là giai đoạn giải phóng enzyme, đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ thành sản phẩm và enzyme sẽ được giải phóng dưới dạng tự do ban đầu.
Tác động của enzyme lên quá trình thủy phân chitin:
Quá trình cắt mạch chitin của enzyme xảy ra tại vị trí liên kết 1,4-glucozit tạo thành các đoạn mạch ngắn hơn.
Một số nghiên cứu thủy phân chitin bằng phương pháp sinh học
Wang và Chio (1998) cùng với cộng sự (2006) đã nghiên cứu về việc sử dụng enzyme Alcalase, chymotrypsin, và papain để khử protein (COS) trong phế liệu vỏ giáp xác. Năm 2008, Wang đã nghiên cứu và dùng enzyme bromelin và papain để thủy phân chitin tạo chitosan oligomer tốt hơn papain với nồng độ enzyme tối thích là 0,1% [13].
Qui trình nghiên cứu sử dung enzyme thủy phân chitin sản xuất oligosaccharides [13].
Hình 1.9. Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin
Oligochitosan
Oligochitin Rửa và làm khô
Chitosan
Thủy phân chitosan + enzyme chitinolitics
Rửa và làm khô
Khử protein bằng vi khuẩn phân giải protein Khử protein bằng
enzyme thương mại
Bất hoạt
enzyme
Rửa và làm khô
Deacetyl bằng chitin deacetylase hoặc vi
khuẩn axit lactic
Thủy phân chitin bằng enzyme chitinolitics Chitin
Khử khoáng Khử khoáng
Nhận xét:
Ưu điểm: thủy phân có tính chọn lọc cao, an toàn, sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt.
Nhược điểm: chi phí cao, thời gian thủy phân dài. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phương pháp đánh hoạt tính sinh học oligochitin - Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa [9]
Ngày nay, có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong đó, phương pháp sàng lọạt tính bẫy gốc tự do DPPH thường được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do các chất kháng oxi hóa. Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định.
Năm 1992 Govldschmidt và Renn, đã phát hiện ra 1 gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không bị phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxi đó chính là gốc tự do DPPH ( 2,2-diphenol-1-picrylhyrdarzyl). DPPH• là một gốc tự do màu tím giống màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Gốc tự do DPPH• do sự bất định xứ của đơn điện tử chưa liên kết (điện tử này nằm trong hệ thống liên hợp rộng khắp gốc tự do DPPH•. Dung dịch DPPH trong ethanol có cực đại hấp phụ tai bước sóng 517nm và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhyrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam.
Nguyên lý
Các gốc tự do sẽ có khả năng trung hòa các gốc tự do bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp phụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ giảm dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt.
Phản ứng trung hòa của các gốc tự do DPPH được minh họa bằng hình bên dưới.
Hình 1.10 Phản ứng trung hòa các gốc tự do DPPH•
Tiến hành
Cho chất kháng oxi hóa cần khảo sát tác dụng với gốc tự do DPPH• ở các nồng độ khác nhau. Sau đó theo dõi sự thay đổi nồng độ hấp thu ở bước sóng 517nm hoặc tốc độ mất màu của hỗn hợp qua đó, đánh giá hoạt tính của chất chống oxi hóa đó. Tốc độ mất màu của dung dịch tỉ lệ thuận với khả năng chống oxi hóa của chất đó.
- Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của oligochitin [11]
Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch.
Nguyên lí
Các chủng vi khuẩn được cấy trong môi trường thích hợp được đục lỗ đem ủ qua đêm ở các điều kiện tối ưu cho từng chủng vi khuẩn, sau đó đo vùng ức chế (vùng các lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh)
Tiến hành
Lựa chọn chủng vi khuẩn phổ biến liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm, chia ra hai nhóm gram dương và gram âm để xác định tình kháng khuẩn. Việc chọn nhóm gram dương hay gram âm phụ thuộc vào mức độ chủng vi khuẩn thuộc nhóm gram gây ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe con người khi có mặt trong thực phẩm.
Đĩa thạch chứa môi trường MRS được khoan một lỗ ở giữa, rồi được lấp đầy bằng 2 ml dịch oligochitin (1mg/1ml). Sau đó 1 giờ toàn bộ đĩa thạch được phủ đều với 3 ml thạch mềm (0,7%, w/v) của môi trường LB có chứa một trong các vi khuẩn
đích (E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+)). Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở điều kiện tối ưu cho từng loại vi
khuẩn đích, sau đó đo kích thước vùng ức chế xuất hiện. Quan sát vùng ức chế càng lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh.
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu
2.1.1. Vật liệu chính
Chitin chiếu xạ ở các liều xạ: 200 kGy, 350 kGy, 400 kGy tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt.
2.1.2. Vật liệu phụ
- Axit HCl loại sử dụng cho thí nghiệm, xuất xứ Tây Ban Nha, Trung Quốc. - 1,1 diphenyl-2-picryllhydrazyl (DPPH) sử dụng cho thí nghiệm.
- Enzyme hemicellulase: loại tinh khiết sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của hãng Sigm – Aldrich.
Hình 2.1 Enzyme Hemicellulase
- Cồn loại sử dụng trong thí nghiệm
- Acetol loại sử dụng cho thí nghiệm, xuất xứ Trung Quốc
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành trường Đại học Nha Trang.
2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thiết bị nghiên cứu gồm: tủ ấm, máy cô quay chân không, máy li tâm ống lớn, bể ổn nhiệt, tủ sấy, tủ nung, tủ lạnh, tủ đông, máy so màu UV – Vis, máy sấy chân không.
- Dụng cụ nghiên cứu là các dụng cụ thí nghiệm thông thường của phòng thí nghiệm.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp sử dụng trong phân tích
2.3.1.1. Phân tích/đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin Xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp sấy.
2.3.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxi hóa phân đoạn oligochitin Xác định khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH. - Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch.
2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.3.2.1. Sơ đồ quy trình tổng quát (dự kiến)
Xử lý bằng phương pháp Chitin
Chiếu xạ + Enzyme Chiếu xạ
Tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) khác nhau
Đánh giá hiệu suất thu hồi
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
Đề xuất phương án sử dụng các phân đoạn oligochitin Sấy lạnh
Xử lý tạo huyền phù
Thu được ba phân đoạn oligochitin A, B, C
Đánh giá khả năng kháng khuẩn
Thuyết minh quy trình:
Nguyên liệu:
Nguyên liệu chitin sử dụng cho các thí nghiệm là chitin khô dạng bột xay nhỏ đã được chiếu xạ ở các liều xạ 200, 350, 400 kGy.
Xử lí:
+ Phương pháp chiếu xạ: Bột chitin đã chiếu xạ (200, 350, 400 kGy) đem ngâm nước cất để làm mềm, sau đó xử lý bằng HCl 37% khuấy đều và ủ trong bể ổn nhiệt 30 phút. Lấy dịch đã xử lý hòa với nước cất ta được dạng huyền phù của chitin.
+ Phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme: Bột chitin đã chiếu xạ ở liều chiếu 200 kGy ngâm nước cất để làm mềm, sau đó xử lý bằng HCl 37% rồi ủ trong bể ổn nhiệt 30 phút, vừa ủ vừa khuấy đều. Khi đã đủ thời gian ủ, lấy dịch hòa với nước cất lạnh (2 – 4oC) đến khi đạt 500 ml khuấy đều, dịch đó đem li tâm khoảng 4 – 5 lần để thu được dịch có pH = 4 – 4,5. Cuối cùng hòa tan trong nước cất đến khi đạt 500 ml, đó là dịch huyền phù để tách phân đoạn.
Tách chiết các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp oligochitin:
Dung môi dùng tách chiết gồm ethanol và acetol. Tùy thuộc vào chiều dài mạch của từng phân đoạn để pha tỷ lệ dung môi chiết phù hợp. Sau quá trình tách chiết, hiệu suất ba phân đoạn thu được thấp hơn khối lượng nguyên liệu ban đầu do có phần hao hụt của tủa với chiều dài mạch lớn hơn phân đoạn A và phần hao hụt có chiều dài mạch nhỏ hơn phân đoạn C. Phương pháp tách chiết ba phân đoạn như sau [8]:
+ Thu phân đoạn A (trên 16 monomer): Dung dịch thủy phân/chiếu xạ được
trộn với ethanol theo tỷ lệ 1/1 (v/v). Tủa thu được bằng cách lọc và rửa bằng ethanol 50%. Cuối cùng làm khô tủa bằng máy hút chân không. Tủa nhận được gọi là phân đoạn A chứa gốc oligochitn có độ dài lớn hơn 16 monomer. Dịch lọc gọi là dịch A.
+ Thu phân đoạn B (9 - 16 monomer): Dịch A được cô đặc bằng máy hút
chân không cho đến thể tích cuối cùng bằng khoảng 10% thể tích ban đầu. Sau đó, bổ sung 9 lần thể tích ethanol vào dịch A và khuấy liên tục. Sau khi khuấy, thu được
tủa. Lọc và rửa tủa bằng ethanol 90%. Làm khô tủa bằng máy hút chân không và thu được phân đoạn B chứa oligochitin có độ dài 9 - 16 monomer. Dịch lọc gọi là dịch B. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Thu phân đoạn C (5 - 8 monomer): Dịch B được cô lại đến 10% thể tích
ban đầu, bổ sung 9 thể tích acetol vào dịch B, khuấy liên tục. Sau khi khuấy, thu được tủa. Lọc và làm khô tủa bằng máy hút chân không, thu được phân đoạn C.
Sấy lạnh:
Các phân đoạn thu được chia làm 2 phần: Một phần sấy nóng để xác định hiệu suất thu hồi, phần còn lại sấy lạnh bằng máy sấy chân không ở nhiệt độ 30oC.Phân đoạn sau sấy lạnh được nghiền mịn thành bột để:
+ Xác định hoạt tính chống oxi hóa của 3 phân đoạn oligochitin A, B, C theo phương pháp DPPH.
+ Xác định khả năng kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin thu được.
Đề xuất phương án sử dụng các phân đoạn oligochitin
+ Dựa trên kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin theo từng phương pháp chọn phương pháp có hiệu suất thu hồi oligochitin cao nhất.
+ Dựa vào hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn oligochitin cao nhất. + Dựa vào khả năng kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin cao nhất.
2.3.2.1. Sơ đồ qui trình xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin bằng phương pháp chiếu xạ Xử lý tạo huyền phù Chitin đã chiếu xạ ở các liều 200, 350, 400 kGy Tách phân đoạn
Thu được 3 phân đoạn A, B, C
Sấy lạnh và xác định hiệu suất thu hồi
Dịch
So sánh hiệu suất thu hồi giữa các phân đoạn
2.3.2.2. Sơ đồ qui trình xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme
Chitin đã chiếu xạ ở liều xạ 200 kGy Xử lí tạo huyền phù
Thủy phân bằng Enzyme Hemicellulase (thời gian 72h, to = 37oC, nồng độ enzyme = 0.02% pH =
4.5)
Tách phân đoạn
Sấy lạnh và xác định hiệu suất thu hồi
Dịch
Thu được 3 phân đoạn A, B, C
So sánh hiệu xuất thu hồi giữa các phân đoạn
2.3.2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin thu được
Sơ đồ đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
Sơ đồ đánh giá khả năng kháng khuẩn
Oligochitin
Phân đoạn B
Phân đoạn A Phân đoạn C
Xác định khả năng chống oxi hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
So sánh khả năng chống oxi hóa giữa các phân
đoạn
Oligochitin
Phân đoạn B
Phân đoạn A Phân đoạn C
Xác định khả năng kháng khuẩn
So sánh khả năng kháng khuẩn giữa các phân
2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu
Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, kết quả là trung bình giữa các lần thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2013 để xử lý số liệu và vẽ đồ thị.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ
Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ được thể hiên đồ thị hình 3.1 và bảng 3.1, 3.2, 3.3 (phụ lục II) như sau:
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ở các liều chiếu xạ khác nhau
Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) theo phương pháp chiếu xạ ở mức khá đối với phân đoạn A, còn phân đoạn B và C thấp, hiệu suất thu hồi tăng khi liều xạ tăng. Cụ thể, hiệu suất thu hồi mẫu chitin chiếu xạ 200 kGy của 3 phân đoạn A, B, C lần lượt là 51,38; 4,78; 0,3%; mẫu 350 kGy là 58,85; 6,31; 0,38%; mẫu 400 kGy là 60,84; 7,31; 0,41%.
Liều lượng chiếu xạ càng cao chitin bị cắt mạch càng nhiều hiệu suất thu hồi càng tăng nhưng khi liều xạ tăng đến 400 kGy thì hiệu suất thu hồi cũng không tăng nhiều.
Sở dĩ có hiện tượng trên là do khi cắt mạch bằng tia bức xạ thì chitin bị cắt mạch một cách ngẫu nhiên tạo thành những đoạn phân tử ngắn mạch khác nhau tùy vào từng liều xạ dẫn tới độ hòa tan khác nhau. Liều xạ càng cao hiệu suất cắt mạch chitin càng cao, chitin bị cắt mạch càng mạnh mẽ, tạo những đoạn phân tử ngắn mạch hơn (phân tử lượng thấp hơn) hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin tăng. Tuy nhiên, nếu liều xạ cao quá sẽ làm cháy chitin, chính vì vậy, hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin càng giảm khi liều chiếu xạ tăng.
Trong quá trình cắt mạch, các gốc tự do được tạo ra không liên kết với nhau do những khó khăn về mặt không gian, ngoài ra do sự hiện diện của nguyên tử cacbon với 4 mối liên kết, cũng cản trở sự di chuyển hóa học dọc theo mạch polymer.
Kết luận: Hiệu suất thu hồi lần lượt 3 phân đoạn oligochitin cao nhất theo phương pháp chiếu xạ là 60,84; 7,31; 0,41% (mẫu chiếu xạ 400 kGy).
3.2. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme
Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme được thể hiên đồ thị hình 3.2 và bảng 3.4, 3.5, 3.6 (phụ lục II) như sau:
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lương thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với enzyme
Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.2 cho thấy hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin ở mức khá cao, hiệu suất thu hồi ở phân đoạn A cao nhất là 75,1%; phân đoạn B và C giảm dần lần lượt là 25,86; 18,81%.
Hiệu suất thu hồi các phân đoạn cao hơn phương pháp chiếu xạ là vì quá trình chiếu xạ tăng cường hoạt tính các enzyme phân cắt chitin. Các liều xạ ngoài tác dụng phân cắt sơ lược phân tử chitin thì có lẽ đã bẻ gãy cấu trúc xoắn cuộn, làm lộ ra nhiều hơn các vị trí nhận biết (liên kết 1,4-glucozit) và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân cắt của các enzyme nên hiệu suất thu hồi oligochitin khá cao. Qua quá trình tách chiết từng phân đoạn hiệu suất thu hồi càng thấp do các phân