Thu nhận cao chiết từ nấm linh chi đỏ (ganoderma lucidum) bằng kỹ thuật co2 siêu tới hạn và đánh giá hoạt tính sinh học

1.GIA TP.HCM ĐẠI HỌC QUỐC TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o - NGUYỄN THỊ VÂN ANH THU NHẬN CAO CHIẾT TỪ NẤM LINH CHI ĐỎ (Ganoderma lucidum) BẰNG KỸ THUẬT CO2 SIÊU TỚI HẠN VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC (Supercritical fluid extraction of Ganoderma lucidum to obtain extracts and bioactivity evaluation) Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã số: 60520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 01 năm 2021 HVTH: NGUYỄN THỊ VÂN ANH Cơng trình hồn thành tại: Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu Cán chấm nhận xét 1: TS Huỳnh Ngọc Oanh Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Quốc Thắng Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM, tháng 01 năm 2021 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: PGS.TS Lê Thị Thuỷ Tiên - Chủ tịch TS Huỳnh Ngọc Oanh - Ủy viên phản biện TS Nguyễn Quốc Thắng - Ủy viên phản biện TS Nguyễn Huỳnh Bạch Sơn Long - Ủy viên TS Đặng Bảo Trung - Thư ký Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (Họ tên chữ ký) TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC (Họ tên chữ ký) ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Nguyễn Thị Vân Anh MSHV: 1770003 Ngày, tháng, năm sinh: 12/06/1994 Nơi sinh: Hưng Yên Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 60520301 I TÊN ĐỀ TÀI Tên tiếng Việt: Thu nhận cao chiết từ nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) kỹ thuật CO2 siêu tới hạn đánh giá hoạt tính sinh học Tên tiếng Anh: Supercritical fluid extraction from Ganoderma lucidum to obtain extracts and bioactivity evaluation II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 2.1 Tổng quan: Nấm linh chi, triterpenoid, hoạt tính nấm linh chi, kỹ thuật CO2 siêu tới hạn, phương pháp định lượng axit ursolic, phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích quy hoạch thực nghiệm 2.2 Thực nghiệm  Trích ly triterpenoid (axit ursolic) từ nấm linh chi kỹ thuật CO2 siêu tới hạn  Khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly đến hàm lượng axit ursolic bao gồm: Áp suất, tỷ lệ etanol, thời gian nhiệt độ  Khảo sát ảnh hưởng đồng thời ba điều kiện áp suất, thời gian nhiệt độ đến hàm lượng axit ursolic quy hoạch thực nghiệm theo mô hình Box-Behnken  Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố, kháng ung thư, kháng khuẩn kháng tiểu đường cao chiết III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 09/2020 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 01/2021 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS HOÀNG MINH NAM PGS TS NGUYỄN HỮU HIẾU TP HCM, ngày tháng năm 2021 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Trưởng PTN TĐ ĐHQG TP.HCM CNHH & DK TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tác giả xin trân trọng cảm ơn đến người thân gia đình ln quan tâm, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt thời gian thực luận văn Tác giả xin chân thành cảm ơn thầy TS Hoàng Minh Nam thầy PGS.TS Nguyễn Hữu Hiếu tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả suốt trình học tập thực luận văn Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến học viên, nghiên cứu viên bạn sinh viên Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM Cơng nghệ Hóa học & Dầu khí (KEY CEPP LAb), Trường Đại Học Bách Khoa - ĐHQG TP.HCM hỗ trợ tác giả suốt trình học tập nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Vân Anh i TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong luận văn này, triterpenoid (axit ursolic) trích ly từ nấm linh chi đỏ Việt Nam kỹ thuật CO2 siêu tới hạn Hàm lượng axit ursolic cao trích xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Thành phần dinh dưỡng kim loại có nấm linh chi khảo sát cho thấy nấm linh chi có hàm lượng lipit, protein cacbohydrate cao Ngồi ra, nấm chứa nguyên tố vi lượng đa lượng Cu, Fe, Zn Mg, bên cạnh kim loại nặng Pb, Ni, Hg Cd nằm giới hạn cho phép Ảnh hưởng điều kiện trích ly áp suất, tỷ lệ etanol, nhiệt độ thời gian đến hàm lượng axit ursolic khảo sát phương pháp luân phiên biến để tìm khoảng biến thiên phù hợp Sau đó, tiến hành khảo sát đồng thời quy hoạch thí nghiệm với ba điều kiện áp suất, tỷ lệ etanol nhiệt độ sử dụng mơ hình BoxBehnken Số liệu xử lý phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly cho hàm lượng axit ursolic cao Đồng thời phương pháp trích ly nước nóng siêu âm thực để đối chứng Cao trích điều kiện tối ưu khảo sát hoạt tính sinh học thơng qua khả kháng oxy hóa sử dụng phương pháp bắt gốc tự 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl (DPPH) lực khử sắt với đối chứng dương axit ascorbic; kháng ung thư bốn dòng tế bào ung thư dòng tế bào ung thư biểu mô (KB), ung thư phổi (Lu1), ung thư gan (Hep-G2) ung thư vú (MCF-7) phương pháp tetrazolium (MTT assay); khả kháng khuẩn cao chiết thử nghiệm vi khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum, Salmonella enterica, Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa phương pháp xác định IC50; kháng tiểu đường phương pháp ức chế enzym α-glucosidase ii ABSTRACT In this thesis, triterpenoid (ursolic acid) was extracted from Vietnamese red Ganoderma by supercritical CO2 technique The ursolic acid content in the extract was determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) The nutritional and metallic composition in Ganoderma lucidum has been investigated, showing that it has a high content of lipids, proteins, and carbohydrates In addition, the fungus also contains trace elements and macronutrients such as Cu, Fe, Zn, and Mg, besides, heavy metals such as Pb, Ni, Hg, and Cd are within the allowable limits The effects of each extraction factors including pressure, ethanol concentration, temperature, and time on ursolic acid content were investigated by the single-factor experiment o choose the impact range After that, three factors were simultaneously investigated: pressure, ethanol concentration, and temperature using Box-Behnken model Data were analyzed by Design Expert 11.0 software to find optimal extraction conditions for the highest ursolic acid content At the same time, hot water extraction and ultrasonic extraction were also carried out for the control samples The as-prepared extract with optimal route condition was investigated the biological activity via the Radical Scavenging capacity with 1,1–diphenyl–1–picrylhydrazyl (DPPH) and ferric reducing ability with Ascorbic acid as a positive control; cytotoxicity with KB, Lu1, Hep-G2, and MCF-7 cell line by MTT assay; Antibacterial performance was studied against Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Lactobacillus fermentum, Salmonella enterica, Escherichia coli, and Pseudomonas aeruginosa by IC50; and antidiabetic activity by α-glucosidase enzyme inhibition method iii LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu thực cá nhân tác giả thực hướng dẫn hai thầy TS Hoàng Minh Nam PGS TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG HCM Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (KEY CEPP LAB), Trường Đại học Bách Khoa - ĐHQG TP HCM Các số liệu, kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực, chưa cơng bố cơng trình khác trước Mọi giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Tác giả Nguyễn Thị Vân Anh iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii ABSTRACT iii LỜI CAM ĐOAN iv MỤC LỤC v DANH MỤC HÌNH xviii DANH MỤC BẢNG xix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT xx ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm linh chi 1.1.1 Giới thiệu chung nấm linh chi 1.1.2 Thành phần hoá học 1.1.2.1 Polysaccharide 1.1.2.2 Saponin 1.1.2.3 Triterpenoid 1.2 Hoạt tính sinh học triterpenoid 1.2.1 Kháng oxy hoá 1.2.2 Kháng ung thư 1.2.3 Kháng khuẩn 1.2.4 Kháng tiểu đường 10 1.3 Các phương pháp trích ly hoạt chất nấm linh chi 11 1.3.1 Phương pháp trích Soxhlet 11 1.3.2 Phương pháp siêu âm 12 1.3.3 Phương pháp vi sóng 13 1.3.4 Phương pháp enzym 14 1.3.5 Phương pháp trích ly lưu chất siêu tới hạn 15 1.3.5.1 Trạng thái siêu tới hạn lưu chất 15 1.3.5.2 Tính chất lưu chất siêu tới hạn 16 1.3.5.3 Trích ly dùng CO2 siêu tới hạn 16 v 1.3.5.4 Phân loại 17 1.3.5.5 Hệ thống trích ly CO2 siêu tới hạn 18 1.3.6 Tình hình nghiên cứu nước 20 1.3.7 Tình hình nghiên cứu giới 21 1.3.8 Tính cấp thiết 21 1.4 Mục tiêu, nội dung, phương pháp nghiên cứu, tính đóng góp luận văn 22 1.4.1 Mục tiêu 22 1.4.2 Nội dung 22 1.4.3 Phương pháp nghiên cứu 22 1.4.3.1 Xác định thành phần hố học có nấm linh chi 22 1.4.3.2 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly đến hàm lượng axit ursolic 25 1.4.3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích 31 1.4.4 Tính luận văn 34 1.4.5 Đóng góp luận văn 34 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 36 2.1 Hoá chất, dụng cụ, thiết bị địa điểm thực 36 2.1.1 Hóa chất 36 2.1.2 Thiết bị 36 2.1.3 Địa điểm thực luận văn 39 2.2 Thí nghiệm 39 2.2.1 Xác định thành phần nguyên liệu nấm linh chi ban đầu 39 2.2.1.1 Xác định độ ẩm nguyên liệu 39 2.2.1.2 Xác định độ tro 39 2.2.1.3 Xác định hàm lượng nitơ tổng 39 2.2.1.4 Xác định hàm lượng lipit 40 2.2.1.5 Xác định hàm lượng cacbohydrate 40 2.2.1.6 Xác định hàm lượng kim loại 41 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hàm lượng triterpenoid (axit ursolic) 43 vi 2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng yếu tố 43 2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố đến hàm lượng triterpenoid 46 2.2.2.3 Xác định thành phần dễ bay có cao trích 47 2.2.2.4 Định lượng axit ursolic 47 2.2.3 Phân tích nhóm chức cao trích 48 2.2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích 48 2.2.4.1 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hố 48 2.2.4.2 Ức chế tế bào ung thư 48 2.2.4.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 49 2.2.4.4 Kháng tiểu đường 50 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51 3.1 Thành phần hoá học nấm linh chi 51 3.2 Ảnh hưởng điều kiện trích ly đến hàm luợng axit ursolic 52 3.2.1 Ảnh hưởng điều kiện 52 3.2.1.1 Áp suất 52 3.2.1.2 Tỷ lệ etanol 54 3.2.1.3 Thời gian 54 3.2.1.4 Nhiệt độ 55 3.2.2 Ảnh hưởng đồng thời yếu tố 56 3.2.2.1 Ảnh hưởng thời gian áp suất 59 3.2.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ áp suất 60 3.2.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian trích ly 62 3.2.2.4 Kiểm chứng mơ hình 62 3.2.2.5 Phân tích thành phần dễ bay có cao chiết 64 3.2.2.6 Phân tích nhóm chức cao trích 65 3.3 Hoạt tính sinh học cao trích 67 3.3.1 Hoạt tính kháng oxy hố 67 3.3.1.1 Khả bắt gốc tự DPPH 67 3.3.1.2 Năng lực khử sắt 68 3.3.2 Hoạt tính ức chế tế bào ung thư 69 3.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn 70 vii PL 1.6 Số liệu xác định hàm lượng kim loại Phụ lục 2: Số liệu khảo sát điều kiện trích ly PL2.1 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện PL2.1.1 Ảnh hưởng áp suất Bảng 2.1.1 Số liệu khảo sát ảnh hưởng áp suất Khối lượng cân Áp suất Diện Diện Diện tích tích tích pick pick pick Trung bình mg/L Vdm Hàm Sai lượng số 4,0004 250 802,4 803 802,38 802,59 10,25 25 0,064 0,35 4,0203 300 893,7 895 893,69 894,13 61,36 25 0,381 0,75 4,0291 350 924,94 925 923,98 924,64 78,40 25 0,486 0,56 4,0014 400 1078,9 1076 1075,81 1076,90 163,43 25 1,021 1,72 4,0032 450 803 804 801,96 802,98 10,47 25 0,065 1,01 4,0062 500 785 784 784,26 784,42 0,10 25 0,0006 0,51 PL2.1.2 Ảnh hưởng tỷ lệ etanol Bảng 2.1.1 Số liệu khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ etanol Khối Diện Diện Diện tích tích tích EtOH pick pick pick 4,0204 790,1 789,5 4,0243 10 1079,5 1074,7 1073,6 1075,9 lượng cân Tỷ lệ Trung bình 789,6 789,7 mg/L Vdm Hàm lượng Sai số 3,07 25 0,02 0,32 162,9 25 1,01 3,10 4,1291 15 1270 1268 1269,8 1269,2 270,8 25 1,64 1,10 4,0084 20 1248 1249 1248,4 1248,4 259,2 25 1,62 0,50 4,0932 25 821 821,2 821,96 821,39 20,75 25 0,13 0,51 4,0082 30 800,3 803,4 801,6 801,77 9,79 25 0,06 1,56 PL2.1.3 Ảnh hưởng thời gian Bảng 2.1.1 Số liệu khảo sát ảnh hưởng thời gian Khối lượng cân Thời gian Diện Diện Diện tích tích pick tích pick pick Trung bình mg/L Vdm Hàm lượng Sai số 4,0024 0,5 952 950 949 950,3 92,8 25 0,58 1,53 4,0243 987 985 970 980,7 109,7 25 0,68 9,29 4,0291 1,5 1514,8 1515 1512,2 1514 407,5 25 2,53 1,56 4,0089 1075 1077 1075,8 1075,9 162,9 25 1,02 1,01 4,0972 2,5 820 823 821,9 821,7 20,9 25 0,13 1,52 4,0022 795 800,9 794,2 796,7 7,0 25 0,04 3,64 PL2.1.4 Ảnh hưởng nhiệt độ Bảng 2.1.1 Số liệu khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Khối lượng cân Nhiệt độ Diện Diện Diện tích tích pick tích pick pick Trung bình mg/L Vdm Hàm lượng Sai số 4,0204 35 900 899 898,3 899,1 64,1 25 0,399 0,876 4,0243 40 909 910 908,4 909,1 69,7 25 0,433 0,811 4,1291 45 1096 1095 1093,9 1095 173,5 25 1,051 1,046 4,0084 50 1376 1374 1375,8 1375,3 330 25 2,058 1,093 4,0932 55 1220 1222 1221,1 1221 243,9 25 1,490 1,001 4,0082 60 886,8 885 884,3 885,4 56,5 25 0,352 1,304 PL2.2 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời điều kiện PL 2.2.1 Kết thiết kế thí nghiệm theo phần mềm Design Expert 11 Hình PL 2.2.1: Bố trí thí nghiệm PL 2.2.2 Kết phân tích ANOVA Hình PL 2.2.2: Kết phân tích ANOVA PL 2.2.3 Phương trình hồi quy từ mơ hình Hình PL 2.2.3 Phương trình hồi quy PL 2.2.4 Điều kiện tối ưu từ mô hình Hình PL 2.2.4 Điều kiện tối ưu dự đốn PL 2.2.5 Số liệu xây dựng đường chuẩn axit ursolic Bảng 2.2.5 Số liệu xây dựng đường chuẩn axit ursolic STT Nồng độ Diện tích pick 10 20 40 60 80 100 788 800,1 820 855,8 895 924 970 10 150 200 250 Hình PL 2.2.5: Đường chuẩn axit ursolic 1060 1143 1225 PL 2.2.5 Số liệu phân tích thành phần dễ bay cao chiết GC-MS Phụ lục 3: Phổ FTIR Hình PL 3.1: Phổ FTIR axit ganoderic A Hình PL 3.2: Phổ FTIR axit ursolic Hình PL 3.3: Phổ FTIR cao chiết Phụ lục 4: Số liệu thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích PL4.1: Số liệu thử nghiệm khả bắt gốc tự DPPH PL4.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự DPPH axit ascorbic Nồng độ (µg/mL) Phần trăm bắt gốc tự DPPH 50 93,95 25 50,30 12,5 27,02 6,25 15,01 3,13 8,38 1,56 4,31 PL3.1.1 Số liệu khả bắt gốc tự DPPH cao chiết Nồng độ (µg/mL) Phần trăm bắt gốc tự DPPH 96,5 2,52 193 25,64 289,6 45,83 386,1 70,98 482,6 95,56 PL4.2: Số liệu thử nghiệm lực khử sắt PL3.1.1 Số liệu lực khử axit ascorbic Nồng độ (µg/mL) Phần trăm bắt gốc tự ABTS 50 0,2475 100 0,4246 150 0,46983 200 0,59418 300 0,76545 400 0,98942 PL 3.1.2 Số liệu lực khử cao chiết Nồng độ (µg/mL) Phần trăm bắt gốc tự ABTS 952,2 0,03949 1930,4 0,13363 2805,6 0,2587 3860,8 0,32781 4826 0,39951 9652 0,93241 PL 4.3: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng ung thư PL 4.4: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn PL 4.5: Kết thử nghiệm hoạt tính kháng tiểu đường PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN THỊ VÂN ANH Ngày, tháng, năm sinh: 12/06/1994 Nơi sinh: Hải Hưng – Hưng Yên Địa liên lạc: 105/522 KP4 P Tân Mai, TP Biên Hòa, Tỉnh Đồng Nai Số điện thoại: 0975 326 072 Email: vananh12061994@gmail.com QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO  08/2012-04/2017: Kỹ thuật hóa vơ cơ, Khoa Kỹ Thuật hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM  5/2017-nay: Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM QUÁ TRÌNH CƠNG TÁC  2017-2018: On the job trainee, Technical Dept., Quartest  2019-nay: Chemical Engineer, Lab Dept., Taekwang Vina ... Chuyên ngành: Kỹ thu? ??t Hóa học Mã số: 60520301 I TÊN ĐỀ TÀI Tên tiếng Việt: Thu nhận cao chi? ??t từ nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) kỹ thu? ??t CO2 siêu tới hạn đánh giá hoạt tính sinh học Tên tiếng... tách thành phần hoạt tính từ thu? ??c quý Vì vậy, đề tài thực với tiêu đề ? ?Thu nhận cao chi? ??t từ nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) kỹ thu? ??t CO2 siêu tới hạn đánh giá hoạt tính sinh học? ?? CHƯƠNG 1:... đề tài ? ?Thu nhận cao chi? ??t từ nấm linh chi đỏ (Ganoderma lucidum) kỹ thu? ??t CO2 siêu tới hạn đánh giá hoạt tính sinh học? ?? hướng nghiên cứu tương đối Việt Nam vừa có tính ứng dụng hiệu cao 21 vừa