Nghiên cứu phản ứng thủy phân các glycozit tự nhiên bằng enzym b glucosidase và đánh giá hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận được tóm tắt luận án tiếng việt

BGL có thể tác động lên nhiều cơ chất khác nhau, trong đó thủy phân liên kết glycosid ở các hợp chất tự nhiên, giải phóng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, dễ hấp thụ là một lĩnh v

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ -

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Lê Trường Giang

Người hướng dẫn khoa học 2: TS Đoàn Duy Tiên

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1 Lê Thị Tú Anh, Đoàn Duy Tiên, Bá Thị Châm, Nguyễn Văn Tuyến,

Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật thủy phân glycosit thành aglycon có hoạt tính sinh học cao Tạp chí Hóa học, 2016 , 54 (6e2):

84-89

2 Lê Thị Tú Anh, Bá Thị Châm, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Thanh Trà,

Nguyên Văn Tuyến, Nghiên cứu thủy phân astilbin trong rễ Thổ phục linh (Similax glabra) bằng vi sinh vật, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (6e2):

223-227

3 Nguyễn Thị Thu Hà, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thanh Trà, Bá Thị

Châm, Lê Thị Tú Anh, Đặng Thị Tuyết Anh, Nguyễn Hà Thanh,

Thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym khử HMG-Coenzym A của vỏ đậu xanh (Vigna radiata), Tạp chí hóa học 2017, 55 (4e23), 21-

26

4 Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Trà, Bá Thị Châm, Lê Thị Tú

Anh, Đặng Thị Tuyết Anh, Nguyễn Hà Thanh, Thành phần hóa học và

hoạt tính ức chế enzym khử HMG-Coenzym A của lá Sen hồng (Nelumbo nucifera), Tạp chí hóa học 2017, 55 (4e23), 261-266

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của luận án

Hiện nay, vấn đề bảo vệ môi trường đã trở nên cấp thiết với mọi lĩnh vực của cuộc sống Trong lĩnh vực hóa học, tìm kiếm những enzym xúc tác, hỗ trợ cho các quá trình chuyển hóa, tổng hợp hữu cơ được coi là hướng phát triển xanh thân thiện môi trường Nhờ những ưu điểm vượt trội so với xúc tác thông thường, xúc tác enzym không chỉ giúp tăng hiệu suất phản ứng mà còn góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường

β-Glucosidase (BGL) thuộc nhóm enzym có khả năng thủy phân liên kết glycosid trong các hợp chất carbohydrat BGL có thể tác động lên nhiều cơ chất khác nhau, trong đó thủy phân liên kết glycosid ở các hợp chất tự nhiên, giải phóng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, dễ hấp thụ là một lĩnh vực đang được quan tâm nghiên cứu, đem lại nhiều kết quả hứa hẹn

Flavonoit là một trong những nhóm hợp chất phong phú, đa dạng, được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y dược học, thực phẩm, mỹ phẩm Flavonoit tồn tại

ở hai dạng là dạng tự do (aglycon) và liên kết với các phân tử đường (glycozit) Trong đó, dạng aglycon có hoạt tính sinh học cao và dễ hấp thụ vào cơ thể, dạng glycosid chiếm tỉ lệ lớn tuy nhiên khó hấp thụ và có hoạt tính thấp Do đó việc phát triển các xúc tác sinh học thủy phân glucozit tạo aglycon và nghiên cứu hoạt tính của các cặp chất này có ý nghĩa hết sức quan trọng và có tính ứng dụng cao

Quá trình nghiên cứu, phát triển xúc tác enzym không tránh khỏi việc nuôi cấy vi sinh vật (VSV) Những vi sinh vật này khi được thải ra môi trường có thể tạo

ra những ảnh hưởng không tốt, do đó để đảm bảo một quy trình nghiên cứu thân thiện với môi trường, việc xử lý và khử trùng những vi sinh vật này trước khi loại bỏ cũng hết sức cần thiết

Nhằm mục đích nghiên cứu, tìm kiếm những glycozit, aglycon thực vật có hoạt tính sinh học, có tiềm năng ứng dụng trong thực tiễn đồng thời phát triển phương pháp nghiên cứu mới – sinh chuyển hóa bằng xúc tác sinh học, chúng tôi

lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phản ứng thủy phân các glycozit tự nhiên bằng enzym β-glucosidase và đánh giá hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận được” Trong nghiên cứu này, chủng vi nấm P.citrinum được phân lập từ rễ cây

Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz), định danh và sinh tổng hợp enzyme

β-glucosidase Các flavonoit glycozit tách chiết từ thực vật Việt Nam được thủy phân bởi enzym β-glucosidase từ vi nấm Các flavonoit và sản phẩm chuyển hóa

tương ứng được đánh giá hoạt tính sinh học Vi nấm sau quá trình lên men được nghiên cứu khử trùng bằng công nghệ oxy hóa tiên tiến thân thiện với môi trường

2 Mục tiêu nghiên cứu của luận án

Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym vào quá trình thủy phân các hợp chất glycozit thực vật, tạo nên các sản phẩm có hoạt tính cao hơn đồng thời phát triển hướng nghiên cứu xanh trong hóa hữu cơ

3 Các nội dung nghiên cứu chính của luận án

- Phân lập, định danh chủng vi sinh vật có khả năng sinh β-glucosidase

- Lên men sinh tổng hợp, đánh giá các thông số động học của β-glucosidase

dạng tự do và cố định từ P Citrinum

- Nghiên cứu khử trùng sau lên men bằng phương pháp oxy hóa tiên tiến

- Nghiên cứu tách chiết các hợp chất glycozit từ thực vật Việt Nam

- Nghiên cứu thủy phân các hợp chất glycozit từ thực vật với enzym glucosidase

β Đánh giá hoạt tính sinh học các hoạt chất thu được

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Enzym β-D-glucosidlase

Trình bày những nội dung liên quan đến β-glucosidase: những nội dung

cơ sở liên quan đến định nghĩa, phân loại, cơ chế phản ứng, cách tinh chế và đánh giá hoạt tính enzym Tiếp đó, những nội dung về đa dạng và khả năng sinh tổng hợp các β-glucosidase ở các VSV, về cải tạo nguồn giống với mục đích tăng sản xuất BGL và liên quan đến sản xuất BGL thương mại Cuối cùng, về

những ứng dụng đa ngành của β-glucosidase

1.2 Hợp chất flavonoit

Trình bày những nội dung liên quan đến flavonoit: khung cơ sở, sự phân loại các nhóm, sinh tổng hợp, phương pháp nhận biết bằng các thuốc thử và hoạt tính sinh học của nhóm chất

1.3 Flavonoit glycozit và aglycon của chúng

Trình bày những nội dung liên quan đến hấp thu, chuyển hóa của flavonoit glycozit từ đó cho thấy tiềm năng của các aglycon so với glycozit của chúng Tiếp theo là tổng quan về các nghiên cứu sinh chuyển hóa flavonoit glycozit đã công bố trên thế giới

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu

Mẫu bã đậu nành (Glycine max) từ Công ty cổ phần dầu thực vật Quang Minh, Kim Động, Hưng Yên Mẫu lá sen (Nelumbo nucifera) và vỏ đậu xanh (Vigna

radiata) thu tại Hà Nội và Bắc Giang Mẫu hoa hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott) thu tại Nam Định Mẫu Cốt khí củ (Rhizoma P olygoni

Hưng Yên

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập, định danh và lưu vi sinh vật sinh enzym

2.3.1.1 Phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết:

2.3.1.2 Phương pháp định danh: đại thể, vi thể, định danh chủng nấm phân lập

bằng PCR và giải trình tự

2.3.2 Phương pháp xác định họat độ enzym: đánh giá khả năng thủy phân

p-nitrophenyl-β-glucopyranosid (pNPG)

2.3.3 Phương pháp cô lập và xác định cấu trúc các hợp chất glycozit: sắc ký

cột và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân

2.3.4 Các phương pháp thủy phân: với enzym tự do và enzym cố định

- Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thủy phân

- Xử lý số liệu thí nghiệm và tối ưu hóa thực nghiệm

2.3.5 Phương pháp khử trùng vi sinh vật nghiên cứu

2.3.6 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học

- Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa trên hệ DPPH

- Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase

- Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym Angiotensin I

2.3.7 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu cho quá trình thủy phân

Tối ưu hóa bằng pp qui hoạch thực nghiệm với phần mềm Modde 5.0

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu phân lập chủng nấm sinh enzym β-glucosidase

3.1.1 Phân lập chủng sinh enzym β-glucosidase

Từ mẫu rễ cây Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz), tiến hành phân

lập các chủng nấm mốc thuần chủng có khả năng sinh β-glucosidase Chủng nấm mốc có khả năng sinh enzym β-glucosidase với hoạt tính cao nhất sẽ được định danh và sử dụng xuyên suốt nghiên cứu

3.1.2 Định danh chủng vi nấm phân lập

Phương pháp vi thể, đại thể, PCR và giải trình tự gen

3.2 Nghiên cứu phân lập và các thông số động học β-glucosidase

Lên men với môi trường Pd, sử dụng phương pháp muối tách với bằng (NH4)2SO4, rửa muối bằng cột Sephadex và đông khô thu enzym sạch

Hằng số phân ly biểu kiến Km và Vmax của glucosidase trên cơ chất

β-pNG với nồng độ β-β-pNG trong khoảng 0.05mM đến 2.0mM, phản ứng diễn ra

trong 10 phút ở 60oC và đo ở bước sóng 410nm BGL-P còn được nghiên cứu

cố định trên calci alginat và bã cà phê Hiệu suất cố định enzym (%) tính theo

công thức:

Hiệu suất cố định (%) =(Et- Es)/Et x100

Et là hoạt độ enzym trước cố định, Es là hoạt độ enzym sau cố định

3.3 Nghiên cứu phân lập các glycozit trong một số thực vật Việt Nam

3.3.1 Phân lập các glycozit và aglycon từ khô đậu tương

200g khô đậu tương

- EtOH: H2O (80:20)

- Cô loại dung môi

Cao lỏng màu nâu

- Cô kiệt dung môi

- Cột silica gel: EtOAc:H2O (97:3) và EtOAc:H2O:EtOH (95:3:2)

Kết tinh CH2Cl2

3.3.2 Phân lập các glycozit và aglycon từ lá Sen

3.3.3 Phân lập các glycozit từ vỏ đậu xanh

3.3.4 Phân lập rutin từ hoa Hòe

Đặc điểm của hợp chất phân lập được: Nhiệt độ nóng chảy: 242oC

1H NMR (500 MHz, DMSO-d 6): =0,99 ppm (3H, d, J= 6,5Hz, HRha-6’’’); 3,09-

5,00 (các proton CH-OH của đường); 5,2 (1H, brs, HRha-1’’’); 5,34 (1H, d, J=

7,0 Hz, HGlc-1’’); 6,19 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6); 6,38 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-8);

6,84 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-5’); 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’); 7,55 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-6’); 12,58 (1H, s, OH-5)

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6):  156,5 (C-2); 133,3 (C-3); 177,4 (C-4); 161,2 (C-5); 100,1 (C-6); 164,1 (C-7); 93,6 (C-8); 156,4 (C-9); 103,9 (C-10); 121,1 (C-1’); 115,2 (C-2’); 144,7 (C-3’); 148,4 (C-4’); 116,2 (C-5’); 121,5(C-6’); 101,2 (CGlc-1’’); 74,1 (CGlc-2’’); 76,4 (CGlc-3’’); 70,3 (CGlc-4’’); 75,8 (CGlc-5’’); 66,9 (CGlc-6’’); 98,7 (CRha-1’’’); 70,5 (CRha-2’’’); 71,3(CRha-3’’’); 71,8 (CRha-4’’’); 68,2 (CRha-5’’’); 18,6 (CRha-6’’’)

3.3.5 Phân lập các glycoszit và aglycon từ củ Cốt khí

- CH 2 Cl 2

7-2 7-3 7-4 7-5 7-1

- Cô, kết tinh

C7.3 (155mg)

- SKC Silicagel 0,04 ÷ 0,063

3.4 Sinh chuyển hóa các hợp chất glycozit

Hiệu suất thủy phân được tính theo công thức [140]:

Trong đó:

Qc: là lượng sản phẩm thủy phân

Qo: lượng glucozit ban đầu đưa vào phản ứng

M1: khối lượng phân tử của glycozit

M2: khối lượng phân tử sản phẩm thủy phân

3.5 Khử trùng vi sinh vật nghiên cứu bằng phương pháp oxi hóa tiên tiến

3.5.1 Chuẩn bị thiết bị và mẫu vi sinh vật và phân tích mẫu điện phân

3.5.2 Thiết kế quy trình điện phân với bào tử B cereus

3.5.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ dòng điện đến khả năng diệt khuẩn

3.5.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH dung dịch đến khả năng diệt khuẩn

3.5.3 Nghiên cứu khả năng diệt khuẩn của thiết bị với P citrinum

3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học của các glycozit và sản phẩm thủy phân tương ứng

3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa trên hệ DPPH [117-119]

Thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp phụ của DPPH chưa phản ứng bằng máy Genios Tecan ở bước sóng 517 nm % bắt gốc tự do (scavenging capacity %) DPPH của mẫu thử được tính theo công thức:

SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%)

EC50 được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử, thí nghiệm được lặp lại với n = 3

3.6.2 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase [120-123]

Thí nghiệm được ủ ở nhiệt độ 37o C Phản ứng được dừng bằng 100 µl Na2CO3 Độ hấp thụ của phản ứng được xác định trên máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A) Khả năng ức chế enzyme - glucosidase của mẫu thử được xác định bằng công thức:

Độ ức chế (%) = [A(đối chứng âm) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng âm) x 100% IC50 - half maximal inhibitory concentration - nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động của -glucosidase, tính bằng phần mềm Tablecurve

3.6.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym ACE [124-126]:

Phản ứng ở nhiệt độ 37o C, pH 7,0, 30 phút Độ hấp thụ sau phản ứng được xác định trên máy BioTek với bước sóng 410 nm (A)

Phần trăm ức chế hoạt độ ACE của mẫu thử tính theo công thức:

% ức chế = (Ađối chứng dương - Amẫu thử)/(Ađối chứng dương – Ablank) Trong đó, mẫu đối chứng dương: không chứa chất thử; mẫu blank: cơ chất HHL được thay bằng đệm phản ứng Chất tham khảo: captopril

Giá trị IC50 (nồng độ của chất thử ức chế 50% hoạt độ của ACE trong điều kiện thí nghiệm) được tính theo phần mềm excel table curve

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả nghiên cứu phân lập chủng nấm sinh enzym β-glucosidase

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu thủy phân các hợp chất glycozit từ thực vật Flavonoit rất phổ biến ở thực vật với khoảng 15.000 hợp chất đã được xác định cấu trúc, phần lớn trong số đó đều là glycozit và rất nhiều hợp chất tồn tại ở dạng liên hết β-glycozit Do đó, nhóm nghiên cứu trước tiên tiến hành phân lập chủng vi sinh vật sinh enzym β-glucosidase

4.1.1 Kết quả phân lập chủng vi nấm sinh β-glucosidase và khả năng sinh enzym của chúng

Hình 4.1: Khuẩn lạc thu được từ mẫu rễ Bọ Mẩy ở nồng độ pha loãng 10-5

Từ các khuẩn lạc thu được, thực hiện cấy chuyển, tinh sạch, thu được 5 loài nấm mốc với đặc điểm hình thái khuẩn lạc khác nhau, ký hiệu C1-5 Nuôi cấy và xác định hoạt độ enzym từ các chủng nấm mốc theo các mốc thời gian 1-10 ngày, nhận thấy: chủng C5 sau 6 ngày nuôi cấy cho enzym có hoạt độ cao nhất là 33,628U/ml Kiểm tra khả năng sinh enzym của các chủng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau và khẳng định C5 có khả năng sinh enzym tốt nhất

4.1.2 Kết quả định danh chủng vi nấm phân lập

Bằng phương pháp quan sát hình thái, màu sắc khuẩn lạc và soi vi thể của bào tử và cấu tạo sợi nấm, C5 được xác định thuộc chi Penicillium Kết quả giải trình tự hai chiều DNA sản phẩm PCR bằng cặp mồi ITS1/ITS4 và

so sánh với dữ liệu gen trên NCBI bằng công cụ BLAST nucleotide đã chỉ ra

rằng trình tự DNA sản phẩm PCR của mẫu nấm phân lập là Penicillium citrinum (độ tương đồng trên cơ sở dữ liệu là 100%)

Hình 4.4: Khuẩn lạc, bào tử và sợi nấm C5

4.2 Kết quả nghiên cứu phân lập β-glucosidase từ dịch nuôi cấy và đánh giá các thông số động học của enzym

Qua các công đoạn loại bỏ protein tạp, muối tách, rửa trên cột và đông khô để thu enzym tinh sạch Hoạt độ của enzym tinh sạch tính trên khối lượng bột khô theo phương pháp soi màu ở bước sóng 410nm với cơ chất β-pNG thu được là 62,412U/mg (BGL-P) BGL-P được sử dụng ở dạng tự do hoặc cố định trên các chất mang calci alginat và bã cà phê

4.2.1 Kết quả nghiên cứu hoạt động của enzym tự do

Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH và nhiệt độ đến hoạt động của enzym tự do:

Enzym BGL-P có vùng hoạt động tốt trong khoảng nhiệt độ từ 50oC - 70

oC với hoạt tính đạt xấp xỉ 90% so với hoạt tính tối đa ở 60oC Tại nhiệt độ

60oC, enzym hoạt động tốt ở khoảng pH từ 5,0-6,5 với hoạt tính đạt trên 90%

so với hoạt tính tối đa ở pH 6,0

Kết quả nghiên cứu động học enzyme BGL-P trên cơ chất β-pNG :

Xây dựng đồ thị theo phương trình nghịch đảo (Lineaweaver và Burk 1934), thu được kết quả Km = 0,01µmol và Vmax = 13,91 µmol/phút

4.2.2 Kết quả nghiên cứu hoạt động của enzym cố định:

Kết quả cố định β-glucosidase trên alginat:

Hệ gel cố định với natri alginat 4% - CaCl2 4% được đánh giá có hiệu lực cố định tốt BGL-P (72,3%) và có khả năng tái sử dụng 7 lần với cơ chất pNPG trước khi mất 50% hoạt tính

Kết quả cố định β-glucosidase trên bã cà phê:

Bã cà phê Trung nguyên được hoạt hóa bằng glutaraldehyt được sử dụng làm chất mang BGL-P, đạt hiệu suất 82% Tuy nhiên, chỉ có thể tái sử dụng 2 lần với cơ chất pNPG trước khi mất 50% hoạt tính

Bảng 4.3 Thông số động học của enzym BGL-P tự do và cố định

* là hệ số R 2 của phương trình đồ thị Lineaweaver và Burk

4.2 Kết quả nghiên cứu phân lập các glycozit trong một số thực vật Việt Nam

Bằng các phương pháp phổ, 20 hợp chất phân lập từ 5 loài thực vật được xác định cấu trúc hóa học như sau: